任秋月，田翰林，常 柏

（1．天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617；2．銅仁市碧江區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，銅仁 554300；3．天津醫(yī)科大學(xué)朱憲彝紀(jì)念醫(yī)院，天津 300134）

糖尿病大血管病變是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，糖尿病患者中，大血管病變的患病風(fēng)險是非糖尿病患者的2～4倍[1]。研究表明，相比持續(xù)性高糖，高糖波動更易導(dǎo)致大血管并發(fā)癥[2-3]，目前研究機制多涉及氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等[4-5]。腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）即AMP依賴的蛋白激酶，是細(xì)胞的能量變化感受器，已成為研究糖尿病及其他代謝相關(guān)疾病的核心。過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）共激活因子 1α（PGC-1α）是一種轉(zhuǎn)錄共激活因子，在線粒體生物合成和氧化、骨骼肌葡萄糖攝取方面起到調(diào)節(jié)作用，可由磷酸化的AMPK介導(dǎo)激活，其下調(diào)時可直接導(dǎo)致線粒體功能障礙。抵擋湯方出于《傷寒論》，為破血逐瘀名方。前期研究基礎(chǔ)表明，抵擋湯可明顯改善2型糖尿病患者血管內(nèi)皮舒張功能，減輕2型糖尿病大鼠大血管并發(fā)癥炎癥反應(yīng)[6-7]。因此，本研究試圖通過觀察抵擋湯干預(yù)對人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（p-AMPK）、PGC-1α、一氧化氮合酶（eNOS）、半胱氨酸天門冬氨酸特異性蛋白酶3（caspase-3）的影響，明確抵擋湯是否對高糖波動下血管內(nèi)皮細(xì)胞起保護(hù)作用，并探討其可能機制。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、0．25%胰蛋白酶消化液均購于Gibco公司；青霉素/鏈霉素購于 Biosharp公司；p-AMPKα（Thr172）抗體、PGC-1α抗體、eNOS抗體、β-actin均購買于Abbiotec公司；超純RNA提取試劑盒購于北京康為試劑生物科技有限公司；Annexin V-FITC/PI試劑盒購于美國碧迪公司；倒置顯微鏡、全自動圖像分析儀購于日本奧林巴斯公司；臺式低/高速離心機購于德國Eppendorf公司；熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀購于Applied Biosystems公司；流式細(xì)胞儀購于美國碧迪公司。

1.2 藥物 抵擋湯（熟大黃10 g，水蛭3 g，桃仁5 g，虻蟲1．5 g）購于天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，鹽酸二甲雙胍和辛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品均購買于MCE公司。

1.3 抵擋湯含藥血清制備 8只大鼠，雌雄各半，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分2組，對照組、抵擋湯組。采用人鼠等效劑量，抵擋湯水煎劑3 g/（kg·d）灌胃，每日1次，連續(xù)7 d，對照組給以同劑量的生理鹽水灌胃。末次灌胃前禁食12 h。末次灌胃后1 h，腹主動脈采血，靜置2 h，離心半徑160 mm，3 000 r/min離心15 min，分離血清，經(jīng)56℃，30 min滅活處理后，用 0．45 μm（或 0．22 μm）微孔濾膜過濾除菌，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 HUVECs由天津市內(nèi)分泌研究所饋贈。復(fù)蘇后用含10%胎牛血清、青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃，5%二氧化碳（CO2）無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細(xì)胞，胰蛋白酶消化后制成細(xì)胞懸液，以1×105/濃度接種于六孔板中。根據(jù)不同的培養(yǎng)環(huán)境分為9組：1）正常對照組（NG）：5 mmol/L 葡萄糖，正常糖環(huán)境，48 h。2）高糖組（HG）：25 mmol/L 葡萄糖，高糖環(huán)境，10%對照組血清，48 h。3）高糖辛伐他汀組（HG-S）：25mmol/L葡萄糖24h+25mmol/L葡萄糖、10μmmol/L辛伐他汀[8]24 h。4）高糖抵擋湯組（HG-D）：25 mmol/L葡萄糖24 h+25 mmol/L葡萄糖、10%抵擋湯24 h。5）高糖鹽酸二甲雙胍組（HG-M）：25 mmol/L葡萄糖24 h+25 mmol/L葡萄糖、2 mmol/L鹽酸二甲雙胍[9]24h。6）高糖波動組（FG）：（5mmol/L葡萄糖、25mmol/L葡萄糖每6 h交換1次，24 h后，25 mmol/L葡萄糖 24 h）。7）高糖波動辛伐他汀組（FG-S）：5 mmol/L葡萄糖、25 mmol/L葡萄糖每6 h交換1次，24 h后，25mmol/L葡萄糖、10μmmol/L辛伐他汀24h。8）高糖波動抵擋湯組（FG-D）：5 mmol/L葡萄糖、25 mmol/L葡萄糖每6 h交換1次，24 h后，25 mmol/L葡萄糖、10%抵擋湯24h。9）高糖波動鹽酸二甲雙胍組（FG-M）：5 mmol/L葡萄糖、25 mmol/L葡萄糖每6 h交換1次，24 h后，25 mmol/L葡萄糖、2 mmol/L鹽酸二甲雙胍24 h。

1.5 蛋白免疫印跡（Western Blot） 各組加入細(xì)胞裂解液（北京索萊寶公司），離心半徑125 mm，12 000 r/min、4℃離心10 min，取上清液。采用BCA蛋白定量測定試劑盒（上海碧云天公司）測定總蛋白量。取樣品上樣，蛋白質(zhì)雙向電泳（SDS-PAGE）分離，轉(zhuǎn)膜，10V恒壓通電80min。加I抗：抗p-AMPKα（Thr172）（1∶1 000 稀釋）、抗 PGC-1α（1∶1 000 稀釋）、eNOS（1∶1 000），4 ℃過夜孵育。辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的特異性Ⅱ抗（1∶2 000）及 HRP 標(biāo)記的生物素抗體（1∶1 000）室溫下孵育1 h。配置ECL發(fā)光液（北京索萊寶公司），曝光，保存條帶，灰度值分析，以β-actin為內(nèi)參，對蛋白條帶進(jìn)行相對定量分析。

1.6 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR） 超純RNA提取試劑盒提取內(nèi)皮細(xì)胞中總RNA，取RNA5 μL，用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。用DNaseⅠ試劑盒（2μL 10×buffer、2 μL DNase Ⅰ、2 μL RNA、14 μL RNase-Freewater）對RNA中殘留的基因組DNA進(jìn)行消化，37℃孵育30 min，向每個反應(yīng)管中加入2 μL 200 mmol/L EDTA，65℃保溫 10 min，使 DNaseⅠ失活。HiFi-MMLVcDNA第一鏈合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，37℃孵育50 min，70℃保溫10 min。反應(yīng)結(jié)束后的cDNA放置-20℃保存。擴增程序為：95℃10 min，（95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s）×45 個循環(huán)。反應(yīng)體系：0．4 μL 上游引物（10 μmol/L），0．4 μL 下游引物（10 μmol/L），10 μL 2×UltraSYBR Mixture，2 μL 模板，并加入滅菌蒸餾水至20 μL。引物序列：caspase-3上游 5’TACTGCCGGAGTCTGACTG3’下游 5’CTCCAGGAATAGTAACCAGG3’。應(yīng)用 ABI 7500型熒光定量PCR儀，并采用2-ΔΔCT法，對數(shù)據(jù)的相對定量進(jìn)行分析。

1.7 流式細(xì)胞術(shù) 使用冷的磷酸緩沖溶液（PBS）洗細(xì)胞2次，1×Binding Buffer緩沖液制成 1×106細(xì)胞/mL懸液，試管中加入100 μL細(xì)胞懸液，按體積加入Annexin V與PI染料，混勻，室溫避光放置15 min，使用Annexin V-Biotin試劑進(jìn)行檢測，各試管中分別加入 1×Binding Buffer緩沖液 400 μL，流式細(xì)胞儀測定結(jié)果。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21．0軟件。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較若方差齊采用 LSD 法，方差不齊采用 Dunnet’s T3 法，P＜0．05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Western-blot檢測各組內(nèi)皮細(xì)胞p-AMPK、PGC-1a、eNOS蛋白表達(dá) 與NG相比，HG組和FG組 p-AMPK、PGC-1α、eNOS 表達(dá)均下降（P＜0．05），且以 FG 組最低（P＜0．05）。高糖各干預(yù)組中，HG-D組 p-AMPK、PGC-1a、eNOS表達(dá)均高于 HG-S組（P＜0．05），且與HG-M 組比較無統(tǒng)計學(xué)差異。高糖波動各干預(yù)組中，F(xiàn)G-D組p-AMPK、PGC-1α、eNOS表達(dá)均高于 FG-S 組（P＜0．05），且與 FG-M 組比較無統(tǒng)計學(xué)差異。見圖1。

圖1 Western blot檢測各組p-AMPK、PGC-1α、eNOS蛋白表達(dá)情況Fig.1 The protein expression of p-AMPK，PGC-1a，and eNOS by Western blot test in each group

2.2 RT-PCR法檢測各種內(nèi)皮細(xì)胞caspase-3 mRNA表達(dá) HG、FG組caspase-3 mRNA表達(dá)明顯高于 NG（P＜0．05），且 FG 組最高（P＜0．05）。高糖各干預(yù)組中，HG-D組caspase-3mRNA含量低于HGS 組（P＜0．05），且與 HG-M 組比較無統(tǒng)計學(xué)差異。高糖波動各干預(yù)組中，F(xiàn)G-D組caspase-3mRNA含量低于 FG-S 組（P＜0．05），且與 FG-M 組比較無統(tǒng)計學(xué)差異。見圖2。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組內(nèi)皮細(xì)胞凋亡情況 與NG相比，HG組和FG組均可促進(jìn)細(xì)胞凋亡（P＜0．05），且以FG組凋亡率較高（P＜0．05）。高糖各干預(yù)組中，HG-D 組細(xì)胞凋亡率低于 HG、HG-S組（P＜0．05），且與HG-M組比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0．05）。高糖波動各干預(yù)組中，F(xiàn)G-D組細(xì)胞凋亡率低于FD、FG-S組（P＜0．05），且與 FG-M 組比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0．05）。提示抵擋湯干預(yù)可削弱高糖、高糖波動對細(xì)胞的促凋亡作用，其抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡作用優(yōu)于辛伐他汀，與鹽酸二甲雙胍比較無統(tǒng)計學(xué)差異。見圖3。

圖2 RT-PCR檢測各組caspase-3 mRNA表達(dá)情況Fig.2 Caspase-3 mRNA expression by RT-PCR detection in each group

3 討論

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡情況Fig.3 Apoptosis of cells by flow cytometry detection in each group

糖尿病大血管病變作為糖尿病慢性并發(fā)癥之一，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量，是致死、致殘的主要因素。血管內(nèi)皮是由血管內(nèi)皮細(xì)胞通過細(xì)胞間的連接而形成的單細(xì)胞層屏障，糖尿病大血管病變中，內(nèi)皮細(xì)胞是高血糖損傷的重要靶點，高血糖可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷和凋亡，血管內(nèi)皮完整性和血管功能破壞。研究顯示，與無大血管并發(fā)癥的糖尿病患者相比，合并大血管病變的糖尿病患者的血糖標(biāo)準(zhǔn)差、平均血糖波動幅度、最大血糖波動幅度均明顯增高[10]。高糖波動較持續(xù)性高糖更易導(dǎo)致血管損傷，對其機制研究多涉及氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、炎癥、止血凝血等[11-13]。本研究顯示，相比與持續(xù)性高糖環(huán)境，高糖波動環(huán)境更能損傷內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)其凋亡，與既往研究結(jié)果一致。

線粒體的結(jié)構(gòu)和功能變化是細(xì)胞凋亡的樞紐環(huán)節(jié)，過量的活性氧簇（ROS）能引發(fā)內(nèi)源性細(xì)胞凋亡途徑[14-15]。線粒體作為細(xì)胞能量代謝的場所，是細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷（ATP）的主要生產(chǎn)中心。AMPK作為細(xì)胞能量代謝的主要調(diào)控者，其活性受一磷酸腺苷（AMP）/ATP比值調(diào)控，線粒體抑制、營養(yǎng)匱乏和運動等多種生理條件都能激活A(yù)MPK。越來越多的證據(jù)表明，AMPK是合成線粒體、維持線粒體穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，通過調(diào)節(jié)下游信號通路來維持線粒體的最佳狀態(tài)[16]。AMPK還可通過促進(jìn)游離脂肪酸（FFA）的氧化從而拮抗FFA造成的內(nèi)皮細(xì)胞毒性，進(jìn)而保護(hù)血管內(nèi)皮[17]。PGC-1α是AMPK下游效應(yīng)物，在能量壓力下，AMPK可激活PGC-1α，通過與PPARγ或雌激素相關(guān)受體（ERRs）相互作用激活線粒體生物合成的基因，這一途徑被認(rèn)為可能是修復(fù)和維持血管內(nèi)皮細(xì)胞線粒體功能的一項主要機制[18]。eNOS廣泛存在于內(nèi)皮細(xì)胞中，其激活可改善內(nèi)皮和血管功能，可通過調(diào)控內(nèi)皮源性一氧化氮產(chǎn)生的關(guān)鍵酶，促進(jìn)細(xì)胞增殖、黏附、遷移和血管新生[19]，另外在循環(huán)系統(tǒng)中eNOS是AMPK的一個重要靶標(biāo)。Caspase家族在細(xì)胞凋亡轉(zhuǎn)導(dǎo)通路尤其是線粒體途徑中起到至關(guān)重要的調(diào)控作用，其中caspase-3在凋亡過程中占據(jù)核心地位，被稱為“死亡執(zhí)行蛋白酶”，其激活標(biāo)志著細(xì)胞凋亡進(jìn)入不可逆階段[20-21]。

2型糖尿病大血管病變屬于中醫(yī)“消渴”變證，氣陰兩虛，陰損及陽，漸致痰濁瘀毒等病理產(chǎn)物積聚，絡(luò)瘀脈損。而瘀血貫穿于2型糖尿病大血管病變的始終，所以治療上把握脈絡(luò)瘀阻的主要病機。抵擋湯方出于《傷寒論》，原方由大黃、水蛭、桃仁、虻蟲組成，以善飲血之水蛭為君，善吮血之虻蟲為臣，善破諸經(jīng)瘀血之桃仁為佐，善行君令之將軍大黃為使，破血逐瘀，蕩滌邪熱，推陳出新。研究表明，二甲雙胍可阻礙細(xì)胞線粒體呼吸鏈復(fù)合體的電子傳遞過程，降低ATP合成，增加AMP水平，升高AMP/ATP比例，從而直接或間接激活A(yù)MPK[22-24]。本研究顯示，抵擋湯在持續(xù)高糖和高糖波動環(huán)境下均可磷酸化AMPK，上調(diào)eNOS、PGC-1α蛋白表達(dá)，減少內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，且與鹽酸二甲雙胍干預(yù)無差異，表明抵擋湯可通過影響線粒體合成和能量代謝，減少內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，從而保護(hù)血管內(nèi)皮，為臨床破血化瘀法論治糖尿病大血管病變提供了理論依據(jù)。