鄧瑞，王威

心肌缺血再灌注（I/R）是臨床常見心肌損傷的病理過程[1]。I/R損傷導(dǎo)致局部心肌炎癥和細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致心肌不可逆轉(zhuǎn)的損傷甚至死亡。因此，需要減少心肌I/R損傷的新療法來改善患者的臨床結(jié)局。丁苯酞（NBP）來源于芹菜種子，屬于苯酞類化合物，臨床主要用于缺血性腦卒中的治療，有研究發(fā)現(xiàn)[2,3]丁苯酞對大鼠心肌缺血以及I/R導(dǎo)致的損傷具有抑制作用。Hedgehog信號通路促進(jìn)心肌細(xì)胞的增殖[4]，激活Hedgehog可以改善心肌凋亡及促進(jìn)細(xì)胞增殖[5]，然而丁苯酞對心肌I/R損傷的作用機(jī)制是否與Hedgehog信號通路有關(guān)，目前尚未可知。因此，本研究以心肌細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對象，利用缺氧復(fù)氧（H/R）處理構(gòu)建心肌I/R損傷模型，考察丁苯酞對心肌細(xì)胞增殖、凋亡、炎癥、氧化應(yīng)激和Hedgehog信號通路的影響，旨在探索其潛在的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 NBP（含量為99.8%）購自中國食品藥品檢定研究院，心肌細(xì)胞購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫，DMEM培養(yǎng)基（Dulbecco，s modified eagle medium）、胎牛血清購自美國GIBCO公司，異硫氰酸熒光素標(biāo)記的膜聯(lián)素Ⅴ/碘化丙啶（annexin Ⅴ-FITC/PI）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物公司，噻唑藍(lán)（MTT）、抑制劑HPI-4購自美國Sigma公司，胰酶、RIPA裂解液、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購自北京索萊寶公司，細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2（CDK2）、活化的多聚ADP-核糖聚合酶（cleaved PARP）、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cleaved caspase-3）、β肌動蛋白（β-actin）抗體購自美國Cellular Signaling Technology公司，PTCH、Smoothened（SMO）、Gli-1抗體購自上海艾博抗公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗購自博士德生物有限公司，超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測試劑盒、丙二醛（MDA）檢測試劑盒、活性氧（ROS）檢測試劑盒、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）、白介素-1β（IL-1β）酶聯(lián)免疫（ELISA）試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 心肌細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選取生長狀態(tài)良好的心肌細(xì)胞，將其分為Blank組（空白組，未作任何處理的心肌細(xì)胞），H/R組（缺氧處理心肌細(xì)胞復(fù)氧3 h，復(fù)氧處理6 h[6]），不同濃度NBP[7]組：NBP-L組（NBP低濃度組，心肌細(xì)胞使用2 μmol/L NBP和H/R處理），NBP-M組（NBP中濃度組，心肌細(xì)胞使用10 μmol/L NBP和H/R處理）、NBP-H組（NBP高濃度組，心肌細(xì)胞使用50 μmol/L NBP和H/R處理）。H/R+NBP組（心肌細(xì)胞進(jìn)行NBP和H/R處理），H/R+NBP+HPI-4組（心肌細(xì)胞進(jìn)行NBP、H/R和5 μmol/L HPI-4[8]處理）。其中，NBP處理心肌細(xì)胞24 h。

1.3 MTT檢測心肌細(xì)胞增殖 在96孔細(xì)胞板中接種密度為1×105個(gè)/ml的心肌細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后，每孔細(xì)胞加入20 μl 5 mg/ml的MTT溶液，37℃孵育 4 h，棄上清，加入150 μl DMSO，37℃搖床振蕩孵育10 min，于酶標(biāo)儀測定心肌細(xì)胞在490 nm處的吸光（OD）值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率（%）=實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值×100%

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測心肌細(xì)胞凋亡 調(diào)整各組心肌細(xì)胞密度為1×106個(gè)/ml，參照細(xì)胞凋亡試劑盒說明書的指示，在細(xì)胞中加入500 μl緩沖液重懸細(xì)胞，加入5 μl Annexin V-FITC混勻，加入5 μl PI混勻，室溫避光反應(yīng)15 min，置流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡的檢測。

1.5 炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β、氧化應(yīng)激指標(biāo)ROS、SOD、MDA檢測[9]收集各組心肌細(xì)胞上清液，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書的指示，檢測炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平。按照ROS、SOD、MDA檢測試劑盒說明書的指示，檢測氧化應(yīng)激指標(biāo)ROS、SOD、MDA水平。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法（W e s t e r n b l o t）檢測cyclinD1、CDK2、cleaved PARP、cleaved caspase-3、PTCH、SMO和Gli-1蛋白表達(dá) 心肌細(xì)胞加入RIPA裂解液，以提取總蛋白，蛋白樣品經(jīng)沸水變性10 min，進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，5%脫脂奶粉常溫封閉1 h，加入1：1000稀釋的一抗，4℃孵育過夜，次日用Tris-HCl-Tween緩沖鹽溶液（TBST）洗膜3次×10 min，加入1：5000稀釋的二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次×10 min，經(jīng)化學(xué)發(fā)光液顯色、顯影，以β-actin作為內(nèi)參蛋白，分析目的蛋白表達(dá)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間數(shù)據(jù)比較用單因素方差分析，組間多重比較用SNK-q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的丁苯酞對缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞存活的影響 MTT和Western blot檢測結(jié)果顯示，與空白組比較，H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞存活率、cyclin D1和CDK2蛋白表達(dá)量明顯減少（P＜0.05）（表1、圖1）；與H/R組比較，不同濃度的NBP顯著提高H/R心肌細(xì)胞存活率、cyclinD1和CDK2蛋白表達(dá)量（P＜0.05）（表1、圖1）。

2.2 不同濃度的丁苯酞對缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)和Western blot檢測結(jié)果顯示，與空白組比較，H/R組心肌細(xì)胞凋亡率、cleaved PARP、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)量增加（P＜0.05）（表2、圖2）；與H/R組比較，不同濃度的NBP顯著降低心肌細(xì)胞凋亡率、cleaved PARP、cleaved caspase-3蛋白水平（P＜0.05）（表2、圖2）。

2.3 不同濃度的丁苯酞對缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞炎癥的影響 對炎癥因子分泌的檢測結(jié)果顯示，與空白組比較，H/R組心肌細(xì)胞中TNF-α、IL-6、IL-1β水平明顯升高（P＜0.05）（表3）；與H/R組比較，不同濃度NBP顯著降低H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中TNF-α、IL-6、IL-1β水平（P＜0.05）（表3）。

2.4 不同濃度的丁苯酞對缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 對氧化應(yīng)激的檢測結(jié)果表明，與空白組比較，H/R組心肌細(xì)胞的ROS、MDA水平明顯升高，SOD活性顯著降低（P＜0.05）（表4）；與H/R組比較，不同濃度NBP明顯降低心肌細(xì)胞的ROS、MDA水平，而顯著提高SOD活性（P＜0.05）（表4）。

表1 不同濃度的丁苯酞對缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞存活及cyclinD1和CDK2蛋白表達(dá)的影響（）

表1 不同濃度的丁苯酞對缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞存活及cyclinD1和CDK2蛋白表達(dá)的影響（）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與H/R組比較，bP＜0.05

圖1 Western blot檢測缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞cyclinD1和CDK2蛋白表達(dá)

表2 不同濃度的丁苯酞對缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞凋亡及cleaved PARP和cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)（）

表2 不同濃度的丁苯酞對缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞凋亡及cleaved PARP和cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)（）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與H/R組比較，bP＜0.05

圖2 不同濃度的丁苯酞對缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞凋亡的影響

表3 不同濃度的丁苯酞對缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞炎癥因子分泌的影響 （）

表3 不同濃度的丁苯酞對缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞炎癥因子分泌的影響 （）

注：TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL-6：白介素-6；IL-1β：白介素-1β；與空白組比較，aP＜0.05；與H/R組比較，bP＜0.05

IL-1β（pg/ml）Blank（n=9） 6.91±0.94 8.61±0.75 3.70±0.52 H/R（n=9） 22.86±2.65a 30.85±3.23a 32.62±2.87a NBP-L（n=9） 17.36±1.35b 22.05±2.33b 25.78±2.31b NBP-M（n=9） 15.70±1.55b 17.92±1.83b 20.65±2.67b NBP-H（n=9） 12.50±1.27b 15.86±1.64b 16.81±2.13b F值 113.385 134.566 206.803 P值 0.000 0.000 0.000分組 TNF-α（pg/ml）IL-6（pg/ml）

2.5 不同濃度的丁苯酞對缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞Hedgehog信號通路的影響 Western blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白組比較，H/R組心肌細(xì)胞中PTCH、SMO和Gli-1蛋白表達(dá)量明顯降低（P＜0.05）（表5、圖3）；與H/R 組比較，N B P-L、NBP-M、NBP-H組明顯提高PTCH、SMO和Gli-1蛋白水平（P＜0.05）（表5、圖3）。

2.6 Hedgehog信號通路抑制劑HPI-4部分逆轉(zhuǎn)丁苯酞對缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞的保護(hù)作用 與H/R+NBP組比較，H/R+NBP+HPI-4組心肌細(xì)胞的存活率、cyclinD1、CDK2、PTCH、SMO和Gli-1蛋白表達(dá)量明顯降低，細(xì)胞凋亡率、cleaved PARP、cleaved caspase-3蛋白水平顯著升高（P＜0.05）（表6、圖4）。

表4 不同濃度的丁苯酞對缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響（）

表4 不同濃度的丁苯酞對缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響（）

注：ROS：活性氧；SOD：超氧化物歧化酶；MDA：丙二醛；與空白組比較，aP＜0.05；與H/R組比較，bP＜0.05

表5 不同濃度的丁苯酞對缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞Hedgehog信號通路PTCH、SMO和Gli-1蛋白表達(dá)的影響（）

表5 不同濃度的丁苯酞對缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞Hedgehog信號通路PTCH、SMO和Gli-1蛋白表達(dá)的影響（）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與H/R組比較，bP＜0.05

圖3 Western blot檢測缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞PTCH、SMO和Gli-1蛋白表達(dá)

圖4 HPI-4和丁苯酞對缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞凋亡以及蛋白表達(dá)的影響

3 討論

缺血性心臟病，包括冠心病，是全世界范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡的主要原因之一[10]。冠心病的影響通常是由急性心肌缺血引起的[11]。缺血會產(chǎn)生細(xì)胞應(yīng)激，導(dǎo)致不可逆的組織損傷。為了確保細(xì)胞存活和維持器官功能，縮短缺血時(shí)間是必須的，但再灌注時(shí)大量的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的重新引入會產(chǎn)生過度的氧化應(yīng)激，從而進(jìn)一步增加細(xì)胞損傷和心肌細(xì)胞死亡[12]。目前，心肌I/R損傷的機(jī)制是復(fù)雜的，多方面的，涉及氧化應(yīng)激、過度炎癥和/或程序性細(xì)胞死亡，細(xì)胞內(nèi)鈣失衡，線粒體功能障礙等[13-15]。因此，防止氧化應(yīng)激、炎癥和心肌細(xì)胞凋亡可能是治療冠心病的有效途徑。H/R損傷可顯著促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡，增加炎癥和氧化應(yīng)激[16]。本研究考察了丁苯酞對心肌細(xì)胞H/R損傷的作用，結(jié)果表明，丁苯酞促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖，降低炎癥因子分泌，改善心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激。值得注意的是，丁苯酞對H/R損傷心肌細(xì)胞有明顯的抗凋亡作用。另外，丁苯酞通過Hedgehog信號通路在H/R損傷心肌細(xì)胞模型中調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的存活。

細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是心肌損傷的重要機(jī)制。凋亡過程中心肌細(xì)胞數(shù)量減少，心肌成纖維細(xì)胞增殖，導(dǎo)致心肌肥厚，收縮力下降，最終發(fā)展為心力衰竭[17]。根據(jù)報(bào)道，幾個(gè)重要的分子參與細(xì)胞凋亡的進(jìn)展，包括PARP和caspase-3[17]。炎癥是心臟缺氧-復(fù)氧損傷最常見的特征之一，預(yù)防炎癥可以有效地預(yù)防心肌缺血再灌注損傷[18]。氧化應(yīng)激是心臟H/R損傷的另一誘因，過量的ROS會引起一系列的病理變化，如氧化還原酶的激活等[19]。在本實(shí)驗(yàn)中，H/R處理明顯降低心肌細(xì)胞存活率、cyclinD1、CDK2蛋白表達(dá)、SOD活性，而顯著提高心肌細(xì)胞凋亡率、磷酸化PARP、磷酸化caspase-3蛋白表達(dá)量、TNF-α、IL-6、IL-1β、ROS、MDA水平，表明缺氧復(fù)氧導(dǎo)致心肌細(xì)胞增殖抑制，炎癥、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡增加。資料顯示，丁苯酞在大鼠心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷中發(fā)揮保護(hù)作用，可以有效降低大鼠心肌梗死面積和細(xì)胞凋亡[20]。在異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠心肌損傷模型中，丁苯酞能夠減輕缺血心肌損傷，提高SOD活性，降低MDA含量[21]。本項(xiàng)研究中，使用不同濃度的丁苯酞處理可以顯著改善缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞的損傷程度，顯著提高心肌細(xì)胞存活率、cyclinD1、CDK2蛋白表達(dá)量、SOD活性，并降低心肌細(xì)胞凋亡率、cleaved PARP、cleaved caspase-3蛋白、TNF-α、IL-6、IL-1β、ROS、MDA水平，發(fā)揮保護(hù)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞的作用，與前述報(bào)道相符。

表6 HPI-4和丁苯酞對缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞增殖和凋亡以及Hedgehog信號通路蛋白表達(dá)的影響

表6 HPI-4和丁苯酞對缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞增殖和凋亡以及Hedgehog信號通路蛋白表達(dá)的影響

注：與H/R+NBP組比較，aP＜0.05

細(xì)胞凋亡率（%）H/R+NBP（n=9） 0.59±0.08 1.24±0.11 0.25±0.04 0.45±0.06 0.48±0.06 0.67±0.08 0.52±0.06 103.58±7.64 13.61±1.62 H/R+NBP+HPI-4（n=9） 0.36±0.04a 0.74±0.08a 0.63±0.07a 0.78±0.09a 0.21±0.04a 0.33±0.05a 0.35±0.04a 86.46±6.58a 19.68±2.35a F值 7.714 11.028 14.140 9.135 11.233 10.812 7.072 5.094 6.380 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000分組 cyclinD1 CDK2 cleaved PARP cleaved caspase-3 PTCH SMO Gli-1 細(xì)胞存活率（%）

成年哺乳動物心肌細(xì)胞在受到損傷時(shí)幾乎沒有增殖能力，然而，在組織損傷時(shí)，一些在胚胎發(fā)生時(shí)活躍而在成年期沉默的通路被激活，其中一個(gè)例子就是Hedgehog信號[22]。Hedgehog信號通路參與調(diào)節(jié)胚胎心臟冠狀動脈血管的生成和發(fā)育。Hedgehog信號通路主要包括信號肽（Shh等）、跨膜受體（PTCH、SMO等）、下游核轉(zhuǎn)錄因子（Gli等）3個(gè)部分[23]。近年來，Hedgehog信號通路成為促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖、抑制心肌細(xì)胞死亡和凋亡、向心肌缺血部位募集內(nèi)皮祖細(xì)胞、引導(dǎo)干細(xì)胞向心肌譜系分化的重要調(diào)控因子[24]。本研究中，缺氧復(fù)氧處理顯著抑制Hedgehog信號通路PTCH、SMO和Gli-1蛋白表達(dá)，而丁苯酞可以促進(jìn)PTCH、SMO和Gli-1蛋白表達(dá)。此外，Hedgehog信號通路抑制劑HPI-4部分逆轉(zhuǎn)丁苯酞對缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，表明Hedgehog信號通路激活可能是丁苯酞保護(hù)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞損傷的重要途徑之一。

綜上所述，不同濃度的丁苯酞可以促進(jìn)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞增殖，減輕其凋亡、炎癥和氧化應(yīng)激，其作用機(jī)制與Hedgehog信號通路激活有關(guān)，這為心肌缺血再灌注損傷的治療提供了新的見解。