賈壯壯，陳紅陽，趙 磊，袁 慶，殷孟蘭，王少峽，胡利民

（天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津市中藥藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，方劑學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 301617）

缺血性腦卒中是神經(jīng)系統(tǒng)常見的疾病，具有高發(fā)病率、高致殘率和高致死率的特點(diǎn)[1]，其病理機(jī)制包括缺血后炎癥反應(yīng)、氧化和硝化應(yīng)激、興奮性氨基酸毒性、細(xì)胞凋亡等[2]，其中炎癥反應(yīng)在腦缺血損傷中發(fā)揮重要作用，小膠質(zhì)細(xì)胞作為神經(jīng)系統(tǒng)中重要的免疫細(xì)胞，參與炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，其在缺血性腦損傷中的作用尚有爭議，早期認(rèn)為小膠質(zhì)細(xì)胞可釋放炎癥介質(zhì)并募集炎癥細(xì)胞，加劇腦缺血再灌注損傷[3]；近年來研究發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞具有高度可塑性，受特定的微環(huán)境刺激可呈現(xiàn)不同表型，進(jìn)而發(fā)揮損傷和修復(fù)的雙重功能[4-6]。腦缺血損傷后，小膠質(zhì)細(xì)胞被激活并極化為M1型和M2型兩種表型，其中M1型小膠質(zhì)細(xì)胞可釋放促炎因子白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-12（IL-12）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）等加劇腦損傷，而M2型小膠質(zhì)細(xì)胞釋放抗炎因子白細(xì)胞介素-10（IL-10）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）、精氨酸酶-1（Arg-1）、胰島素樣生長因子-1（IGF-1）進(jìn)而促進(jìn)腦損傷修復(fù)。因此，調(diào)節(jié)腦缺血再灌注損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞M1/M2表型的平衡，可能是有效的治療策略。

丹參、三七為臨床常用活血藥對，廣泛應(yīng)用于治療心腦血管疾病。丹參主要成分為水溶性的酚酸類及脂溶性的二萜類[7]；三七的主要成分為三七總皂苷[8]。注射用丹參多酚酸及注射用血栓通（主要成分為三七總皂苷）在臨床中治療缺血性腦卒中應(yīng)用廣泛。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，丹參多酚酸及三七總皂苷配伍可通過減小腦梗死體積、減輕氧化應(yīng)激損傷、改善微循環(huán)障礙等減輕腦缺血再灌注損傷[9-11]。本研究目的在于探討丹參多酚酸及三七總皂苷對腦缺血再灌注損傷后M1/M2型小膠質(zhì)細(xì)胞極化的影響，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用及其相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 注射用丹參多酚酸（SPA），天津天士力之驕藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20180901；注射用血栓通（凍干）（PNS），廣西梧州制藥股份有限公司，批號(hào)：18080416；依達(dá)拉奉注射液（Eda），南京先聲東元制藥有限公司，規(guī)格5 mL/10 mg，批號(hào)：80-170510。Iba-1（ab178847）、NeuN（ab177487）、TNF-α（ab66579）、IL-6 （ab9324）、IL-10（ab33471）、iNOS（ab15323）、TGF-β（ab92486）、β-actin（ab179467）抗體，英國 Abcam 公司；IL-1β（BS6067）兔多克隆抗體，美國 Bioword 公司；CD206（sc-58986）小鼠單克隆抗體，美國 Santa Cruz公司；CD16（MA1-7633）小鼠多克隆抗體，美國Thermo公司。

1.2 動(dòng)物 SPF級(jí)健康雄性Wistar大鼠60只，體質(zhì)量（270±10）g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006。

1.3 主要儀器 激光散斑血流儀（英國moor公司）；蛋白免疫印跡（Western Blot）電泳儀（美國Bio-Rad公司）；Amersham imager 600超靈敏多功能成像儀（美國General Electric公司）；Eclipse Ti倒置熒光顯微鏡（日本Nikon公司）。

1.4 分組與給藥 采用隨機(jī)數(shù)字法將Wistar大鼠分為6組，假手術(shù)組（Sham）、腦缺血再灌注組（I/R）、依達(dá)拉奉組 （Eda，6 mg/kg）、丹參多酚酸組（SPA，21 mg/kg）、三七總皂苷組（PNS，100 mg/kg）、丹參多酚酸配伍三七總皂苷組（SPA+PNS，21 mg/kg+100 mg/kg），尾靜脈注射給藥，每日1次，連續(xù)給藥5 d，Sham組與I/R組給予相同容積生理鹽水。

1.5 模型制備 采用線栓法[12]建立大腦中動(dòng)脈閉塞/再灌注模型（MCAO/R）。大鼠吸入異氟烷麻醉后，腦部固定激光多普勒血流儀，監(jiān)測腦血流；將頸部正中切開，鈍性分離頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈，將線栓從頸外動(dòng)脈經(jīng)頸總動(dòng)脈分叉處插至頸內(nèi)動(dòng)脈，阻斷大腦中動(dòng)脈供血，缺血1．5 h后拔出線栓再灌。假手術(shù)組僅暴露頸部血管，不做插線栓處理。

1.6 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.6.1 神經(jīng)行為學(xué)評分 給藥5 d后進(jìn)行mNSS神經(jīng)功能評分[13]，觀察各組大鼠神經(jīng)功能缺損情況，包括運(yùn)動(dòng)測試、感覺測試、平衡測試、反射測試和異常運(yùn)動(dòng)5個(gè)方面，總分18分，得分越高者神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。

1.6.2 腦部血流檢測 將大鼠吸入異氟烷麻醉后通過激光散斑血流儀New single image掃描腦血流情況，moor LDI Laser Doppler Imager Review V60進(jìn)行血流分析。

1.6.3 蘇木精-伊紅（HE）染色及Nissl染色 給藥5 d后，異氟烷麻醉后處死，心臟灌注生理鹽水及4%多聚甲醛溶液，大鼠斷頭取腦，用4%多聚甲醛溶液固定過夜，乙醇梯度脫水、二甲苯透明，石蠟包埋后做冠狀切片，脫蠟、水化后分別進(jìn)行常規(guī)HE染色及Nissl染色，Nikon顯微鏡下觀察細(xì)胞組織形態(tài)。

1.6.4 免疫熒光染色檢測缺血半暗帶小膠質(zhì)細(xì)胞M1 型（CD16/Iba-1）、M2 型（CD206/Iba-1）和 NeuN表達(dá) 大鼠斷頭取腦，心臟灌注生理鹽水及4%多聚甲醛溶液，用4%多聚甲醛溶液固定過夜，蔗糖梯度脫水，OCT包埋后做連續(xù)冠狀冰凍切片，厚度20 μm，檸檬酸鈉溶液抗原修復(fù)，封閉，分別孵育NeuN、CD16/Iba-1、CD206/Iba-1 一抗過夜，次日滴加相應(yīng)的熒光二抗，37℃避光孵育40 min，DAPI染核，抗熒光淬滅劑封片；Nikon倒置熒光顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野拍照，統(tǒng)計(jì)陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)。

1.6.5 Western Blot法檢測小膠質(zhì)細(xì)胞M1型標(biāo)記物 iNOS、TNF-α、IL-1β、IL-6 與 M2 型標(biāo)記物 IL-10、CD206、TGF-β蛋白表達(dá) 提取大鼠腦缺血半暗帶總蛋白，采用SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF轉(zhuǎn)膜，5%的脫脂奶粉封閉2 h，分別孵育iNOS、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、CD206、TGF-β、β-actin I抗，4℃過夜，次日孵育HRP標(biāo)記Ⅱ抗，TBST清洗后顯影，Image J軟件分析目的蛋白/βactin的相對表達(dá)情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s），正態(tài)分布計(jì)量資料組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較若滿足方差齊性采用LSD法，不滿足方差齊性采用Tamhane’s法；若不符合正態(tài)分布，組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)，P＜0．05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對大鼠局部腦血流的影響 見圖1。給藥5 d以后，激光散斑血流儀檢測大鼠腦血流情況，與Sham組比較，I/R組大鼠缺血側(cè)局部腦血流顯著下降（P＜0．01）；與 I/R 組比較，Eda組、SPA 組、PNS 組、SPA+PNS組腦血流顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01，P＜0．05），SPA+PNS 組腦血流改善情況優(yōu)于SPA 組、PNS 組（P＜0．05）。

圖1 各組大鼠局部腦血流變化（（±s），n＝10）Fig.1 Changes of cerebral blood flow of rats in each group（（±s），n＝10）

2.2 對大鼠神經(jīng)功能缺損的影響 見圖2。與Sham組比較，I/R 組 mNSS評分明顯升高（P＜0．01）；與 I/R組比較，各用藥組mNSS評分顯著下降（P＜0．05或P＜0．01），神經(jīng)功能缺損狀況得到改善，且SPA+PNS組神經(jīng)功能缺損改善情況優(yōu)于SPA組、PNS組（P＜0．05）。

2.3 對大鼠腦缺血半暗帶組織形態(tài)學(xué)的影響 見圖3。HE染色結(jié)果顯示，I/R組細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞排列不整齊，細(xì)胞間隙疏松；與I/R組比較，各用藥組形態(tài)學(xué)明顯改善，正常細(xì)胞數(shù)量較多，組織結(jié)構(gòu)較為完整，細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞核較為清晰。

圖2 各組大鼠神經(jīng)功能評分（（±s），n＝10）Fig.2 MNSS of rats in each group（（±s），n＝10）

圖3 各組大鼠腦缺血半暗帶HE染色觀察（×400）Fig.3 HE staining image of cerebral ischemic penumbra of rats in each group（×400）

2.4 對大鼠腦缺血半暗帶神經(jīng)元損傷的影響 見圖4、圖5。Nissl染色顯示，I/R組神經(jīng)元排列紊亂，結(jié)構(gòu)異常，呈空泡樣，Nissl體數(shù)目顯著減少（P＜0．01）；NeuN 陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)明顯減少（P＜0．01）；與I/R組相比，各治療組神經(jīng)元形態(tài)明顯好轉(zhuǎn)，染色較均勻，Nissl體數(shù)目增多（P＜0．01 或 P＜0．05），NeuN陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)目增多（P＜0．01）；SPA+PNS 組神經(jīng)元數(shù)目多于 SPA 組、PNS 組（P＜0．01）。

圖4 各組大鼠腦缺血半暗帶Nissl染色觀察（×400，（±s））Fig.4 Nissl staining image of cerebral ischemic penumbra of rats in each group（×400，（±s））

圖5 各組大鼠腦缺血半暗帶NeuN表達(dá)情況（×400，（±s））Fig.5 Expression of NeuN of cerebral ischemic penumbra of rats in each group（×400，（±s））

2.5 對大鼠M1型小膠質(zhì)細(xì)胞極化的影響 見圖6。熒光雙染結(jié)果顯示，與Sham組比較，I/R組大鼠腦缺血半暗帶M1型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物CD16/Iba-1陽性細(xì)胞顯著增加（P＜0．01）；與 I/R 組比較，各用藥組 CD16/Iba-1 陽性細(xì)胞數(shù)顯著下降（P＜0．01），且SPA+PNS組下降程度優(yōu)于SPA 組、PNS組（P＜0．01）。

2.6 對大鼠M2型小膠質(zhì)細(xì)胞極化的影響 見圖7。與Sham組比較，I/R組大鼠腦缺血半暗帶M2型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物CD206/Iba-1陽性細(xì)胞顯著增加（P＜0．01）；與 I/R 組比較，各用藥組 CD206/Iba-1 陽性細(xì)胞數(shù)顯著增加（P＜0．01），且 SPA+PNS 組增加程度優(yōu)于 SPA 組、PNS 組（P＜0．01）。

圖6 各組大鼠腦缺血半暗帶CD16/Iba-1表達(dá)情況（×100，（±s））Fig.6 Expression of CD16/Iba-1 of cerebral ischemic penumbra of rats in each group（×100，（±s））

2.7 對大鼠M1型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)的影響 見圖8。Western Blot檢測結(jié)果顯示，與Sham組比較，I/R組大鼠腦缺血半暗帶M1型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物 iNOS、TNFα、IL-1β、IL-6 蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0．01）；與 I/R 組比較，SPA 組 IL-6表達(dá)無差異，其他各用藥組 IL-1β、IL-6、TNFα、iNOS 蛋白表達(dá)顯著下降（P＜0．01，P＜0．05），且 SPA+PNS 組下降程度優(yōu)于 SPA 組、PNS 組（P＜0．05）。

2.8 對大鼠M2型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)變化見圖9。與I/R組比較，SPA組、PNS組TGF-β表達(dá)無差異，其他各用藥組CD206、TGF-β、IL-10蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0．01，P＜0．05)，且 SPA+PNS 組升高程度優(yōu)于 SPA 組、PNS 組（P＜0．05）。

3 討論

腦卒中是世界范圍內(nèi)致殘和致死的重要疾病之一，重組型纖溶酶原激活劑（rtPA）仍然是食品藥監(jiān)督管理局（FDA）唯一批準(zhǔn)的治療急性缺血性卒中的有效藥物。隨著諸多神經(jīng)保護(hù)劑在臨床試驗(yàn)中失敗，更多的研究聚焦在改善缺血再灌注損傷后腦部的微環(huán)境而非僅注重保護(hù)受損的神經(jīng)元[13]，因此創(chuàng)造腦部細(xì)胞存活和再生的適宜微環(huán)境成為治療缺血性腦卒中的關(guān)鍵之一。

圖7 各組大鼠腦缺血半暗帶CD206/Iba-1表達(dá)情況（×100，（±s））Fig.7 Expression of CD206/Iba-1 of cerebral ischemic penumbra of rats in each group（×100，（±s））

圖8 各組大鼠M1型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)情況（±s）Fig.8 Expression of M1 microglia markers of rats in each group（±s）

圖9 各組大鼠M2型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)情況（±s）Fig.9 Expression of M2 microglia markers of rats in each group（±s）

小膠質(zhì)細(xì)胞參與維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)微環(huán)境穩(wěn)態(tài)，在缺血性腦損傷后免疫和炎癥反應(yīng)中起著重要的調(diào)節(jié)作用[14]。在缺血性腦損傷后，小膠質(zhì)細(xì)胞被極化為不同表型而呈現(xiàn)不同生理功能[15]，極化的M2型小膠質(zhì)細(xì)胞可用CD206標(biāo)記，其表達(dá)在腦缺血后1 d開始升高，第5天達(dá)到峰值后開始下降，其可通過清除細(xì)胞碎片，表達(dá)抗炎因子IL-10、TGF-β、Arg1、Ym1、抵抗素樣分子-α（RELM-α）、IGF-1、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）等促進(jìn)炎癥消退和神經(jīng)修復(fù)[16]，缺乏必要的內(nèi)源性M2型誘導(dǎo)因子會(huì)加重腦缺血損傷程度[17]；經(jīng)典活化的M1型小膠質(zhì)細(xì)胞在腦缺血后第3天開始明顯升高，直至第14天仍然呈上升趨勢，其高度表達(dá)CD16、CD86、主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ（MHCⅡ）、iNOS，釋放促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6及活性氧（ROS）等加劇神經(jīng)損傷[18]。促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞從M1型向M2型轉(zhuǎn)化，而非單純的抑制小膠質(zhì)細(xì)胞，可作為治療腦卒中的新思路，如紅景天苷可通過抑制C57/BL6小鼠局灶性短暫性腦缺血后M1型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)，促進(jìn)M2型標(biāo)記物的表達(dá)，增強(qiáng)小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬功能，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞源性炎癥因子的釋放[19]；姜黃素可抑制脂多糖（LPS）與干擾素-γ（IFN-γ）誘導(dǎo)的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞系的M1型極化，并促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞由M1型向M2型轉(zhuǎn)化[20]。

中醫(yī)理論認(rèn)為，腦卒中的主要病理因素為風(fēng)、火、痰、氣、瘀，而氣虛血瘀是重要病機(jī)之一。中藥具有多組分、多靶點(diǎn)等優(yōu)勢，在抗腦缺血治療中越來越受到人們的重視。丹參最早見于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有活血祛瘀之功，《本草便讀》記載其為“調(diào)理血分之首藥”。三七可活血化瘀，補(bǔ)虛強(qiáng)壯，黃元御言其“和營止血，通脈行瘀”，《本草求真》記載其“能于血分化其血瘀”。研究表明，丹參及其有效組分可調(diào)節(jié)超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）活性，提高機(jī)體的抗氧化能力[21]，調(diào)節(jié)腦缺血再灌注損傷后細(xì)胞凋亡、能量代謝異常等[22]。小膠質(zhì)細(xì)胞可通過調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路，進(jìn)而調(diào)節(jié)NLRP3信號(hào)釋放大量炎性介質(zhì)，從而造成神經(jīng)細(xì)胞毒性[23]，丹酚酸B可抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄活性和調(diào)節(jié)炎癥因子，促進(jìn)腦缺血損傷恢復(fù)[24]；三七總皂苷抑制腦缺血再灌注后不同時(shí)期的炎癥反應(yīng)，拮抗自由基損傷，抑制興奮性氨基酸毒性和Ca2+內(nèi)流，下調(diào)Bax、Caspase-3，上調(diào)Bcl-2的表達(dá)抑制神經(jīng)元凋亡，并可通過調(diào)節(jié)BDNF、VEGF發(fā)揮內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)作用[25-27]。

本研究通過線栓法誘導(dǎo)大鼠腦缺血再灌注損傷，配伍應(yīng)用丹參多酚酸及三七總皂苷，研究發(fā)現(xiàn)丹參多酚酸及三七總皂苷干預(yù)后，可顯著改善大鼠腦血流情況，改善神經(jīng)元損傷及神經(jīng)行為學(xué)缺損，并有效促進(jìn)M2型小膠質(zhì)細(xì)胞極化，抑制M1型極化，且配伍應(yīng)用效果優(yōu)于單獨(dú)應(yīng)用。本研究采用兩種中藥注射劑配伍應(yīng)用，其臨床有效配伍劑量及安全性等問題尚需進(jìn)一步深入研究。丹參多酚酸及三七總皂苷配伍應(yīng)用可顯著減輕大鼠腦缺血再灌注損傷，其機(jī)制可能與促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞M1型極化向M2型轉(zhuǎn)化有關(guān)，為進(jìn)一步探討丹參及三七有效組分治療缺血性腦卒中奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。