王延宇，王鳳濤，郎曉威，馮 晶，旺 姆*，藺瑞明*

（1.西藏農(nóng)牧學(xué)院植物科學(xué)學(xué)院，西藏林芝860000；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193）

根據(jù)種子是否帶稃，大麥（Hordeum vulgareL.）分為有稃型皮大麥和無稃型裸大麥[1]，它是世界第四大禾谷類作物[2]，也是我國第四大禾谷類作物，主要用于飼料、釀造業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)原料和保健食品，少部分作為糧食。在青藏高原及其周邊地區(qū)，裸大麥（H.vulgareL.var.nudum）也被稱作青稞，它是該區(qū)域內(nèi)唯一廣泛栽培的主要糧食作物和重要飼草來源[3]。大麥栽培區(qū)域廣泛分布于全球溫帶地區(qū)，因而其病害種類多，主要病害有80 多種[1]，造成大麥平均減產(chǎn)15.0%～38.5%，其中白粉病是最重要的葉部病害之一，在世界各大麥種植區(qū)域均有分布，平均造成的產(chǎn)量損失為1%～14%[4]。大麥白粉病是由禾谷布氏白粉菌大麥?；停˙. graminisf. sp.hordei）引起的氣傳真菌病害，病原菌能在大麥整個(gè)生育期的任何階段侵染寄主植物地上部分的各個(gè)部位。白粉病主要發(fā)生在潮濕、半潮濕地區(qū)，感染白粉病的葉表面被菌絲覆蓋，嚴(yán)重影響了作物葉片的光合作用和蒸騰作用；另外，感病大麥葉片合成的養(yǎng)分流向被侵染部位，造成全株?duì)I養(yǎng)不良[1]。在英國，白粉病造成大麥減產(chǎn)6%～14%，但在美國平均產(chǎn)量損失不到1%，這主要與主栽品種的抗性水平和病原菌的毒性變異有關(guān)[4]。因此，在白粉病流行年份，品種抗病水平是決定產(chǎn)量損失的關(guān)鍵因素。大麥對(duì)白粉病的抗性主要由主效和微效抗病基因所控制[5-7]。目前已經(jīng)標(biāo)記定位了100 多個(gè)大麥抗白粉病基因，其中一些抗病基因如mlo具有持久廣譜的抗病特點(diǎn)，已經(jīng)在生產(chǎn)上廣泛利用[7]。大麥不同染色體上分布了22 個(gè)主效抗病基因位點(diǎn)，其中Mla、Mlra、Mlat、Mli、MRu2、Mlk、Mlnn、MlGa和Mlp定 位在1H 染色體上，MlLa和Mlhb定位在2H 染色體上，Mlg和MlBo定位在4H 染色體上，Mlj和Mlh定位在5H 染色體上，mlt和Mlf定位在7H 染色體上[7]。野生型感病Mlo基因通過突變產(chǎn)生一系列mlo隱性等位抗病基因。已獲得30 個(gè)Mlo突變等位基因[8]，其中只有mlo-11為自然突變基因，其余均為人工誘導(dǎo)突變。通過自然突變和有性雜交，病原菌B.graminisf.sp.hordeide群體中存在非常豐富的毒性變異，新致病類型不斷出現(xiàn)[9]。由于大麥白粉病抗源基因大規(guī)模多年單一化利用，加快了病原菌群體毒性變異速度，導(dǎo)致主栽品種中廣泛利用的具有小種?；缘目共』颉皢适А笨剐远?yōu)楦胁10]，縮短了優(yōu)良品種在生產(chǎn)上的使用周期，給抗病新品種選育造成極大的壓力。因而，發(fā)掘和利用抗病譜寬而且抗病性持久穩(wěn)定的基因尤為重要。在歐洲，大麥抗病育種中廣泛使用mlo-11基因，已經(jīng)有效控制了大麥白粉病的流行[11]。白粉病是我國東部和西南大麥主要種植區(qū)的主要葉部病害之一，特別是在浙江、江蘇和云南危害較重[7,12]。近年來，由于全球氣候變暖等因素影響，西藏自治區(qū)大麥白粉病流行區(qū)從南部林芝地區(qū)逐年向拉薩擴(kuò)展，為害呈明顯加重趨勢(shì)，已發(fā)展成為西藏青稞上主要的病害[13]。

相比于化學(xué)防治措施，培育和廣泛應(yīng)用抗白粉病大麥品種具有更經(jīng)濟(jì)安全和環(huán)保的特點(diǎn)，尤其在我國云南、西藏等生態(tài)條件較脆弱的高海拔地區(qū)，推廣應(yīng)用抗病品種尤為迫切[13-14]。因此，需要更加合理使用和布局現(xiàn)有抗病主栽品種。同時(shí)，針對(duì)不斷出現(xiàn)的新流行小種，需要從大麥種質(zhì)資源中篩選鑒定新抗源材料。這些基礎(chǔ)性研究對(duì)大麥品種的抗病改良和合理利用具有重要意義。本研究分析了4 個(gè)來自云南和4 個(gè)來自西藏的白粉菌菌株的毒性變異情況；選用毒性譜較寬的強(qiáng)毒性菌株16248-4 在苗期鑒定了300 個(gè)大麥品種對(duì)白粉病抗性水平；另外，利用白粉病常發(fā)流行區(qū)病原菌群體田間自然接種，在西藏林芝鑒定了大麥材料成株期對(duì)白粉病的抗性。篩選獲得的抗病種質(zhì)能為大麥抗白粉病育種和新抗源創(chuàng)制提供抗病基因。

表1 以大麥高感白粉病品種Pallas 為遺傳背景的抗白粉病近等基因品系

1 材料與方法

1.1 供試大麥品種（系）

用高感白粉病大麥品種花30 擴(kuò)繁供試菌株，以30 個(gè)高感白粉病大麥品種Pallas 為遺傳背景的抗病近等基因品系（表1）作為分析病原菌毒性譜變異的鑒別品種，以及300 份大麥品種（系）作為待鑒定的大麥品種資源材料（表2）。

續(xù)表

表2 300 份擬進(jìn)行抗白粉病鑒定的大麥品種（系）

續(xù)表

續(xù)表

1.2 供試大麥白粉菌株

將分離自西藏林芝地區(qū)19677、19681、19683和19688 菌株的單孢菌系和來自云南不同流行地區(qū)16248-4、16243-2、16420-1 和16204-1 菌株的單孢菌系進(jìn)行毒性譜聚類分析。選用強(qiáng)毒性菌株16248-4 進(jìn)行苗期抗病性接種鑒定；在西藏林芝地區(qū)利用流行病原菌群體以田間自然接種鑒定成株期抗病性。

1.3 大麥白粉菌毒性譜分析

1.3.1 大麥幼苗種植。將按1∶3 比例的營養(yǎng)土與地表土壤混合均勻后裝入規(guī)格為11.5 cm×11 cm×8 cm（口徑×高×底徑）的花盆中，用于播種培育高感白粉病大麥品種花30 幼苗，培養(yǎng)間溫度19～22℃，光照周期16 h（晝）/8 h（夜）。出苗7～8 d 后待第1 張葉完全展開時(shí)用于接種和擴(kuò)繁白粉菌菌系。其他大麥材料的培養(yǎng)條件與花30 的相同。

1.3.2 白粉菌培養(yǎng)。用掃接涂抹的方法將活體保存的大麥白粉菌菌株接種在第1 張葉完全展開的花30 幼苗上進(jìn)行擴(kuò)繁，接種后套上直徑11 cm、高20 cm 的玻璃罩，玻璃罩頂部覆蓋3 層紗布，并用橡皮筋扎緊。接種后潛育培養(yǎng)的環(huán)境條件與育苗條件相同。接種7～10 d 后，花30 葉片表面形成大量菌絲和分生孢子，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.3 毒性譜鑒定。利用1 套由30 個(gè)以Pallas 為遺傳背景的抗白粉病基因的近等基因品系作為鑒別品種，播種在規(guī)格為11.5 cm×11 cm×8 cm（口徑×高×底徑）的花盆中，每盆穴播5 個(gè)品種（系），按照逆時(shí)針方向順序點(diǎn)播，每穴播種1 個(gè)品種（系），每個(gè)品種（系）播7～8 粒種子，并插牌標(biāo)注每一盆的起始品種（系）序號(hào)，用漏網(wǎng)過濾的細(xì)土覆蓋種子。然后將播種好種子的種植盆放入事先加好水的托盤中進(jìn)行滲水處理。最后將充分吸水的花盆放在19～22℃溫室中光照培養(yǎng)7～8 d，待第1 張葉完全展開后用掃接涂抹的方法將花30 擴(kuò)繁的8 個(gè)菌株的單孢菌系接種到鑒別品系上進(jìn)行毒性譜分析。接種后幼苗在溫度16～18℃、光照周期16 h（晝）/8 h（夜）條件下潛育培養(yǎng)8 d，待感病對(duì)照品種花30 充分發(fā)病，接種葉片白粉病嚴(yán)重度達(dá)到80%～100%，按照0～4級(jí)標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查第2 張葉片的侵染型，每個(gè)鑒別品系調(diào)查5～8 株。

1.3.4 毒性譜聚類分析。根據(jù)單孢菌系在每個(gè)鑒別品系上的侵染型計(jì)算其平均值，同時(shí)按照公式（毒性頻率= 感病鑒別品系個(gè)數(shù)/ 鑒別品系總數(shù)×100%）統(tǒng)計(jì)各菌系的毒性頻率。平均侵染型0～2 級(jí)為抗病反應(yīng)，3～4 級(jí)為感病反應(yīng)。將抗病類型記為‘0’，感病類型記為‘1’。將表1 轉(zhuǎn)化為單孢菌系侵染型組成的二進(jìn)制矩陣，用群體遺傳結(jié)構(gòu)分析軟件PopGene32 對(duì)二進(jìn)制矩陣進(jìn)行分析，計(jì)算出來自不同地點(diǎn)的大麥白粉菌群體的毒性距離和毒性一致度，最后運(yùn)用群體遺傳結(jié)構(gòu)聚類分析軟件NTsys 對(duì)結(jié)果進(jìn)行聚類分析。

1.4 大麥品種抗白粉病鑒定

1.4.1 苗期抗白粉病鑒定。1）麥苗培養(yǎng)。鑒定材料的播種方法和培養(yǎng)條件與近等基因系的相同。播種后在19～22℃溫室中光照培養(yǎng)7～8 d 后，待第1張葉完全展開即可用于抗大麥白粉病的接種鑒定試驗(yàn)。2）接種方法。采用掃接的方法，用提前在感病品種花30 上擴(kuò)繁好的強(qiáng)毒性菌株16248-4 分生孢子的大麥葉片輕輕掃抹待鑒定的大麥品種幼苗。接菌后，用直徑10 cm 的玻璃罩套在種植盆上，并用紗布對(duì)罩子進(jìn)行封口。將接菌后的材料轉(zhuǎn)移至18℃溫室繼續(xù)培養(yǎng)，光照周期16 h（晝）/8 h（夜）。3）調(diào)查方法。苗期抗病性鑒定是以品種Pallas 作感病對(duì)照品種。接種約10 d 后，待Pallas 發(fā)病完全，嚴(yán)重度達(dá)到80%～100%，對(duì)待鑒定材料進(jìn)行侵染型調(diào)查并記錄，每個(gè)品種調(diào)查6～8 株。

1.4.2 成株期抗性鑒定。1）大麥種植。選取西藏自治區(qū)林芝市西藏農(nóng)牧學(xué)院歷年大麥白粉病發(fā)病最嚴(yán)重的地塊，行播311 個(gè)供試大麥品種，每行長2 m，每行1 個(gè)品種，播撒20～30 粒種子，每10 行種植1 行高感大麥白粉病品種花30，根據(jù)當(dāng)?shù)靥镩g管理要求進(jìn)行除草澆水等日常管理。最后僅獲得300份材料的調(diào)查數(shù)據(jù)（表2）。2）接種方法。西藏林芝市及周邊地區(qū)是重要的青稞白粉病流行區(qū)，利用自然菌源接種感病誘發(fā)型品種花30 和待鑒定品種。3）調(diào)查方法。成株期抗性鑒定以品種花30 為感病對(duì)照，在大麥至灌漿后期感病對(duì)照發(fā)病完全（侵染型＞3 型）時(shí)，依據(jù)國家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《大麥品種抗病性鑒定技術(shù)規(guī)程第2 部分：抗白粉病》（NY/T 3060.2—2016），對(duì)待鑒定的大麥材料進(jìn)行成株期白粉病侵染型分級(jí)鑒定，侵染型分級(jí)和抗性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)與苗期抗性鑒定相同，也采用0～4 級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 白粉菌毒性譜鑒定

利用30 個(gè)鑒別品種對(duì)8 個(gè)白粉菌菌株的毒性譜進(jìn)行分析，結(jié)果表明，毒性頻率介于13.3%～36.7%（表3），其中：4 個(gè)分離自西藏林芝地區(qū)的菌株19677、19681、19683 和19688，毒性頻率為13.3%～20.0%；而其他4 個(gè)來源于云南的菌株毒性頻率為23.3%～36.7%，說明其毒性譜范圍明顯較來自西藏林芝地區(qū)菌株的毒性譜寬。從中還發(fā)現(xiàn)部分抗病基因或基因組合如[Mla1,Mla(Al2)]、Mla22、Ml(Ru2)、Mlnn、MlLa、Mlh和MlLa已‘喪失’抗病功能，不能繼續(xù)利用。對(duì)來自于云南和西藏地區(qū)的8 個(gè)菌株毒性譜進(jìn)行聚類分析，比較2 個(gè)地區(qū)間白粉病菌群體致病表型之間的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)云南的3 個(gè)菌株16248-4、16420-1 和16243-2 在相似系數(shù)0.88 時(shí)聚為一組，西藏的4 個(gè)菌株在相似系數(shù)為0.943 時(shí)聚為一組，云南菌株16204-1 在相似系數(shù)為0.905 時(shí)與西藏菌株聚在同一組，其毒性譜更類似于西藏菌株（圖1）。因此，我國西南地區(qū)的2 個(gè)大麥白粉病主要流行區(qū)西藏林芝和云南的大麥白粉病菌群體的毒性譜存在較大的差異，但不排除兩地白粉菌群體之間也存在著交流。

表3 大麥白粉病菌8 個(gè)菌株對(duì)抗白粉病近等基因系鑒別品系的毒性譜分析

續(xù)表

圖1 大麥白粉菌8 個(gè)菌株的毒性譜聚類分析

2.2 大麥品種（系）抗白粉病鑒定

利用毒性譜比較寬的菌株16248-4 苗期接種鑒定300 個(gè)大麥品種（系）抗白粉病水平。其中103個(gè)品種（系）表現(xiàn)為高抗類型（侵染型為0～1+），28個(gè)品種（系）表現(xiàn)為中抗類型（侵染型2-～2+），146個(gè)品種（系）表現(xiàn)為中感類型（侵染型為3-～3+），23個(gè)品種（系）表現(xiàn)為高感類型（侵染型4）。在西藏林芝利用白粉菌自然菌源進(jìn)行成株期抗病鑒定，發(fā)現(xiàn)其中153 個(gè)品種（系）為高抗類型，63 個(gè)品種（系）表現(xiàn)為中抗類型，82 個(gè)品種（系）為中感類型，2 個(gè)品種（系）為感病類型。

結(jié)合苗期和成株期抗性鑒定結(jié)果（表4、圖2），在所鑒定分析的300 份材料中，92 個(gè)大麥品種（系）如法引一號(hào)、法引二號(hào)和貝菜勤斯等在苗期與成株期均表現(xiàn)為高抗白粉病，9 個(gè)大麥品種（系）如莆大麥9 號(hào)、昆侖15 號(hào)和保大麥14-J5 等在苗期與成株期均為中抗材料，上述101 個(gè)大麥品種（系）具有全生育期抗性特點(diǎn)；12 個(gè)品種（系）如駐大麥6 號(hào)、揚(yáng)飼麥1 號(hào)和揚(yáng)農(nóng)啤9 號(hào)等在苗期表現(xiàn)為抗病類型，但在成株期表現(xiàn)為感病反應(yīng)；97 個(gè)品種（系）如蒙古國草麥、西引2 號(hào)和青裸喜馬拉19 號(hào)等在苗期表現(xiàn)為感病類型，但在成株期卻表現(xiàn)為抗病，具有成株抗性特點(diǎn)；另外，還有72 個(gè)品種（系）在苗期和成株期均為感病類型。

表4 大麥品種（系）資源苗期和成株期白粉病侵染型與抗性表型評(píng)價(jià)

續(xù)表

續(xù)表

續(xù)表

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圖2 大麥品種（系）苗期和成株期抗白粉病類型鑒定

3 結(jié)論與討論

大麥白粉病是我國大麥生產(chǎn)上的重要?dú)鈧鞑『χ唬诙篼渽^(qū)包括浙江、江蘇、湖北、安徽、福建和春大麥區(qū)云南及西藏能造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[7,12]。特別是在云南、福建和浙江，白粉病為害尤為嚴(yán)重。近年來，由于受全球氣候變暖的影響，我國白粉病發(fā)生為害情況和主要流行分布區(qū)域發(fā)生了明顯變化，尤其是在青稞主產(chǎn)區(qū)西藏白粉病為害日益加重，流行區(qū)域從南部林芝地區(qū)向北逐步擴(kuò)展蔓延。目前，拉薩河流域也是白粉病的常發(fā)流行區(qū)，西藏多數(shù)青稞栽培區(qū)域均發(fā)生白粉病。類似小麥白粉病，大麥白粉病病原菌可以通過氣流遠(yuǎn)距離傳播，病原菌群體間跨地區(qū)交流頻繁[15]。云南是我國西南地區(qū)大麥白粉病的主要菌源地，自然條件下普遍存在有性生殖，因而病原菌群體毒性變異頻率高，群體毒性結(jié)構(gòu)復(fù)雜，但在西藏林芝地區(qū)自然條件下極少發(fā)生白粉菌有性雜交并形成子囊殼。在本研究中也發(fā)現(xiàn)，云南菌株的毒性頻率比來自西藏林芝地區(qū)的菌株的毒性頻率高，毒性譜更寬。這種現(xiàn)象的出現(xiàn)不僅與環(huán)境條件有關(guān)，寄主抗性的選擇壓力也是促進(jìn)病原菌毒性變異的重要原因。因白粉病的持續(xù)嚴(yán)重為害，云南皮大麥和裸大麥（即青稞）抗病育種中更重視將抗病基因引入育種體系，從而加大了對(duì)病原菌群體的抗性選擇壓力，促進(jìn)病原菌毒性變異。同時(shí)筆者發(fā)現(xiàn)，西藏和云南白粉菌群體并沒有完全隔離，2 個(gè)群體之間存在一定程度的交流。目前，還缺乏證據(jù)表明林芝是我國西南地區(qū)另一個(gè)大麥白粉菌菌源地。已經(jīng)鑒定出100 多個(gè)大麥抗白粉病基因，但大多數(shù)抗病基因由于病原菌流行優(yōu)勢(shì)小種更替而“喪失”抗病功能，仍在利用的如mlo等抗病性持久穩(wěn)定的基因較少[16]。在本研究中也發(fā)現(xiàn)部分抗病基因已經(jīng)“喪失”對(duì)鑒定的8 個(gè)菌株的抗病功能，在生產(chǎn)上不能繼續(xù)使用這些基因。

相比其他氣傳真菌病害，白粉菌群體毒性變異頻率更高，致病類型更豐富，因而抗病基因有效使用壽命更短。因此，不斷篩選和發(fā)掘抗病基因尤為重要和迫切，也是培育抗病大麥新品種的前提和基礎(chǔ)。大麥在我國長江流域中部地區(qū)、東部地區(qū)和西南地區(qū)具有悠久的栽培歷史，這些區(qū)域也是白粉病主要流行區(qū)域，因而在我國大麥資源中也存在重要的抗病遺傳資源[7]。在本研究中，利用苗期人工接種鑒定并結(jié)合成株期在病害常發(fā)區(qū)利用病原菌自然群體進(jìn)行成株期抗病性鑒定，獲得92 份全生育期高抗材料和97 份具有成株抗性材料。這些材料為我國大麥白粉病抗病育種提供了重要的抗病基因資源。

白粉病是歐洲國家大麥上非常重要的葉部病害之一，因而其特別重視大麥抗白粉病基因發(fā)掘和利用[16-17]。國內(nèi)有關(guān)大麥抗白粉病工作投入相對(duì)較少，目前已從種質(zhì)資源中篩選獲得了抗病材料[18]。利用多基因聚合方法[19]，已有育種家利用有效抗白粉病基因轉(zhuǎn)育到農(nóng)藝性狀優(yōu)良的主栽品種中進(jìn)行抗病性遺傳改良，利用大麥白粉菌自然菌源對(duì)回交后代株系進(jìn)行抗病性選擇。大麥抗病基因的選擇壓力、病原菌長距離傳播和有性重組是促進(jìn)白粉菌群體毒性結(jié)構(gòu)改變和遺傳進(jìn)化的主要因素[20]。因此，更應(yīng)積極挖掘新抗源，改良大麥品種抗病性，及時(shí)淘汰感病品種，合理布局抗病品種。這也有利于穩(wěn)定大麥白粉菌群體的毒性結(jié)構(gòu)，降低新流行小種的出現(xiàn)頻率。