劉松意 宮月華 邢承忠

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院肛腸外科中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤病因與篩查研究室(110001)

背景：胃癌是常見(jiàn)的消化道腫瘤。脂肪酸在胃癌發(fā)展過(guò)程中起有重要作用。脂肪酸的功能需要脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP)的參與。目的：系統(tǒng)分析FABP家族對(duì)胃癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)和預(yù)后的影響并了解FABP家族的潛在功能。方法：利用ONCOMINE數(shù)據(jù)庫(kù)分析胃癌與癌旁組織中FABP家族成員的mRNA差異表達(dá)，應(yīng)用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行驗(yàn)證，并分析FABP家族成員與胃癌患者生存之間的關(guān)系。應(yīng)用人類(lèi)蛋白圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)分析胃癌中FABP家族成員蛋白差異表達(dá)變化。應(yīng)用STRING、DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用分析和GO、KEGG富集分析。結(jié)果：與正常胃組織相比，胃癌中FABP3/4/7表達(dá)明顯下調(diào)，F(xiàn)ABP1表達(dá)存在爭(zhēng)議。生存分析結(jié)果顯示，F(xiàn)ABP3/4/8 mRNA低水平者的總體生存率高。GO分析顯示FABP家族主要富集于生物過(guò)程、細(xì)胞質(zhì)和分子功能變化。KEGG分析顯示FABP家族主要參與PPAR信號(hào)通路、脂肪的消化與吸收信號(hào)通路。結(jié)論：FABP3/4/7可作為胃癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的標(biāo)志物，F(xiàn)ABP3/4/8可作為胃癌的預(yù)后標(biāo)志物。FABP的作用可能與PPAR途徑和脂質(zhì)代謝途徑有關(guān)。

胃癌是世界上最常見(jiàn)的腫瘤之一，其致死率在所有腫瘤中排第四位[1]。胃癌的早期診斷率低，晚期治療方式少，造成胃癌患者的預(yù)后較差。目前胃癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制尚不明確，脂質(zhì)代謝可能起有重要作用[2]。目前發(fā)現(xiàn)脂肪酸結(jié)合蛋白(fatty acid-binding protein, FABP)包括9個(gè)成員，主要在參與脂質(zhì)代謝的組織中表達(dá)[3]。FABP的組織分布和生物學(xué)功能的差異決定了不同成員在腫瘤中的不同作用，其在大多數(shù)惡性腫瘤中表達(dá)，如前列腺癌，乳腺癌、肝癌、膀胱癌和肺癌[4]。腫瘤發(fā)生時(shí)，脂質(zhì)作為能量供應(yīng)者維持著癌細(xì)胞的增殖、存活、侵襲和血管生成等過(guò)程，成為腫瘤組織持續(xù)增長(zhǎng)的重要原因[5]。而FABP通過(guò)結(jié)合脂肪酸，并激活多種信號(hào)通路參與該過(guò)程。但其在胃癌中的情況少見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法，從mRNA和蛋白兩個(gè)層面探究FABP家族在胃癌中的表達(dá)，評(píng)估對(duì)胃癌患者預(yù)后的影響，并預(yù)測(cè)其參與胃癌發(fā)生、發(fā)展的可能信號(hào)途徑，旨在為胃癌的研究提供可靠的理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

資料與方法

一、ONCOMINE數(shù)據(jù)庫(kù)分析

利用ONCOMINE(https://www.oncomine.org/resource/main.html)數(shù)據(jù)庫(kù)[6]，獲取FABP家族在胃癌中的mRNA表達(dá)情況，并應(yīng)用t檢驗(yàn)分析其在癌癥與癌旁之間的差異表達(dá)。當(dāng)P<0.05且差異倍數(shù)(FC)超過(guò)2倍時(shí)，判定為存在表達(dá)差異。

二、GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析

GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/)數(shù)據(jù)庫(kù)用于分析來(lái)自腫瘤基因組圖譜(TCGA)的9 000余例腫瘤樣本和GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)的8 000余例正常樣品的RNA測(cè)序表達(dá)[7]。為增加數(shù)據(jù)的可信度，從GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取FABP家族在胃癌和癌旁組織中的表達(dá)情況。P<0.05且FC超過(guò)2倍時(shí)定義為存在差異表達(dá)。同時(shí)，分析FABP家族對(duì)胃癌患者預(yù)后的影響。

三、人類(lèi)蛋白質(zhì)圖譜(The Human Protein Atlas)分析

人類(lèi)蛋白質(zhì)圖譜使用多種組學(xué)技術(shù)來(lái)表征細(xì)胞、組織和器官中所有人類(lèi)蛋白質(zhì)。從人類(lèi)蛋白質(zhì)圖譜中獲取FABP在胃癌中的免疫組化染色圖，分析其在胃癌組織中的原位表達(dá)分布。

四、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)和功能通路富集分析

利用STRING在線數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)[8]對(duì)FABP家族進(jìn)行PPI分析。同時(shí)利用DAVID (https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)[9]以及Cytoscape的ClueGo插件對(duì)FABP家族進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析[10]。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、FABP家族mRNA差異表達(dá)分析

ONCOMINE數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果顯示，在Chen Gastric數(shù)據(jù)集中，F(xiàn)ABP1在彌漫型胃腺癌(FC=-9.871，P=0.000 4)和混合型胃腺癌(FC=-14.263，P=0.003)中顯著低表達(dá)；在Cho Gastric數(shù)據(jù)集中，F(xiàn)ABP3在腸型胃腺癌(FC=-2.040，P=0.000 2)中顯著低表達(dá)；Wang Gastric數(shù)據(jù)集示胃癌組織中FABP3表達(dá)顯著低于正常組織(FC=-2.404，P=0.005)。在Cho、Cui和DErrico數(shù)據(jù)集示FABP4在多種胃癌分型中顯著低表達(dá)；DErrico數(shù)據(jù)集示彌漫型胃腺癌(FC=-2.259，P=0.005)和腸型胃腺癌(FC=-2.577，P=0.000 4)中FABP7表達(dá)明顯下調(diào)(圖1A)。而胃癌組織中FABP2/5/6/8/9表達(dá)與癌旁對(duì)照無(wú)明顯差異(圖1B)。

圖1 ONCOMINE數(shù)據(jù)庫(kù)中FABP家族在各種癌癥中的差異表達(dá)結(jié)果

GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，胃癌組織中FABP4表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)，F(xiàn)ABP1表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，其余FABP家族成員無(wú)明顯差異(圖2)。

圖2 GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)中FABP家族在胃癌中的差異表達(dá)結(jié)果

二、FABP家族蛋白差異表達(dá)分析

人類(lèi)蛋白質(zhì)圖譜分析結(jié)果顯示，F(xiàn)ABP家族的9個(gè)分子均定位于胃上皮組織的細(xì)胞質(zhì)中。胃癌組織中FABP1表達(dá)明顯上調(diào)，F(xiàn)ABP3/7表達(dá)明顯下調(diào)，而FABP2/4/5/6/9表達(dá)無(wú)明顯差異(圖3)(FABP8由于缺乏相關(guān)信息，故缺乏結(jié)果)。

圖3 胃癌中FABP家族蛋白水平的差異表達(dá)(免疫組化染色，×100)

三、FABP家族mRNA表達(dá)與胃癌預(yù)后的關(guān)系

生存分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP3/4/8 mRNA表達(dá)低的胃癌患者的生存率高于高表達(dá)者(圖4)。

圖4 FABP家族mRNA表達(dá)對(duì)胃癌預(yù)后的價(jià)值

四、FABP家族PPI網(wǎng)絡(luò)分析以及GO和KEGG功能通路富集分析

PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，F(xiàn)ABP家族之間存在明顯的相互作用，其中FABP1/4/6與其他分子的連接數(shù)均達(dá)到7個(gè)，F(xiàn)ABP2/3/5/7/9的連接數(shù)均為3個(gè)，而FABP8的連接數(shù)為2個(gè)(圖5)。GO通路分析結(jié)果顯示，F(xiàn)ABP家族在生物過(guò)程中富集于三酰甘油分解代謝(triglyceride catabolic process)和運(yùn)輸(transport)；富集于細(xì)胞質(zhì)(cytosol)；在分子功能的變化中富集于轉(zhuǎn)運(yùn)活性(transporter activity)、脂質(zhì)結(jié)合(lipid binding)、脂肪酸結(jié)合(fatty acid binding)、長(zhǎng)鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性(long-chain fatty acid transporter activity)和膽汁酸結(jié)合(bile acid binding)(圖6)。KEGG通路富集分析顯示，F(xiàn)ABP家族主要參與PPAR信號(hào)通路(PPAR signaling pathway)、脂肪消化與吸收信號(hào)通路(fat digestion and absorption)(圖7)。與DAVID分析結(jié)果一致。

圖5 FABP家族的PPI網(wǎng)絡(luò)分析

圖6 FABP家族的GO功能富集分析

圖7 FABP家族的KEGG通路富集分析

討 論

為滿足增殖需求，腫瘤細(xì)胞需產(chǎn)生大量脂肪酸以提供膜結(jié)構(gòu)，且該過(guò)程需要能量。因此，靶向脂肪酸的合成代謝可能在胃癌中發(fā)揮重要作用。脂肪酸的合成代謝需要FABP的參與。目前已證實(shí)FABP對(duì)多種癌癥的發(fā)生和預(yù)后具有重要作用，但尚未見(jiàn)其在胃癌中總體生物信息學(xué)分析的研究。系統(tǒng)了解FABP家族基因在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的表達(dá)變化以及FABP家族功能的潛在生物學(xué)意義對(duì)揭示胃癌進(jìn)展的關(guān)鍵機(jī)制至關(guān)重要，有助于為改善胃癌預(yù)后提供準(zhǔn)確的治療靶標(biāo)。

本研究通過(guò)應(yīng)用ONCOMINE數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)胃癌中FABP1/3/4/7表達(dá)下調(diào)。GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果顯示FABP4在胃癌中表達(dá)下調(diào)，F(xiàn)ABP1表達(dá)上調(diào)，而FABP3/7表達(dá)無(wú)明顯差異。兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果不一致可能是由于數(shù)據(jù)庫(kù)樣本異質(zhì)性所致。Jin等[11]的研究發(fā)現(xiàn)FABP4表達(dá)在胃癌中顯著下調(diào)。目前仍未見(jiàn)FABP3在胃癌中表達(dá)的研究，Tang等[12]發(fā)現(xiàn)肺癌中FABP3顯著高表達(dá)，并與不良預(yù)后有關(guān)。未來(lái)需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量以驗(yàn)證上述結(jié)果。

本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，胃癌中FABP1蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，而FABP3/7蛋白表達(dá)明顯下調(diào)。Hashimoto等[13]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP3蛋白在胃癌中的表達(dá)陽(yáng)性率較低，并與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)。Hashimoto等[3]還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP1在胃乳頭狀癌中陽(yáng)性表達(dá)。目前尚未見(jiàn)FABP7蛋白在胃癌中的表達(dá)情況。Ma等[14]發(fā)現(xiàn)FABP7在結(jié)腸癌中高表達(dá)，通過(guò)促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、集落形成、細(xì)胞周期進(jìn)程和抑制細(xì)胞凋亡來(lái)促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。綜上所述，在胃癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，推測(cè)FABP3和FABP7從轉(zhuǎn)錄水平開(kāi)始就處于被抑制的狀態(tài)，導(dǎo)致了癌癥的進(jìn)展。FABP1蛋白表達(dá)趨勢(shì)與GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)的mRNA表達(dá)結(jié)果一致，但與ONCOMINE數(shù)據(jù)庫(kù)的mRNA表達(dá)結(jié)果相反，仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)以發(fā)現(xiàn)其真實(shí)的表達(dá)變化趨勢(shì)。

FABP對(duì)癌癥患者的預(yù)后有一定的預(yù)測(cè)作用。FABP3高表達(dá)與肝細(xì)胞癌的不良預(yù)后顯著相關(guān)，是評(píng)估肝細(xì)胞癌預(yù)后的潛在候選生物學(xué)標(biāo)志物[15]。FABP4可抑制肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲，并預(yù)示肝癌預(yù)后不良[16]。Satoh等[17]發(fā)現(xiàn)FABP1是預(yù)測(cè)胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的可靠指標(biāo)。本研究中，F(xiàn)ABP3/4 mRNA低表達(dá)者的總體生存率更高，為今后臨床治療靶標(biāo)研究提供了新的方向。此外，胃癌中FABP8 mRNA表達(dá)與對(duì)照組無(wú)明顯差異，但其與胃癌預(yù)后顯著相關(guān)。推測(cè)在胃癌的發(fā)生過(guò)程中，F(xiàn)ABP8可能不發(fā)揮作用，并不是胃癌的風(fēng)險(xiǎn)因子，但其能影響胃癌患者的生存，可作為胃癌的預(yù)后因子。

對(duì)FABP家族蛋白進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，結(jié)果顯示FABP1/4/6與其他FABP家族有更多關(guān)聯(lián)，是整個(gè)PPI網(wǎng)絡(luò)的中樞核心分子。FABP家族的GO功能分析獲得了三個(gè)最有意義的功能模塊。模塊一的生物學(xué)過(guò)程主要富集于三酰甘油分解代謝和運(yùn)輸功能，提示FABP家族可能通過(guò)影響三酰甘油代謝和調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)功能來(lái)調(diào)控胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP家族蛋白表達(dá)下降導(dǎo)致脂肪酸代謝降低，促進(jìn)脂肪酸蓄積，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡來(lái)發(fā)揮抗腫瘤作用[18]。模塊二主要富集于細(xì)胞質(zhì)中，免疫組化染色結(jié)果同樣證實(shí)FABP家族主要在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮作用參與腫瘤進(jìn)展。模塊三主要富集于轉(zhuǎn)運(yùn)活性、脂質(zhì)結(jié)合、脂肪酸結(jié)合、長(zhǎng)鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性和膽汁酸結(jié)合方面，提示FABP家族可能通過(guò)參與脂質(zhì)代謝和調(diào)控膽汁酸結(jié)合來(lái)影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。KEGG分析結(jié)果提示FABP家族主要參與PPAR信號(hào)通路、脂肪消化與吸收信號(hào)通路。有研究表明，長(zhǎng)鏈脂肪酸及其代謝產(chǎn)物可調(diào)節(jié)多種轉(zhuǎn)錄因子(包括PPAR和LXR)的功能或定位[19]。FABP1與這些蛋白質(zhì)具有相似的結(jié)合特性，因此FABP1可能通過(guò)影響這些轉(zhuǎn)錄因子及其配體的功能來(lái)激活代謝。FABP4可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在肝細(xì)胞癌中起關(guān)鍵作用，并參與多種腫瘤中PPAR-γ活化[20-21]。Wu等[22]的研究結(jié)果顯示，F(xiàn)ABP5/6/7與PPARα呈負(fù)相關(guān)，上調(diào)FABP5/6/7可能會(huì)降低脂肪酸的氧化并增加細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)脂肪酸含量以促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。

綜上所述，本研究利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)資源系統(tǒng)地分析了FABP家族分子在胃癌中的作用，結(jié)果顯示FABP1/3/4/7可能是用于胃癌診斷、治療的潛在靶標(biāo)，F(xiàn)ABP3/4/8可預(yù)示胃癌患者的預(yù)后。此外，F(xiàn)ABP家族在胃癌中的作用可能與PPARα介導(dǎo)的氧化和脂肪酸介導(dǎo)的脂質(zhì)代謝相關(guān)。但研究結(jié)論需行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，F(xiàn)ABP家族及其潛在的機(jī)制分析可為今后胃癌的研究奠定基礎(chǔ)。