門倩云，張勇，李宗帥，申玉龍，李海江，楊洋，陳婷婷，王琪，趙興緒

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,甘肅 蘭州 730070)

奶牛乳腺炎(Cowmastitis)是危害奶牛養(yǎng)殖業(yè)的三大疾病之一，主要由病原微生物引起[1].目前研究發(fā)現(xiàn)，引起奶牛乳房炎的病原微生物種類繁多，包括細(xì)菌、真菌、病毒、支原體等200多種，其中細(xì)菌感染占主要因素[2].金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、鏈球菌(Streptococcus)和大腸桿菌(Escherichiacoli)是引起奶牛隱性乳房炎的3種主要細(xì)菌[3].其中大腸桿菌(E.coli)為埃希氏菌屬(Escherichia)的代表菌，被認(rèn)為是臨床型奶牛乳房炎的首要致病菌，廣泛存在外界環(huán)境中，可通過(guò)多種途徑侵入奶牛的乳房組織，引發(fā)炎癥反應(yīng)而導(dǎo)致奶牛乳房炎.大腸桿菌具有很多毒力因子[4-5]，包括毒素基因、毒力島基因、粘附素基因、溶血素基因、外膜蛋白基因等.這些毒力因子幫助大腸桿菌在機(jī)體內(nèi)完成了寄居、繁殖、致病的過(guò)程.大腸桿菌的致病性與攜帶的這些毒力基因有關(guān)[6-7].

大腸桿菌外膜蛋白不僅是一種結(jié)構(gòu)蛋白，而且是大腸桿菌的一種重要的毒力因子.外膜蛋白可作為免疫過(guò)程中的保護(hù)性抗原，可以幫助細(xì)菌抵抗宿主免疫流行性疾病，影響大腸桿菌侵入人體的過(guò)程.外膜蛋白基因選作制作亞單位疫苗的研究被很多學(xué)者認(rèn)為很有前景.fimH所編碼的fimH蛋白即菌毛黏附素是大腸桿菌常見(jiàn)的一種定居因子，能夠與甘露醇蛋白受體結(jié)合介導(dǎo)細(xì)菌與宿主細(xì)胞黏附.因此此定居因子具有較強(qiáng)的免疫原性，能刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體.trat蛋白是細(xì)胞外膜上的一種脂蛋白，被認(rèn)為在血清抵抗中起作用.trat蛋白不僅與表面清除有關(guān)，因?yàn)樗挥诩?xì)菌的外膜上，當(dāng)trat蛋白過(guò)度表達(dá)時(shí)，它會(huì)與調(diào)理素結(jié)合，并與細(xì)菌和病毒抗原結(jié)合，促進(jìn)宿主巨噬細(xì)胞的吞噬作用[8]，可作為研究的候選基因.本研究對(duì)張掖地區(qū)47份罹患乳房炎奶樣進(jìn)行了大腸桿菌的分離鑒定，藥敏試驗(yàn)，分析其耐藥性，檢測(cè)其所攜帶的毒力基因，并選取fimH，OmpF，trat，OmpC基因構(gòu)建原核表達(dá)載體，為后續(xù)制作張掖地區(qū)奶牛乳房炎大腸桿菌亞單位疫苗提供了生物素材.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器 電子天平，超凈工作臺(tái)(美國(guó)，THERMO)，恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)，正置光學(xué)顯微鏡(日本，OLYMPUS)，PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)，BIO-RAD)，凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)，BIO-RAD)，Eppendorf 5417離心機(jī)(Eppendorf，德國(guó))，DYY-12型電腦三恒多用電泳儀與DYCP-31A型電泳槽(北京六一儀器廠).

1.1.2 主要試劑 革蘭氏染色液、大腸桿菌生化鑒定管、LB培養(yǎng)液、MH-A瓊脂、伊紅美蘭瓊脂、麥康凱瓊脂，營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基等購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司，無(wú)菌脫纖維綿羊血購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司，細(xì)菌藥敏片購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司、細(xì)菌DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司、 PCR產(chǎn)物純化試劑盒和膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司，質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司， 2×EasyTaq PCR SuperMix(+dye)、 2000 DNA Marker、 8K DNA Marker、 DH5α購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，高保真DNA聚合酶購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司，HindⅢ-HF (R3104V)、BamHⅠ-HF (R3136S)內(nèi)切酶購(gòu)自 NEBiolabs(北京)， PET32a(+)質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室保存，引物由蘭州天啟基因生物科技有限公司和天津金唯智生物科技有限公司合成.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 乳樣的采集 用乳汁體細(xì)胞檢測(cè)法檢測(cè)了張掖地區(qū)8個(gè)牛場(chǎng)罹患隱性乳房炎的22頭牛，用毛巾清潔乳頭及周邊組織，依次用碘酊和75%酒精消毒，棄前3把乳汁，收集乳樣5～10 mL離心管中，封口膜封口冰浴運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，共采集到47份乳樣.

1.2.2 細(xì)菌的分離培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察 將奶樣接種于伊紅美蘭培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基進(jìn)行分離培養(yǎng).將分離得到的疑似大腸桿菌在普通培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)后分別接種至盛有10 mL普通營(yíng)養(yǎng)肉湯的凍存管中置于37 ℃熱恒溫?fù)u床上24 h進(jìn)行增菌并編號(hào)記錄D1， D2， D3， D4，…，共24株.挑選特征符合的單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢，革蘭氏陰性短桿菌者為疑似菌株，進(jìn)行后續(xù)的生化鑒定.

1.2.3 大腸桿菌的生化鑒定 革蘭氏染色后，經(jīng)油鏡鏡檢為革蘭氏陰性的小桿菌純化培養(yǎng)，將純化后的大腸桿菌菌株用無(wú)菌接種環(huán)移取少許純培養(yǎng)物，接種于細(xì)菌微量生化反應(yīng)管中，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，生化試驗(yàn)按《伯杰氏鑒定細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》與《伯杰氏分類細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》方法進(jìn)行[9]，鑒定各種反應(yīng)所需時(shí)間，觀察結(jié)果，查看生化反應(yīng)管中培養(yǎng)基顏色變化情況或者生化反應(yīng)管中是否有氣泡產(chǎn)生[10].其中包括溶血試驗(yàn)，糖發(fā)酵(葡萄糖/乳糖/蔗糖/甘露醇)試驗(yàn)，枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)，三糖鐵試驗(yàn)，MR/V-P試驗(yàn)，吲哚試驗(yàn)[11-13].

1.2.4 大腸桿菌的16 S rRNA鑒定 根據(jù)已發(fā)表的大腸桿菌16S～32S rRNA基因保守序列設(shè)計(jì)合成了引物[12]，上游5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游5′-TACGGCTACCTTGTTACGAC TT-3′；提取菌落形態(tài)、鏡檢結(jié)果符合大腸桿菌特征、生化鑒定結(jié)果為疑似的菌株基因組DNA，以其作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物送蘭州天啟基因生物科技有限公司測(cè)序.測(cè)序結(jié)果在NCBI中用BLAST程序進(jìn)行比對(duì)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).

1.2.5 藥物敏感性試驗(yàn) 采用紙片擴(kuò)散法(Kirby-Bauer)對(duì)大腸桿菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn).用無(wú)菌接種環(huán)蘸取大腸桿菌新鮮菌落，用無(wú)菌生理鹽水稀釋成0.5麥?zhǔn)媳葷岫?1.5×108CFU/mL)的大腸桿菌菌液.移液槍吸取100 μL輕輕涂抹于MH瓊脂平皿表面.平皿于超凈工作臺(tái)中靜置3～5 min，使其表面菌液晾干，用無(wú)菌的鑷子將藥敏紙片放置于平皿表面并輕輕按壓.每個(gè)平皿放4種藥敏紙片，每株菌設(shè)3個(gè)平行.將平皿倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h，最后用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈的直徑大小，記錄結(jié)果.結(jié)果判定：按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)(CLSI)，通過(guò)抑菌圈直徑的大小判定大腸桿菌對(duì)抗生素的敏感性.分為耐藥(R)、中介(I)和敏感(S).

1.2.6 大腸桿菌毒力基因的檢測(cè) 采用PCR技術(shù)，以24株大腸桿菌為研究對(duì)象，檢測(cè)引物參照文獻(xiàn)[14-16]合成毒力基因檢測(cè)引物，檢測(cè)其23種毒力因子(F17A，papC，sfaDE，fimH，afaD-8，STb，LT1，stx1，stx2，cnf1，cnf2，iucD，colV，hlyA，OmpC，OmpF，ECs3703，irp2，fyuA，eaeA，ler，afaE-8，trat).PCR擴(kuò)增條件： 95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，34個(gè)循環(huán);72 ℃終延伸10 min.擴(kuò)增體系:上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，2×Easy Taq PCR Super Mix酶10 μL，雙蒸水8 μL.PCR產(chǎn)物在含1%的瓊脂糖進(jìn)行電泳，用凝膠成像系統(tǒng)采集和保存圖像.

1.2.7 大腸桿菌主要毒力基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建 引物設(shè)計(jì)與合成：針對(duì)分離的24株大腸桿菌檢測(cè)到的主要毒力基因fimH、OmpF、trat和OmpC，根據(jù)GenBank已經(jīng)公布的它們的序列(fimH基因，序列號(hào)：AY392522.1；OmpF基因，序列號(hào)：CP046006.1；trat基因，序列號(hào)：MK878890.1和OmpC基因，序列號(hào)：CP016182.2)，利用Snapgene軟件設(shè)計(jì)引物并加入BamH Ⅰ-HF(AAGCTT)、HindⅢ-HF(GGATCC)酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物(表1)，引物由蘭州天啟基因生物科技有限公司合成.

表1 擴(kuò)增全長(zhǎng)的目的基因引物序列信息

1.2.8 大腸桿菌trat，OmpF，OmpC和fimH基因全序列擴(kuò)增和重組質(zhì)粒構(gòu)建 以分離鑒定的大腸桿菌DNA為模板，擴(kuò)增trat，OmpF，OmpC，fimH基因的全長(zhǎng)序列.擴(kuò)增體系(50 μL)如下：25 μL高保真DNA聚合酶，上下游引物各1 μL，模板1 μL，雙蒸水22 μL.擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，34個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min結(jié)束反應(yīng).PCR擴(kuò)增完成后，產(chǎn)物經(jīng)含1%的瓊脂糖凝膠電泳回收，將回收產(chǎn)物和 PET32a(+)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，體系(50 μL)如下：BamH Ⅰ-HF酶1 μL、Hind Ⅲ-HF酶1 μL，純化后目的產(chǎn)物25 μL，Cut Buffer 5 μL，雙蒸水18 μL，在37 ℃雙酶切2 h，雙酶切產(chǎn)物回收純化后經(jīng)T4 DNA Ligase連接，連接體系(20 μL)，T4DNA Ligase 1 μL，10×Ligase Buffer 2 μL，目的基因載體共5 μL，其中目的基因與載體比例為1∶3，雙蒸水12 μL，在16 ℃連接3 h，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，并均勻涂在含AMP+(100 mg/mL)的LB瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)16～18 h，利用PET32a(+)通用引物T7/T7-ter驗(yàn)證陽(yáng)性菌.陽(yáng)性菌增菌培養(yǎng)后提取質(zhì)粒并經(jīng)雙酶切鑒定正確后送天津金唯智生物有限公司測(cè)序，擴(kuò)全序列基因引物和驗(yàn)證陽(yáng)性菌引物(表1).重組質(zhì)粒分別命名為PET-32a-fimH、 PET-32a-OmpF、 PET-32a-trat和 PET-32a-OmpC.

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離純化培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察

本試驗(yàn)菌株在麥康凱培養(yǎng)基(圖1-A)上生長(zhǎng)出粉紅色的單一菌落；在伊紅美蘭培養(yǎng)基(圖1-B)上長(zhǎng)出黑色帶金屬光澤的單一菌.在普通培養(yǎng)基(圖1-C)上長(zhǎng)出無(wú)色單一的菌落，邊緣整齊、稍凸起、光滑并兼濕潤(rùn)；革蘭氏染色鏡檢(圖1-D)為粉紅色、短桿狀、兩端鈍圓.

A：麥康凱培養(yǎng)基菌落形態(tài)；B：伊紅美蘭培養(yǎng)基菌落形態(tài)；C：普通培養(yǎng)基菌落形態(tài)；D：大腸桿菌革蘭氏染色.A：Colony morphology of Mac Conkey medium；B：Colony morphology of eosin methylene blue medium；C：Colony morphology of common medium；D：Gram chromatogram of E.coli圖1 大腸桿菌鑒定Figure 1 Identification of Escherichia coli

2.2 生化試驗(yàn)結(jié)果

菌株經(jīng)生化鑒定大腸桿菌均能發(fā)酵葡萄糖、乳糖、蔗糖和甘露醇產(chǎn)酸并產(chǎn)氣；三糖鐵試驗(yàn)變黃；吲哚試驗(yàn)陽(yáng)性、 MR試驗(yàn)陽(yáng)性， V-P試驗(yàn)陰性、枸櫞酸鹽利用陰性結(jié)果見(jiàn)(表2)，表中(+為陽(yáng)性反應(yīng)；-為陰性反應(yīng)；⊕為產(chǎn)酸產(chǎn)氣).由生化鑒定結(jié)果(圖2)可知本試驗(yàn)分離菌株的生化特性與腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定結(jié)果基本保持一致.但有部分菌株在 M R試驗(yàn)中產(chǎn)生陰性反應(yīng)，在糖酵解反應(yīng)時(shí)有的菌株只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣或既不產(chǎn)氣也不產(chǎn)酸.

表2 生化鑒定結(jié)果分析

2.3 部分大腸桿菌16S r RNA鑒定

大腸桿菌生化鑒定試驗(yàn)結(jié)果中并不是每個(gè)菌株都符合大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)的試驗(yàn)結(jié)果(圖3)，從生化鑒定試驗(yàn)不完全符合標(biāo)準(zhǔn)的菌株中挑選了7株和符合大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)的1株進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在blast進(jìn)行序列比對(duì)，比對(duì)結(jié)果證明這8株都是大腸桿菌.

2.4 藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)分離的24株大腸桿菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果分析(圖4)：分離出的大腸桿菌對(duì)頭孢西丁、多粘菌素B、阿米卡星、頭孢曲松和妥布霉素高度敏感；對(duì)頭孢吡肟、頭孢噻吩、復(fù)方新諾明、氨曲南、頭孢噻肟和鏈霉素處于中介，對(duì)頭孢哌酮、頭孢吡肟、頭孢他啶、哌拉西林、慶大霉素、氧氟沙星和頭孢曲松處于多重耐藥，對(duì)頭孢唑啉、卡那霉素、氨芐西林和頭孢呋辛四種抗生素?zé)o明顯現(xiàn)象.

圖2 部分菌株生化鑒定Figure 2 Biochemical identification of some strains

M：DL2000；1～8:D1，D2，D3，D4，D5，D6，D7，D8.M：DL2000；1～8:D1，D2，D3，D4，D5，D6，D7，D8.圖3 部分菌株16 S rRNA擴(kuò)增結(jié)果Figure 3 Partial results of 16 S rRNA amplification

圖4 藥敏結(jié)果分析Figure 4 Analysis of drug sensitivity result

2.5 大腸桿菌毒力基因檢測(cè)結(jié)果

通過(guò)PCR對(duì)23種毒力基因進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖5)：iucD，OmpC，trat，ECs3703和OmpF的檢出率為100%， 的檢出率為96.15%，colv的檢出率為7.69%，cnf1的檢出率為4.34%，flyvA，STb，irp2，sfadE，cnf2，LT1，sfaDE，ler，afaD-8，afaE-8，eaeA，stx2，hlyA，F(xiàn)-17A和stx1均未檢出.

M：DL2000；1～8：fimH，Cnf1，iucD，OmpC，trat，ECs3703，OmpF，colv.M：DL2000；1～8：fimH，Cnf1，iucD，OmpC，trat，ECs3703，OmpF，colv.圖5 毒力基因PCR檢測(cè)結(jié)果Figure 5 PCR results of virulence gene

2.6 大腸桿菌trat，OmpF，OmpC和fimH基因全序列擴(kuò)增結(jié)果

本試驗(yàn)以提取的大腸桿菌基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增trat，OmpF，OmpC和fimH基因的全序列并回收，PCR回收產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè).結(jié)果顯示，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在750 bp和1 000 bp左右處有清晰明亮的DNA單一條帶(圖6)，與預(yù)期trat，OmpF，OmpC和fimH基因的全序列大小(732，1 074，1 104,903 bp)大致符合，經(jīng)克隆測(cè)序比對(duì)，結(jié)果是大腸桿菌的trat，OmpF，OmpC和fimH基因的全序列.

M：DL2000；1：trat；2：fimH；OmpF；OmpC.圖6 目的基因PCR擴(kuò)增Figure 6 PCR amplification of the target gene

2.7 重組PET-32a-fimH、 PT-32a-OmpF、 PET-32a-trat和PET-32a-OmpC質(zhì)粒的雙酶切鑒定結(jié)果

用BamH Ⅰ-HF和HindⅢ-HF在37 ℃雙酶切2 h后，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切產(chǎn)物，結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒比原質(zhì)粒PET-32a(+)略大(圖7)，且在1 000 bp以下、略大于1 000 bp和5 000 bp左右有特異性的2條帶，比較低的一條帶與預(yù)期trat，OmpF，OmpC和fimH基因的大小(732，1 074，1 104，903 bp)大致符合，經(jīng)天津金唯智生物工程有限公司測(cè)序，在PET-32a(+)載體的多克隆位點(diǎn)出現(xiàn)fimH、OmpF、trat和OmpC目的基因序列，將測(cè)序結(jié)果在BLAST與大腸桿菌的fimH基因(序列號(hào)：AY392522.1)、OmpF基因(序列號(hào)：CP051219.1)、trat基因(序列號(hào)：MK878890.1)和OmpC基因(序列號(hào)：CP016182.2)進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果顯示同源性為100%且未發(fā)生一個(gè)堿基突變，說(shuō)明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功.

A：fimH的雙酶切鑒定；B：OmpF的雙酶切鑒定；C：trat的雙酶切鑒定；D：OmpC的雙酶切鑒定；M：Marker；1：PET32a；2：重組質(zhì)粒雙酶切.A：PET32a-fimH by dual-enzyme digestion；B：PET32a-OmpF by dual-enzyme digestion；C：PET32a-trat by dual-enzyme digestion；D：PET32a-OmpC by dual-enzyme digestion.M：Marker 1：PET32a；2：Double enzyme digestion of recombinant plasmid.圖7 雙酶切鑒定Figure 7 Double digestion verification

3 討論

奶牛乳房炎是影響奶牛生產(chǎn)性能的重要群發(fā)普通疾病之一，在其眾多致病菌中大腸桿菌是臨床型奶牛乳房炎中分離率高居首位的細(xì)菌[17-18].本試驗(yàn)分離出的菌落形態(tài)和鏡檢結(jié)果符合大腸桿菌的菌株生物特性的菌株，經(jīng)溶血試驗(yàn)檢測(cè)均為β溶血.生化鑒定中有部分菌株在甲基紅試驗(yàn)中產(chǎn)生陰性反應(yīng)，在糖酵解反應(yīng)時(shí)只產(chǎn)氣不產(chǎn)酸或只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，但將這幾株不完全符合大腸桿菌生化鑒定標(biāo)準(zhǔn)的菌株進(jìn)行16S rRNA測(cè)序鑒定結(jié)果均為大腸桿菌.因此我們可以利用細(xì)菌的保守區(qū)域16S rRNA，通過(guò)基因分析來(lái)鑒定細(xì)菌的種屬，判斷細(xì)菌的變異情況，為疾病的防控提供更加詳細(xì)的分子生物信息.藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示：分離的24株大腸桿菌對(duì)20種抗生素的敏感度試驗(yàn)中，其中24株對(duì)頭孢西丁和多貼菌素B十分敏感，其中20株對(duì)阿米卡星高度敏感、17株對(duì)妥布霉素物高度敏感，11株大腸桿菌對(duì)慶大霉素和氧氟沙星表現(xiàn)出多重耐藥現(xiàn)象，這與文獻(xiàn)報(bào)告十分相似[14].奶牛乳房炎的病原菌一般具有地域性，不同地區(qū)分離菌株對(duì)抗生素的敏感性跟耐藥性也會(huì)有差異.因此本試驗(yàn)藥敏結(jié)果對(duì)張掖地區(qū)部分奶牛場(chǎng)患乳房炎的奶牛的臨床用藥也具有一定的參考意義.

有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌缺乏致病性，通常與E.coli的毒力相關(guān).毒力與毒力基因存在必要的相對(duì)應(yīng)性，毒力基因是致病菌的致病性和代謝活性相互依賴的表達(dá)[19].在不同菌株之間觀察到的致病性差異可能與大腸桿菌的毒力基因和奶牛個(gè)體相關(guān)，本試驗(yàn)所檢測(cè)的毒力基因iucD，OmpC，trat，ECs3703和OmpF的檢出率為100%，fimH的檢出率為96.15%，colV的檢出率為7.69%，cnf1的檢出率4.34%，這些毒力基因在分離的菌株中部分或全部被檢測(cè)到.張澤輝在遼寧地區(qū)乳房炎源大腸桿菌毒力基因進(jìn)行篩選時(shí)，其主要流行的毒力基因?yàn)镺mpC(100%)，fimH(89.9%)，ECs3703(88.6%)，OmpF(73.4%)[19]，這一結(jié)果與本試驗(yàn)基因檢測(cè)率相似，均有較高的檢測(cè)率，這可能與菌屬的基因型有關(guān)，推測(cè)兩地區(qū)大腸桿菌的基因型表現(xiàn)出高度相似.在普通大腸桿菌和致病性大腸桿菌以及其他腸道細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的最常見(jiàn)的粘附素是1型菌毛fimH基因，它們對(duì)生物膜的形成有影響.這一發(fā)現(xiàn)與本試驗(yàn)的結(jié)果一致，fimH基因在所分離出的菌株中有很高的檢測(cè)率.

外膜蛋白對(duì)細(xì)菌抵抗有害物質(zhì)或不利環(huán)境起著重要作用，它能夠保護(hù)細(xì)菌細(xì)胞免受或減少多種有害物質(zhì)的影響，外膜蛋白形成的非特異性的離子通道對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和排泄自身代謝廢物也起著關(guān)鍵作用[18].本試驗(yàn)檢測(cè)出的大腸桿菌的外膜蛋白OmpC、OmpF可作為后期亞單位疫苗的候選蛋白，并具有很大的產(chǎn)品化潛力.fimH蛋白即菌毛黏附素是具有較強(qiáng)的免疫原性，能刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體[16].trat基因也編碼外膜蛋白，被認(rèn)為在血清抵抗中起作用[20]，也可以作為候選蛋白.本試驗(yàn)選擇fimH，OmpF，trat和OmpC基因成功構(gòu)建原核表達(dá)載體，為進(jìn)一步研發(fā)奶牛乳房炎大腸桿菌亞單位基因工程疫苗提供了生物素材，有一定的臨床應(yīng)用前景.

4 結(jié)論

1) 本試驗(yàn)成功從張掖地區(qū)奶牛場(chǎng)采集的47份乳樣中分離并鑒定出24株大腸桿菌，大腸桿菌也是該地區(qū)奶牛乳房炎感染的優(yōu)勢(shì)菌群.

2) 藥敏結(jié)果建議頭孢西丁、多貼菌素B、阿米卡星和妥布霉素這四種藥可作為張掖地區(qū)治療奶牛乳房炎的首選抗生素藥物.

3) 本試驗(yàn)對(duì)大腸桿菌的23種毒力基因進(jìn)行了檢測(cè)，檢出率分別為OmpC(100%)，OmpF(100%)，iucD(100%)，ECs3703(100%)，trat(100%)，fimH(96.15%)，colv(7.69%)和cnf1(4.34%).

4) 成功克隆了大腸桿菌的trat、fimH、OmpF和OmpC基因，構(gòu)建了PET-32a-fimH、PET-32a-OmpF、PET-32a-trat和PET-32a-OmpC原核表達(dá)載體.