蔣晶晶，王春明，陳明，周昭旭，杜蕙

(1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，甘肅 蘭州 730070；2.農(nóng)業(yè)部天水作物有害生物科學觀測實驗站，甘肅 天水 741000)

植物內(nèi)生菌(Endophyte)普遍存在于植物體內(nèi)，定殖傳導，能經(jīng)受住植物自身的防衛(wèi)反應，對植物本身不造成明顯可見病害及功能改變.主要包括內(nèi)生真菌、內(nèi)生細菌和內(nèi)生放線菌[1-2].當前，植物內(nèi)生菌的研究已經(jīng)成為植物學、植物保護學、農(nóng)藥學等多個學科領域的研究熱點，具有重要的研究和開發(fā)價值.

近年來利用葡萄內(nèi)生菌防治葡萄病害的研究報道表明葡萄中存在能夠抑制葡萄病原菌生長的拮抗菌群，這些菌群是開發(fā)葡萄病原物微生物生防制劑的重要菌種來源.崔欣等[3]從葡萄果穗上分離得到2株對葡萄灰霉病優(yōu)勢拮抗的芽孢桿菌；周泠璇等[4]從紅提葡萄中分離出5株對葡萄灰霉病具有較好抑制效果的內(nèi)生細菌；劉旭等[5]發(fā)現(xiàn)葡萄內(nèi)生菌CS5對葡萄霜霉病具有很好的防效；于曉麗等[6]從葡萄葉片上分離獲得的菌株YTB1452對葡萄白腐病菌和葡萄炭疽病菌均具有較好的拮抗作用.但是，目前從葡萄不同組織中發(fā)掘內(nèi)生菌及利用微生物資源防治葡萄病害進行生物防治的研究仍比較少.

本研究從葡萄健康葉片中分離、純化的大量菌株中，挑選了對葡萄灰霉病菌、葡萄炭疽病菌有較好抑制作用的植物內(nèi)生細菌X1-6-1，初步測定其對另外6種重要農(nóng)業(yè)病害病原菌抑制作用.通過形態(tài)學觀察及基因分析初步明確菌株種屬關系，并對發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進行篩選優(yōu)化，為后期將生防菌制作成菌肥，更好地應用到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 拮抗內(nèi)生細菌X1-6-1：實驗室保存，從葡萄健康葉片中分離獲得.

供試植物病原菌共8種，分別是：1)油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)；2)葡萄灰霉病菌(Botrytiscinerea)；3)葡萄炭疽病菌(Colletortrichumgloeospriodes)；4)棉花炭疽病菌(ColletortrichumgossypiiSouthw)；5)西瓜蔓枯病菌(Didymellabryoniae)；6)馬鈴薯立枯病菌(Rhizoctoniasolani)；7)辣椒根腐病菌(Fusariumoxysporum)；8)大麥條紋病菌(Drechsleragraminea).均由甘肅省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所植物病理實驗室提供.

1.1.2 供試培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基、NA培養(yǎng)基、NA培養(yǎng)液(參照常規(guī)方法制備).

1.2 內(nèi)生拮抗細菌X1-6-1的鑒定

1.2.1 形態(tài)學及生理生化特性研究 參考東秀珠等[7]《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》和方中達[8]《植病研究方法》的研究方法，進行形態(tài)特征觀察、培養(yǎng)特性及生理生化特性測定.

1.2.2 16S rDNA鑒定 使用細菌基因組DNA提取試劑盒提取菌體DNA，通用引物27F/1492R進行PCR擴增，送上海生工生物科技有限公司進行測序.用BLAST軟件將所得序列與GenBank數(shù)據(jù)庫進行同源性比對分析，用DNAstar軟件進行多序列比對，并用Neighbor-Joining 法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定該菌株的分類地位.

1.3 內(nèi)生拮抗細菌X1-6-1抑菌活性及作用研究

采用平板對峙法，測定菌株對油菜菌核、葡萄灰霉等8種病原真菌菌絲生長的影響.取培養(yǎng)好的病原菌菌落邊緣的菌絲塊(d=5 mm)放在準備好的PDA平板中央，在培養(yǎng)皿背面距指示菌約2.5 cm處十字交叉法標記4點，分別在這4點接NA培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)48 h的菌株，以不點接生防菌為對照，置于27 ℃下培養(yǎng)，待到對照病菌長滿培養(yǎng)皿時，測量抑菌帶的寬度(即生防菌菌落邊緣到供試病原真菌菌落邊緣的距離)并計算抑制率，重復3 次，取平均值.

菌落生長抑制率(%)=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/ 對照菌落直徑×100

1.4 內(nèi)生拮抗細菌X1-6-1發(fā)酵培養(yǎng)基成分及條件優(yōu)化

1.4.1 種子液制備 將保存的X1-6-1菌株接入NA培養(yǎng)基平板上進行活化，28 ℃條件下培養(yǎng)24 h.再將活化的X1-6-1菌株接入NA液體培養(yǎng)液中，150 r/min，28 ℃條件下振蕩培養(yǎng)48 h，備用.

1.4.2 菌懸液濃度計算 釆用稀釋涂布平板法進行計算.即將培養(yǎng)好的X1-6-1菌株發(fā)酵液稀釋至10-6、10-7、10-8g/mL 3個質(zhì)量濃度梯度，分別吸取發(fā)酵液100 μL接入相應編號的培養(yǎng)皿中，用涂布棒涂抹均勻，每個稀釋濃度3次重復，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2 d，記錄平板內(nèi)的單菌落數(shù)，并計算發(fā)酵液濃度.公式如下：發(fā)酵液濃度(cfu/mL)=平板中的平均單菌落數(shù)(cfu)×該發(fā)酵液的稀釋倍數(shù)/平板上加菌量(mL)

采用分光光度計測定菌懸液的D值，以D600 nm值表示菌株生長量.D600 nm值在0.2～0.8比較準，不到該范圍的應用初始培養(yǎng)液進行稀釋，培養(yǎng)的實際的D值=所測D值×稀釋倍數(shù).

1.4.3 發(fā)酵培養(yǎng)基成分及條件優(yōu)化 發(fā)酵基礎培養(yǎng)基：牛肉膏3.5 g，蛋白胨5 g，酵母膏1.5 g，葡萄糖10 g，NaCl 5 g，水1 000 mL，pH 自然.

1.4.3.1 碳源的篩選 用葡萄糖、果糖、甘油、麥芽糖、甘露醇、蔗糖，可溶性淀粉等量替換發(fā)酵基礎培養(yǎng)基中的碳源，用量為1%.

1.4.3.2 氮源的篩選 用牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、氯化銨、硝酸銨、磷酸二氫銨、硝酸鉀，尿素作為氮源分別等量代替發(fā)酵基礎培養(yǎng)基中的氮源，用量為1%.

1.4.3.3 無機鹽的篩選 用氯化鈉、氯化鎂、硫酸鎂、硫酸鈣、碳酸鈣，磷酸氫二鉀作為無機鹽分別等量代替發(fā)酵基礎培養(yǎng)基中的氯化鈉，用量為0.5%.

向裝有100 mL培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中接入種子培養(yǎng)液1 mL，每個處理3次重復，28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)2 d，測定各碳源、氮源、無機鹽離子對X1-6-1菌株活菌量的影響.

1.4.4.4 發(fā)酵條件的優(yōu)化 在發(fā)酵時間、溫度、初始pH、轉(zhuǎn)速，裝液量分別為72 h、28 ℃、6.8、150 r/min，110 mL的基礎條件下，保持其他因素不變，只改變其中一個因素，設置發(fā)酵時間為6、12、24、36、48、60、72、84、96 h；溫度分別為20、25、28、30、35、40 ℃；初始pH分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0；轉(zhuǎn)速分別為60、90、120、150、180、210、240 r/min；裝液量分別為30、50、70、90、110、130 mL mL，以菌體生長量為指標，每組試驗重復3次進行單因素試驗.

根據(jù)單因素試驗結果，從中選擇對內(nèi)生拮抗菌X1-6-1菌體生長量影響較為顯著的因素(發(fā)酵時間、溫度和裝液量)，使用DPS軟件設計正交表，以OD600作為評價指標進行正交試驗，從而確定最佳發(fā)酵條件.

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2003、DPS 3.01、SPSS 17.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)均為3次重復的平均值.

2 結果與分析

2.1 菌株培養(yǎng)特性及生理生化特性

將菌株接種至PDA培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后，內(nèi)生拮抗細菌X1-6-1菌落呈乳白色不透明，表面粗糙有褶皺，邊緣不規(guī)則(圖1)，液體靜置培養(yǎng)時有菌膜形成；通過顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，革蘭氏染色陽性，菌體呈桿狀(圖2).

圖1 內(nèi)生拮抗細菌X1-6-1的菌落形態(tài)Figure 1 Colony of endogenous antagonistic bacterium X1-6-1

圖2 內(nèi)生拮抗細菌X1-6-1的革蘭氏染色反應Figure 2 Gram of endogenous antagonistic bacterium X1-6-1

根據(jù)常見微生物鑒定手冊可知，該內(nèi)生拮抗細菌符合解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)的生理生化特征.

2.2 分子生物學鑒定

菌株X1-6-1的16S rDNA的PCR擴增得到了1條1 500 bp左右大小的條帶，將測序所得到的1 464 bp DNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST比對.與其同源性較高的菌株均屬于芽孢桿菌屬，菌株X1-6-1與BacillusVelezensis、Bacillusamyloliquefaciens相似性超過99%，構建系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出與BacillusvelezensisCR-502T聚于一個分支，親緣關系較近.綜合形態(tài)觀察和生理特征及16S rDNA序列分析，將X1-6-1鑒定為貝萊斯芽孢桿菌(BacillusVelezensis).

表1 內(nèi)生拮抗細菌X1-6-1的生理生化特征

圖3 內(nèi)生拮抗細菌X1-6-1 16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 3 Phylogenetic tree of endogenous antagonistic bacterium X1-6-1 based on the 16S rDNA gene sequences

2.3 內(nèi)生拮抗細菌X1-6-1的抑菌作用測定

內(nèi)生拮抗細菌X1-6-1 對棉花枯萎等8種植物病原真菌表現(xiàn)出不同程度的抑菌效果(表2，圖4)，抑菌率為(49.1±0.9)%～(67.3±0.7)%，抑菌譜較廣.其中對油菜菌核病菌和葡萄炭疽病菌、葡萄灰霉病菌、棉花炭疽病菌和西瓜蔓枯病菌抑菌率均超過60%；對油菜菌核病菌、葡萄灰霉病菌和葡萄炭疽病菌抑菌帶超過5 mm.綜合抑菌率及抑菌帶寬度來看，內(nèi)生拮抗細菌X1-6-1對核盤菌屬、葡萄孢屬和炭疽菌屬的真菌抑制效果較好.

表2 內(nèi)生拮抗細菌X1-6-1對8種植物病原菌真菌的抑制作用

A-H分別為油菜菌核病菌、葡萄灰霉病菌、葡萄炭疽病菌、棉花炭疽病菌、西瓜蔓枯病菌、馬鈴薯立枯病菌、辣椒根腐病菌、大麥條紋病菌.A-H They respectively are Sclerotinia sclerotiorum，Botrytis cinerea，Colletortrichum gloeospriodes，Colletortrichum gossypii Southw，Didymella bryoniae，Rhizoctonia solani，F(xiàn)usarium oxysporum，Drechslera graminea.圖4 內(nèi)生拮抗細菌X1-6-1對8種植物病原真菌的拮抗譜Figure 4 Inhibition zoncs of endogenous antagonistic bacterium X1-6-1 against 8 pathogenic fungi

2.4 內(nèi)生拮抗細菌X1-6-1發(fā)酵培養(yǎng)基成分及條件優(yōu)化

單因素試驗表明不同培養(yǎng)基組分及培養(yǎng)環(huán)境對菌株生長量有不同程度的影響(圖5).對比OD600和活菌數(shù)可知菌株的最適培養(yǎng)基為：碳源為可溶性淀粉，氮源為牛肉膏，無機鹽為氯化鎂.最佳培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)時間60 h，裝液量90 mL，溫度25 ℃，轉(zhuǎn)速為210 r/min，pH 7.0.

2.5 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗

根據(jù)上述單因素試驗結果，各因素對X1-6-1菌體生物量都有影響，但影響較為顯著的因素有發(fā)酵時間(A)、培養(yǎng)溫度(B)和裝液量(C).設計正交試驗，進一步確定影響X1-6-1菌株菌體發(fā)酵各因素的最佳配比(表3).

R值(極差)的大小順序(RB>RC>RA)表明影響菌體生物量的因素強度由強到弱依次為培養(yǎng)溫度、裝液量和培養(yǎng)時間.K值反映每個因素在3個不同水平中菌體生物量的差異.從3個因素各自的K1、K2、K3中選擇最大值，獲得每個因素的最優(yōu)水平；結合K值，適合菌株X1-6-1菌體發(fā)酵的最優(yōu)組合為培養(yǎng)時間72 h、培養(yǎng)溫度25 ℃、裝液量110 mL、轉(zhuǎn)速210 r/min、pH為7.0.

A：不同碳源；B：不同氮源；C：不同無機鹽；D：不同培養(yǎng)時間；E：不同裝液量；F：不同溫度；G：不同轉(zhuǎn)速；H：不同pH.A:Different carbon source；B：Different nitrogen source；C：Different inorganic salt；D：Different culture time；E：Different broth content；F：Different temperature；G：Different rotate speed；H：Different pH.圖5 不同培養(yǎng)條件對X1-6-1菌體生長量的影響Figure 5 Effects of different culture conditions on growth of X1-6-1

表3 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗結果及極差分析

3 討論

芽孢桿菌屬由于其具有較好的抑制植物病原菌的能力，又因其產(chǎn)生的芽孢具有很強的抗逆性，有利于生防菌劑的生產(chǎn)、劑型加工及在環(huán)境中存活、定殖與繁殖被廣泛用于農(nóng)業(yè)領域[9-10].貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)是芽孢桿菌屬的一個新種，作為一種新型生防菌，在2008年被確定為解淀粉芽孢桿菌的后期異型體[11]，除具有與解淀粉芽孢桿菌相似的拮抗作用和誘導植株抗性作用外，還能產(chǎn)生最佳乳化活性的生物表面活性劑，對后期在植物和土壤中定殖具有很大的應用價值[12].近幾年，已有學者對貝萊斯芽孢桿菌進行了一些研究并報道，發(fā)現(xiàn)其對馬鈴薯枯萎病菌(Fusariumsolani)、灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)、黃單胞菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzicola，Xoc)、藍莓根腐病(Fusariumoxysporun)、棉花黃萎病菌(VerticilliumdahliaeKleb)、白菜黑斑病菌(Alternariabrassicae)等多種植物病害病原有一定的拮抗作用[13-18].由于其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有廣譜抗菌活性，是開發(fā)生物藥劑潛力較大的微生物.

本試驗獲得的內(nèi)生拮抗細菌B.velezensisX1-6-1抑菌譜較廣，抑制的病原菌種類涉及核盤菌屬(Sclerotinia)、炭疽菌屬(ColletotrichumCorda)、鐮孢菌屬(Fusarium)、葡萄孢屬(Botrytis)和絲核菌屬(Rhizoefonia).因此，拮抗內(nèi)生細菌X1-6-1是一株具有潛在應用前景的生防菌株.芽孢桿菌作為一類防治植物病害的重要生物資源，其主要抑菌物質(zhì)來源于自身產(chǎn)生的蛋白、脂肽、揮發(fā)類物質(zhì)，并能促使植株分泌一定的拮抗物質(zhì)及促生長物質(zhì)[19-22].后續(xù)研究將在本研究基礎上，分離純化菌株發(fā)酵液的主要抑菌活性成分，深入探究B.velezensisX1-6-1的抑菌機理、防病效應及其穩(wěn)定性.

發(fā)酵培養(yǎng)液不僅為生防菌株提供生長和繁殖所需的營養(yǎng)物質(zhì)，還是合成代謝產(chǎn)物的基礎.因此，發(fā)酵培養(yǎng)液的組分以及培養(yǎng)條件對充分發(fā)揮微生物生產(chǎn)能力具有關鍵作用.本研究從發(fā)酵培養(yǎng)基營養(yǎng)成分和發(fā)酵條件探究了菌株生長的最適條件.單因素試驗結果顯示，可溶性淀粉作為碳源，牛肉膏作為氮源，MgCl2作為無機鹽時最有利于X1-6-1菌體生物量的積累.在優(yōu)化發(fā)酵條件方面，采用正交設計優(yōu)化，結果表明X1-6-1菌株最適發(fā)酵條件為初始pH 7.0，培養(yǎng)時間72 h，溫度25 ℃，轉(zhuǎn)速為210 r/min，最佳裝液量為110 mL.有學者研究表明生防細菌的最優(yōu)碳源為葡萄糖[23]，而X1-6-1菌株在碳源為可溶性淀粉時產(chǎn)生的菌體生物量略高于葡萄糖，由此可見不同的生防細菌發(fā)酵最適培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件差異較大，對菌株進行培養(yǎng)基組分和發(fā)酵條件優(yōu)化很有必要.

4 結論

從葡萄葉片中分離獲得的內(nèi)生拮抗細菌X1-6-1為貝萊斯芽孢桿菌.該菌株最適培養(yǎng)基為：可溶性淀粉10.0 g/L，牛肉膏10.0 g/L，MgCl25.0 g/L；正交試驗優(yōu)化最佳培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)時間72 h，溫度25 ℃，初始pH值為7.0，轉(zhuǎn)速為210 r/min，最佳裝液量為110 mL.抑菌試驗表明B.velezensisX1-6-1對油菜菌核病菌和葡萄炭疽病菌、葡萄灰霉病菌、棉花炭疽病菌、西瓜蔓枯病菌、馬鈴薯立枯病菌和辣椒根腐病菌抑菌率均超過50%，對油菜菌核病菌、葡萄灰霉病菌和葡萄炭疽病菌抑菌帶超過5 mm.綜合來看，內(nèi)生拮抗細菌X1-6-1對核盤菌屬、葡萄孢屬和炭疽菌屬的真菌抑制效果較好，為下一步發(fā)酵液拮抗效果測定以及田間實際應用提供了理論參考.