張真,藺海明，2,杜弢，劉孜瀚,漢麗娟，栗孟飛

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，干旱生境作物學(xué)重點實驗室，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省老教授協(xié)會，甘肅 蘭州 730070；3.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；4.甘肅百草中藥材種植有限公司，甘肅 蘭州 730102；5.榆中縣人才交流服務(wù)中心，甘肅 蘭州 730100)

艾(ArtemisiaargyiLevl.et Van)為菊科(Compositae)蒿屬(Artemisia)多年生草本植物，主產(chǎn)濕潤與半濕潤地區(qū)，如河南南陽市、湖北蘄春縣[1].艾葉是我國常用中藥，歷史悠久，早在《神農(nóng)本草經(jīng)》既有記載，具有溫經(jīng)止血、散寒止痛、祛濕止癢等功效，常用于治療吐血、衄血、崩漏、月經(jīng)過多、胎漏下血、少腹冷痛、經(jīng)寒不調(diào)、宮冷不孕等癥[1-2].現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，艾葉具有抗菌、抗病毒、止血與抗凝血、抗腫瘤、抗過敏、抗氧化、鎮(zhèn)靜催眠、保肝利膽等作用[3].化學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，艾葉中主要含有揮發(fā)油(如蒎烯、水芹烯、1,8-桉葉素等)、黃酮類(如槲皮素、山萘酚、木犀草素等)、三萜類(如α-香樹脂、β-香樹脂、羽扇烯酮等)、桉葉烷類(如柳杉二醇、魁蒿內(nèi)酯、1-氧-4β-乙酰氧基桉葉-2，11 ( 13) -二烯-12，8β內(nèi)酯)、酚類(如綠原酸、朝鮮薊酸、間羥基安息香酸等)、多糖以及微量元素等[3-5].

基于艾葉在藥用、食用、日化等方面的廣泛用途，以及隨著大健康產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，需求量與日俱增，促使人工種植迅速發(fā)展，已形成了標(biāo)準(zhǔn)化的人工栽培技術(shù)[6].我國艾種質(zhì)資源豐富，菊科蒿屬艾組植物在我國有55 種，9變種，隸屬于16 個系中[1].艾生態(tài)適應(yīng)能力極強，產(chǎn)地分布極廣，除極干旱與高寒地區(qū)外，幾乎遍及全國，生于低海拔至中海拔地區(qū)的荒地、路旁河邊及山坡等地[7].課題組在前期深入調(diào)查研究的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)，我省艾野生資源豐富，盡管為我國中藥材資源大省和生產(chǎn)大省，但艾尚無大面積栽培；為了助力我省精準(zhǔn)脫貧，課題組聯(lián)合甘肅百草中藥材種植有限公司，結(jié)合榆中縣北山寒旱區(qū)優(yōu)勢資源(如光照充足、氣候寒旱、病蟲害少等)，通過初期引種栽培，全面分析和論證了發(fā)展綠色有機艾產(chǎn)業(yè)的可行性[8].

很多研究已表明，藥用植物的品質(zhì)形成受遺傳因子(內(nèi)因)和環(huán)境因子(外因)共同作用的影響[9].為了篩選適宜于寒旱區(qū)生態(tài)環(huán)境下的艾種質(zhì)資源，本研究引種3個不同生態(tài)型(甘肅隴原、河南南陽市、湖北蘄春縣)的艾種質(zhì)，栽培于榆中縣北山寒旱區(qū)，給予同一原生境生長環(huán)境，通過比較與分析艾葉中主要活性物質(zhì)含量、抗氧化能力及揮發(fā)性組分，旨在探明寒旱區(qū)生態(tài)環(huán)境對不同生態(tài)型艾品質(zhì)形成的影響，為進(jìn)一步的規(guī)模化種植提供直接的依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗材料

艾植株于2017年4月引種自3個不同生態(tài)產(chǎn)地(甘肅隴原區(qū)域、河南南陽市和湖北蘄春縣)，種植于甘肅百草中藥材種植有限公司黃蒿灣萬畝隴原艾產(chǎn)業(yè)園(榆中縣黃蒿灣村，海拔2 280 m，年平均氣溫7 ℃，降雨量230 mm，無霜期145 d)，原生境條件下生長，于2018年8月采集葉片，自然條件下陰干，研磨至粉末.

1.2 提取液的制備

將3.0 g粉末置于30 mL無水乙醇中，置于搖床振蕩提取(28℃、120 r/min)24 h后，室溫靜置2 h，收集上清液，連續(xù)提取3次后，合并提取液，在4℃、8 000 r/min下離心10 min，上清液經(jīng)減壓濃縮(500 mbar、70 ℃、150 r/min)至小體積，用超純水溶解并定容至100 mL；用乙酸乙酯(1∶1，V/V)連續(xù)萃取3次后，合并萃取相并減壓濃縮(500 mbar、50 ℃、150 r/min)至小體積；萃余相用正丁醇(1∶1，V/V)連續(xù)萃取3次后，合并萃取相并減壓濃縮(500 mbar、80℃、150 r/min)至小體積；乙酸乙酯和正丁醇萃取所得濃縮液分別用甲醇定容至9 mL，并用0.22 μm微孔濾膜過濾，用于活性物質(zhì)含量、抗氧化能力以及揮發(fā)性組分測定與分析.

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1 可溶性糖含量的測定采用硫酸-苯酚法測定可溶性總糖含量，參考Dubois等[10]和張真等[11]的方法測定.其中，萃取液樣品加樣量為2 μL，可溶性糖的含量以蔗糖為標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)定，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程C(μg) =30.91A-0.55 (R2=0.99).

1.3.2 黃酮類含量的測定采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉法測定黃酮類化合物的含量，參考張真等[11]和Ma等[12]的測定方法.其中，萃取液樣品加樣量為200 μL，黃酮類化合物的含量以兒茶素為標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)定，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程C(μg)= 203.15A-5.26 (R2=0.99).

1.3.3 酚類含量的測定采用福林酚試劑法測定酚類化合物的含量，參考張真等[11]和Beato等[13]的測定方法.其中，萃取液樣品加樣量為50 μL，酚類化合物的含量以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)定，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程C(μg) =32.67A+0.78 (R2=0.99).

1.3.4 抗氧化能力的測定 采用DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)和鐵離子還原/氧化能力(ferric reducing/antioxidant power，F(xiàn)RAP)兩種方法測定提取液的抗氧化能力.

DPPH法參考Nencini等[14]和Li等[15]的方法測定.其中，萃取液樣品加樣量為400 μL，抑制率的計算公式為：抑制率(%)=[(A0-A)/A0]×100%，式中，A為樣品溶液的吸光值，A0為不加樣品溶液的吸光值.

FRAP法參考張真等[11]、Li等[15]和Benzie等[16]的方法測定.其中，萃取液樣品加樣量為50 μL，樣品溶液的抗氧化能力以500 μmol/L Fe2+(FeSO4·7H2O) 為參比基礎(chǔ)，F(xiàn)RAP值計算公式為：

FRAP值 (μmol/L) =[(A-A0)/ (AFeSO4·7H2O-A0)] × 500 (μmol/L)

式中，A為樣品溶液的吸光值，AFeSO4·7H2O為FeSO4·7H2O溶液的吸光值，A0為不加樣品溶液的吸光值.

1.3.5 GC-MS分離與鑒定GC條件：儀器型號：Agilent 7890B-7000D(美國 Agilent Technologies Inc.)，非極性石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，柱溫50 ℃；升溫程序：5 ℃/min，升溫至200 ℃，然后以6 ℃/min的速率升溫至300 ℃并保持6 min；載氣為氦氣，流量1 mL/min；進(jìn)樣量4 μL，不分流.MS條件：EI離子源，離子源溫度230 ℃，進(jìn)樣口溫度280 ℃，四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV，質(zhì)子掃描范圍35～400 M/Z；發(fā)射電流100 μA，電壓1.4 kV.

1.4 數(shù)據(jù)分析

每個試驗重復(fù)3次，采用Microsoft Office Excel 2007軟件作圖，SPSS 11.5軟件進(jìn)行One-Way ANOVA Duncan數(shù)據(jù)差異顯著性分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生態(tài)型艾葉中可溶性糖、總黃酮和酚類含量比較

通過對不同生態(tài)型艾葉正丁醇和乙酸乙酯萃取液中可溶性糖、總黃酮和酚類含量進(jìn)行測定與分析，結(jié)果如圖1所示.可溶性糖含量在正丁醇萃取液中以南艾和蘄艾較高，在乙酸乙酯萃取液中以隴艾和蘄艾較高，2種萃取液總含量在南艾中最高(11.1 mg/g，以干物質(zhì)質(zhì)量計)，分別為隴艾和蘄艾的1.4和1.1倍(圖1-A)；3個生態(tài)型艾總黃酮含量在正丁醇萃取液中無顯著差異，在乙酸乙酯萃取液中隴艾顯著高于蘄艾和南艾，2種萃取液總含量在隴艾中最高(209.8 mg/g，以干物質(zhì)質(zhì)量計)，分別為南艾和蘄艾的1.5和1.2倍(圖1-B)；總酚含量在隴艾正丁醇和乙酸乙酯萃取液中均顯著高于南艾和蘄艾，2種萃取液總含量在隴艾中達(dá)到14.6 mg/g(以干物質(zhì)質(zhì)量計)，分別為南艾和蘄艾的1.5和1.7倍(圖1-C).

2.2 不同生態(tài)型艾葉抗氧化能力比較

通過對不同生態(tài)型艾葉正丁醇和乙酸乙酯萃取液抗氧化能力進(jìn)行測定與分析，結(jié)果如圖2所示.自由基抑制率在隴艾正丁醇和乙酸乙酯萃取液中分別為59.8%和94.1%，均顯著高于南艾和蘄艾，兩種萃取液總抑制率分別為南艾和蘄艾的1.21和1.24倍(圖2-A)；鐵離子還原/氧化能力在正丁醇萃取液中以南艾最高，隴艾和蘄艾之間無顯著差異，在乙酸乙酯萃取液中則以隴艾最高，南艾和蘄艾之間無顯著差異，兩種萃取液總鐵離子還原/氧化能力在隴艾達(dá)到9 483.2 μmol/L，分別為南艾和蘄艾的2.1和2.2倍(圖2-B).

不同小寫字母表示在同一萃取液中差異顯著(P<0.05).Different lowercase indicated significant at the same extracts at P<0.05 level.圖1 不同生態(tài)型艾葉中可溶性糖(A)、總黃酮(B)和酚類(C)含量的比較Figure 1 Comparison of contents of soluble sugar (A)，total flavonoids (B) and phenols (C) in different eco-types of Artemisia argyi

不同小寫字母表示在同一萃取液中差異顯著(P<0.05).Different lowercase indicated significant at the same extracts at P<0.05 level.圖2 不同生態(tài)型艾葉中自由基抑制率和鐵離子還原/氧化能力的比較Figure 2 Comparison of free radical inhibition rate (A) and ferric reducing antioxidant power (B) in different eco-types of Artemisia argyi

2.3 不同生態(tài)型艾葉揮發(fā)性組分比較

通過對不同生態(tài)型艾葉正丁醇和乙酸乙酯萃取液進(jìn)行GC-MS分離鑒定，結(jié)果分別見表1～2.表1結(jié)果顯示，3種生態(tài)型艾葉正丁醇萃取液中共含有190個揮發(fā)性組分，其中隴艾、南艾和蘄艾葉中分別含有97、90和91個，有23個化合物在3種生態(tài)型艾葉中共同存在，包括1-Octen-3-ol、Eucalyptol和α-Terpineol等.在所分離鑒定出的190個化合物中，38個已在前人研究中報道，包括 1-Octen-3-ol、Eucalyptol和Thujone等.表2結(jié)果顯示，3種生態(tài)型艾葉乙酸乙酯萃取液中共含有132個揮發(fā)性組分，其中隴艾、南艾和蘄艾葉中分別含有80、71和25個，有4個化合物在3種生態(tài)型艾葉中共同存在，分別為2,4-Di-tert-butylphenol、Ethanol，2-(9-octadecenyloxy)-，(Z)-、Hexadecanoic acid，ethyl ester和9-Desoxo-9-x-acetoxy-3,8,12-tri-O- acetylingol.在所分離鑒定出的132個化合物中，26個已在前人研究中報道，包括1-Octen-3-ol、Eucalyptol和1,5-Heptadien-4-ol，3,3,6-trimethyl等.

表1 不同生態(tài)型艾葉正丁醇萃取液中揮發(fā)性組分GC-MS分離與鑒定

表2 不同生態(tài)型艾葉乙酸乙酯萃取液中揮發(fā)性組分GC-MS分離與鑒定結(jié)果

3 討論

藥材在長期的栽培和人工選育過程中形成了不同的品種或農(nóng)家類型，其內(nèi)在品質(zhì)往往受種質(zhì)資源的影響，差異較大[9].同時，構(gòu)成品質(zhì)形成的代謝產(chǎn)物，如多糖類、萜類、生物堿類、苯丙烷類等，易受到生長環(huán)境的調(diào)控[22].通過對中國和韓國30個不同產(chǎn)地(湖南、浙江、福建、江蘇、廣西、四川、陜西、貴州、河北、河南、湖北、韓國首爾等)艾葉中揮發(fā)油、總黃酮和鞣質(zhì)的含量以及出絨率進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地艾葉中揮發(fā)油、總黃酮、鞣質(zhì)含量均存在一定的差異[23].通過對10個不同產(chǎn)地(河北、安徽、河南、甘肅、江西、廣西、陜西、山東、湖北、四川)艾葉中總酚酸含量進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地總酚酸的含量存在一定的差異[24].通過對5個不同產(chǎn)地(江蘇南通、湖北蘄春、浙江臺州、云南楚雄、新疆烏魯木齊)艾葉中揮發(fā)油組分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地艾葉揮發(fā)性成分也存在一定差異[21].以上前人研究結(jié)果充分說明，種質(zhì)資源和生長環(huán)境對代謝產(chǎn)物積累具有重要的影響.

本研究通過將3個不同生態(tài)型(甘肅隴原、河南南陽和湖北蘄春)的艾種質(zhì)資源引種至同一寒旱區(qū)生長環(huán)境，發(fā)現(xiàn)艾葉中可溶性糖、總黃酮和總酚含量、總抗氧化能力以及揮發(fā)性組分均存在一定的差異，除可溶性糖之外，隴艾葉中總黃酮和總酚含量、總抗氧化能力以及揮發(fā)性組分?jǐn)?shù)量均高于南艾和蘄艾.既然3個生態(tài)型艾處于同一生境，那么產(chǎn)生差異的可能原因主要有以下兩個方面：第一方面，種質(zhì)資源之間的差異造成了品質(zhì)形成的差異.目前，盡管《中國藥典》(2015)規(guī)定艾的基原植物品種為菊科植物艾Artemisia argyi Levl.et Vant[2]，但是在全國各地作為艾使用或混用的品種較多[1].長期的人工種植栽培，以及與野生資源的混合生長，促生了種間雜交或變異等.第二方面，隴艾長期生長于寒旱區(qū)的生態(tài)環(huán)境，使得其短時間內(nèi)較其他種源具有較強的寒旱區(qū)適應(yīng)能力，表現(xiàn)為品質(zhì)優(yōu)于南艾和蘄艾；盡管前人報道稱，蘄艾葉中總酚酸、揮發(fā)油、總黃酮和鞣質(zhì)的含量以及出絨率均高于其他產(chǎn)區(qū)[21，23-24].

本研究對寒旱區(qū)3個不同生態(tài)型艾葉中活性物質(zhì)含量以及抗氧化能力方面的測定與分析，表明隴艾在寒旱區(qū)有較好的品質(zhì)形成能力.研究結(jié)果可以為艾種質(zhì)資源選擇以及引種栽培提供直接的參考依據(jù)，但是針對長期馴化后品質(zhì)、產(chǎn)量以及其他評價指標(biāo)(如桉油精含量、揮發(fā)油總量、出絨率等)是否也存在顯著差異，以及不同生態(tài)型種質(zhì)資源的遺傳多樣性，還需要進(jìn)一步的深入與細(xì)致研究.