,*

(1.廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品生物與技術(shù)學(xué)院,廣東廣州 510300;2.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,廣東廣州 510641;3.廣東太陽神集團(tuán)有限公司,廣東廣州 510665)

猴頭菇亦稱猴頭菌(Hericiumerinaceus(Rull ex F.)Pers.),是一種外形獨(dú)特、營養(yǎng)豐富且功效多樣的食用菌資源,是我國珍貴的藥食兼用真菌,又稱猴頭菌、猴頭、猴菇、猴蘑[1-3]。猴頭菇的主要活性成分包括多糖、寡糖、甾醇類、萜類和酚類等,我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為其性平、味甘、益五臟,具有助消化的作用,現(xiàn)代醫(yī)學(xué)還發(fā)現(xiàn)其具有提高免疫力、抗腫瘤、抗衰老、降血脂等多種保健功能[5-6]。

近些年來,現(xiàn)代食藥工業(yè)為猴頭菇的產(chǎn)品化注入了新的活力,例如猴菇米稀、猴菇酥性餅干、猴頭健胃靈膠囊、猴頭菇胃腸保健口服液、猴頭菇口服液以及猴菇飲等[7]。其中,猴頭菇口服液產(chǎn)品的生產(chǎn)由來已久,而且受眾廣泛且不斷推陳出新?？诜寒a(chǎn)品的主要功效包括養(yǎng)胃和中以及輔助保護(hù)胃黏膜[8-9],其主要活性成分猴頭菇多糖的生物活性、入藥機(jī)理及潛在的應(yīng)用途徑也被進(jìn)行了大量研究[10-12]。但是,關(guān)于猴頭菇口服液產(chǎn)品之間的功效比較方面研究卻鮮有報(bào)道。

本研究以猴頭菇口服液為研究對(duì)象,基于大鼠胃黏膜損傷模型評(píng)估三種猴頭菇口服液對(duì)胃黏膜損傷的保護(hù)作用,并對(duì)損傷指標(biāo)的差異進(jìn)行全面系統(tǒng)的闡述。以期為消費(fèi)者在此類產(chǎn)品的功效篩選方面提供理論依據(jù),又為科研人員在構(gòu)建大鼠胃黏膜損傷模型方面提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

猴頭菇口服液A(產(chǎn)品主要原料為猴頭菇,輔料為雞與蛇,提取工藝為高溫水提,多糖含量≥120 mg/100 mL,批號(hào)20161021,下文簡稱口服液A)、猴頭菇口服液B(產(chǎn)品主要原料為猴頭菇,輔料為雞,提取工藝為先酶解再高溫水提,多糖含量≥200 mg/100 mL,批號(hào)20161021,下文簡稱口服液B) 廣東太陽神集團(tuán)有限公司提供;猴菇飲口服液 湖北東信藥業(yè)有限公司生產(chǎn),產(chǎn)品主要原料為猴頭菇,國藥準(zhǔn)字Z42020182,批號(hào)151215,下文簡稱猴菇飲;硫糖鋁 上海旭東海普藥業(yè)有限公司生產(chǎn),國藥準(zhǔn)字H10950279,批號(hào)KF151007;實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠,SPF級(jí),體重200～230 g,中山大學(xué)(大學(xué)城)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(粵)2011-0029;無水乙醇 南京化學(xué)試劑股份有限公司;95%乙醇 天津市富宇精細(xì)化工有限公司;乙酸(AR級(jí))、氯化鈉、NaH2PO4·2H2O 廣州化學(xué)試劑廠;Na2HPO4·12H2O 甲醛天津市福晨化學(xué)試劑廠;中性樹膠 廣州市秀威貿(mào)易有限公司;TO型生物透明劑 廣西岑溪市松香廠;蘇木素 Fluka上?；瘜W(xué)試劑公司;伊紅 Ameresco公司。

BS110S電子天平 北京賽多利斯天平有限公司;ACS-1A1型電子計(jì)量秤 深圳愛華衡器有限公司;OLYMPUS SZ61型體視顯微鏡、OLYMPUS CX31型顯微鏡 日本OLYMPUS公司;MICROM HM450電腦程控式切片機(jī) 德國MICROM公司;TB-718生物組織自動(dòng)包埋機(jī)、TC-120組織自動(dòng)脫水機(jī) 孝感市泰維電子公司;BI2000圖像處理系統(tǒng) 成都泰盟科技有限公司;DM5000B型正置熒光顯微鏡 德國LEICA公司;全自動(dòng)菌落分析儀 杭州訊數(shù)科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大鼠急性胃粘膜損傷模型的構(gòu)建與治療

1.2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 選取健康的SD雌性大鼠144只,體重200～230 g,大鼠隨機(jī)分成12組,每組12只,分別為正常組,乙醇模型組,口服液A低、中、高劑量組,口服液B低、中、高劑量組,猴菇飲低、中、高劑量組以及硫糖鋁陽性對(duì)照組。

1.2.1.2 給藥方案 采用預(yù)先給藥的方式。正常組、模型組及陽性對(duì)照組的每日給藥劑量相同,不同的是前兩者給予等體積的純凈水,其余組別的給藥劑量見表1;全部樣品均經(jīng)口灌胃給藥,每日定時(shí)給藥1次,其中,硫糖鋁陽性對(duì)照組在造模前一周開始給藥(給藥1周),余下各組灌胃給藥30 d。

表1 按體重系數(shù)等效換算的給藥劑量Table 1 Equivalent conversion of the dose according to the body weight coefficient

1.2.1.3 大鼠胃黏膜大體形態(tài)觀察、組織病理學(xué)檢查 在各組大鼠給藥結(jié)束后,將大鼠禁食24 h(不禁水)。除正常對(duì)照組外,其余各組大鼠灌胃給予無水乙醇,劑量為1 mL/只。1 h后處死動(dòng)物,暴露完整胃,結(jié)扎幽門,灌注適量10%甲醛溶液,固定20 min,然后沿胃大彎剪開,洗凈胃內(nèi)容物,展開胃粘膜,置于體視顯微鏡下觀察。大體形態(tài)觀察完畢后,將每只動(dòng)物胃粘膜損傷最嚴(yán)重的部位切下,固定于10%甲醛溶液,常規(guī)制片,蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin staining,HE)染色,脫水,封片,鏡下觀察。

1.2.1.4 急性損傷指標(biāo)測定 胃黏膜急性損傷指標(biāo)主要包括胃粘膜充血面積、損傷積分指數(shù)、損傷發(fā)生率、損傷抑制率以及胃黏膜鏡下積分[13]。

胃粘膜充血面積=出血帶長度×出血帶寬度,評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2;

表2 急性損傷肉眼觀察評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Scoring criteria for visual observation of acute injury

損傷總積分=A+B+C×2

式中,A、B、C分別為出血點(diǎn)分值、出血帶長度分值及出血帶寬度分值;

損傷積分指數(shù)=某組損傷評(píng)分總和/該組動(dòng)物數(shù)量;

損傷發(fā)生率(%)=某組出現(xiàn)出血充血的大鼠數(shù)量/該組大鼠數(shù)量×100;

式中,A、B分別為模型組與實(shí)驗(yàn)組的損傷積分;

胃黏膜鏡下積分:以胃黏膜病變部位為研究對(duì)象,選擇胃粘膜正橫切面,包括粘膜全層的區(qū)域觀察,評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表3;

表3 急性損傷鏡下觀察評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 3 Scoring criteria for microscopic observation of acute injury

病變總積分=A+B×2+C×3

式中,A、B、C分別為充血積分、出血積分及上皮細(xì)胞變性壞死積分。

1.2.2 大鼠慢性胃粘膜損傷模型的構(gòu)建與治療

1.2.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 選取健康的SD雌性大鼠144只,體重200～230 g,檢疫7 d。具體的建模方式如下[14-19]:將全部動(dòng)物禁食24 h(不禁水),之后用10%水合氯醛麻醉后實(shí)施剖腹手術(shù),消毒腹部,于劍突下切開腹腔,將胃輕輕拉出腹腔外,假手術(shù)組于胃幽門處漿膜下,采用微量注射器注射50 μL的滅菌生理鹽水,其它組別在同一部位局部注射50 μL的60%乙酸溶液,縫合切口。每只大鼠術(shù)后肌內(nèi)注射青霉素2000 U,且連續(xù)抗生素處理3 d,直至傷口完全愈合。術(shù)后第2 d,將大鼠隨機(jī)分成12組,每組12只,分別為假手術(shù)組,乙酸模型組,口服液A低、中、高劑量組,口服液B低、中、高劑量組,猴菇飲低、中、高劑量組以及硫糖鋁陽性對(duì)照組。

1.2.2.2 給藥方案 假手術(shù)組、模型組及陽性對(duì)照組的每日給藥劑量相同,不同的是前兩者給予等體積的純凈水,其余組別的給藥劑量同1.2.1.2,全部樣品均經(jīng)口灌胃給藥,每日給藥1次,連續(xù)給藥7d。

1.2.2.3 胃黏膜大體形態(tài)觀察 在各組大鼠給藥結(jié)束后,將大鼠禁食24 h(不禁水),之后處死動(dòng)物,取出整個(gè)胃浸泡于10%的甲醛內(nèi),浸泡20 min后沿胃小彎剪開,洗凈內(nèi)容物,取腺胃區(qū)展開平鋪于玻璃板上,用紙吸干潰瘍內(nèi)的水分,置于顯微鏡下觀察。

1.2.2.4 慢性潰瘍指標(biāo)測定 胃黏膜慢性損傷在體內(nèi)表現(xiàn)為潰瘍,潰瘍指標(biāo)主要為潰瘍面積。將洗凈內(nèi)容物后的不含水分的胃黏膜置于全自動(dòng)菌落分析儀中觀察并對(duì)胃潰瘍組織進(jìn)行拍照,利用圖像處理系統(tǒng)分析并測量潰瘍底部的面積。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,運(yùn)用student t檢驗(yàn)評(píng)價(jià)顯著性水平,P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 口服液樣品對(duì)大鼠急性胃粘膜損傷的保護(hù)作用

2.1.1 口服液樣品對(duì)胃黏膜大體形態(tài)及病變組織的影響 如圖1所示,正常組大鼠胃黏膜紅潤,無出血點(diǎn)或出血帶;模型組胃黏膜局部腫脹,有清晰可辨的出血帶,充血嚴(yán)重;陽性組胃黏膜無明顯的出血帶,局部有輕微的充血現(xiàn)象。此外,在三種口服液處理組中,樣品對(duì)胃黏膜形態(tài)的保護(hù)呈現(xiàn)出典型的量效關(guān)系,即同模型組比較,隨著口服液樣品的劑量升高,無水乙醇對(duì)大鼠胃黏膜的損傷程度減弱。

圖1 不同組別大鼠的胃黏膜大體形態(tài)Fig.1 General morphology of gastric mucosa of rats in different groups

選取大鼠胃黏膜的病變部位,制成組織切片,之后進(jìn)行HE染色。如圖2所示,正常組大鼠胃黏膜細(xì)胞緊實(shí)、密集,細(xì)胞的藍(lán)紫色較深,胃黏膜形態(tài)完整、邊界清晰;模型組胃黏膜細(xì)胞排列松散、碎片化嚴(yán)重,空腔細(xì)胞成片聚集,胃黏膜呈現(xiàn)病理性腫脹;陽性組胃黏膜細(xì)胞排列較為緊密,局部出現(xiàn)空腔細(xì)胞,胃黏膜輕微腫脹且邊界清晰。此外,在三種口服液處理組中,樣品對(duì)胃黏膜病理癥狀的緩解呈現(xiàn)出典型的量效關(guān)系,即同模型組比較,隨著口服液樣品的劑量升高,無水乙醇對(duì)大鼠胃黏膜的病理性損傷減弱。

圖2 不同組別大鼠胃黏膜HE染色(40×)Fig.2 HE staining pictures of gastric mucosa of rats in different groups(40×)

2.1.2 口服液樣品對(duì)胃黏膜急性損傷指標(biāo)的影響 由表4可知,模型組大鼠胃黏膜出血充血嚴(yán)重,并且其胃黏膜充血面積、損傷積分指數(shù)及胃黏膜鏡下積分等多項(xiàng)損傷指標(biāo)均偏高;中、高劑量口服液A,高劑量口服液B以及高劑量猴菇飲的損傷積分指數(shù)均明顯降低,能夠不同程度地緩解乙醇誘致的大鼠胃粘膜出血充血程度,與同期乙醇模型組相比,具有顯著性差異(相應(yīng)的P值分別為P<0.05、P<0.01、P<0.001及P<0.01);高劑量口服液A,低、中、高劑量口服液B以及低、中、高劑量猴菇飲的胃粘膜鏡下積分明顯減少,與同期乙醇模型組相比,具有顯著性差異(相應(yīng)的P值分別為P<0.001、P<0.01、P<0.05、P<0.001、P<0.01、P<0.01及P<0.001);硫糖鋁陽性對(duì)照組大鼠的胃粘膜出血情況明顯減輕,并且其損傷積分指數(shù)、胃黏膜鏡下積分均明顯降低,與同期乙醇模型組相比,具有顯著性差異(相應(yīng)的P值分別為P<0.001及P<0.001)。

表4 口服液樣品對(duì)大鼠胃黏膜急性損傷指標(biāo)的影響Table 4 Effects of oral liquid samples on the indexes of acute injury of gastric mucosa in rats

上述結(jié)果表明,三種口服液樣品對(duì)胃粘膜均具有不同程度的保護(hù)作用,這種作用雖然不及臨床使用的陽性藥物,但卻較好地緩解了胃黏膜急性損傷。其中,高劑量口服液B能夠極顯著地降低胃黏膜損傷積分指數(shù)及胃黏膜鏡下積分,因此在治療或保護(hù)胃黏膜急性損傷方面,口服液B最佳。

2.2 口服液樣品對(duì)大鼠慢性胃粘膜損傷的保護(hù)作用

2.2.1 口服液樣品對(duì)胃黏膜大體形態(tài)的影響 在慢性損傷試驗(yàn)中,不同樣品對(duì)大鼠胃黏膜的大體形態(tài)的影響如圖3所示。假手術(shù)組大鼠胃黏膜色澤鮮麗,無淤青無囊腫;模型組的胃黏膜淤青聚集,出現(xiàn)較大面積的囊腫、潰爛;陽性組的胃黏膜色澤微暗,無明顯的淤青、囊腫。此外,在三種口服液處理組中,樣品對(duì)胃黏膜形態(tài)的保護(hù)呈現(xiàn)出典型的量效關(guān)系,即同模型組比較,隨著口服液樣品的劑量升高,乙酸誘導(dǎo)的大鼠胃黏膜的潰瘍程度減弱。

圖3 不同組別大鼠的胃黏膜大體形態(tài)Fig.3 General morphology of gastric mucosa of rats in different groups

2.2.2 口服液樣品對(duì)胃黏膜慢性潰瘍指標(biāo)的影響 不同樣品對(duì)乙酸誘導(dǎo)的大鼠慢性胃粘膜損傷的保護(hù)作用主要體現(xiàn)在對(duì)慢性潰瘍指標(biāo)的影響,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表5所示。假手術(shù)組大鼠胃粘膜的潰瘍面積幾乎可以忽略,故在實(shí)驗(yàn)中沒有計(jì)算出潰瘍面積;乙酸模型組大鼠的胃漿膜層下注射乙酸溶液后發(fā)生明顯的潰瘍,其潰瘍面積明顯升高;與同期模型組比較,中、高劑量的口服液A以及高劑量的猴菇飲可以明顯減少大鼠的胃潰瘍面積,具有顯著性差異(相應(yīng)的P值分別為P<0.01、P<0.001及P<0.05);然而,與同期模型組比較,陽性藥物硫糖鋁并不能夠明顯減少大鼠的胃潰瘍面積,在數(shù)值上無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。上述結(jié)果表明,口服液A在治療或保護(hù)胃黏膜慢性損傷方面具有良好的效果。

表5 口服液樣品對(duì)大鼠胃黏膜慢性潰瘍指標(biāo)的影響Table 5 Effects of oral liquid samples on the indexes of chronic ulcer of gastric mucosa in rats

3 討論與結(jié)論

本文研究了三種不同的猴頭菇口服液對(duì)大鼠胃黏膜損傷的保護(hù)功效。在大鼠胃黏膜急性損傷模型中,三種口服液樣品能夠不同程度地保護(hù)胃粘膜,低濃度的三種樣品對(duì)胃黏膜的保護(hù)功效差別不大;然而,高濃度樣品的功效差異明顯,其中,口服液B的功效最佳,其療效優(yōu)于猴菇飲、次于硫糖鋁。在大鼠胃黏膜慢性損傷模型中,口服液A的護(hù)胃效果較好,能夠促進(jìn)慢性胃潰瘍的創(chuàng)傷愈合及修復(fù);猴菇飲的功效次之;口服液B的護(hù)胃效果較弱,與同期模型組相比,其僅在胃潰瘍面積的平均值方面有減少的趨勢,但并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著性差異。

文中涉及的動(dòng)物模型為大鼠胃黏膜損傷模型,其實(shí),關(guān)于此類模型的構(gòu)建并不簡單。急性胃粘膜損傷模型的構(gòu)建在文獻(xiàn)中屢有報(bào)道[20-22],難度相對(duì)較低。而慢性胃黏膜損傷模型的構(gòu)建涉及動(dòng)物手術(shù),難度偏大且建模成功率較低;具體來講,乙酸誘導(dǎo)大鼠慢性胃粘膜損傷的模型成功與否關(guān)鍵在于是否將乙酸溶液完全注射在漿膜層以下[23-24],由于胃壁含有非富的血管,胃組織被乙酸腐蝕后即發(fā)生壞死及出血,注射后第二天大鼠出現(xiàn)胃穿孔現(xiàn)象,隨著時(shí)間的延長,粘膜層開始修復(fù),包圍底部形成脊形態(tài),同時(shí)胃底部肌層逐漸生長并形成疤痕。本文中測量的胃潰瘍面積即是脊(再生粘膜層)的底部,胃潰瘍體積為與脊平齊的注入液體的體積。雖然已有報(bào)道探究了猴頭菇口服液對(duì)胃上皮細(xì)胞的保護(hù)作用[25]以及猴頭菇胃腸保健口服液對(duì)HAART藥物所致胃腸道反應(yīng)的療效[26],但是本文的研究內(nèi)容仍有獨(dú)特之處,即在既往研究的基礎(chǔ)上完善了不同猴頭菇口服液產(chǎn)品的護(hù)胃功效的評(píng)價(jià)體系。

綜上所述,本文成功構(gòu)建了大鼠胃黏膜損傷模型并基于此評(píng)估了不同的猴頭菇口服液的護(hù)胃功效,但不同產(chǎn)品功效各異。猴菇飲口服液作為非處方藥,效用相對(duì)溫和一些,對(duì)急、慢性胃黏膜損傷都有溫和的保護(hù)作用;猴頭菇口服液B、猴頭菇口服液A分別對(duì)急性胃黏膜損傷、慢性胃黏膜損傷有良好的保護(hù)作用。使上述產(chǎn)品存在差異的原因可能在于產(chǎn)品配方、提取工藝及多糖濃度,本文的研究結(jié)果可為開發(fā)具有胃黏膜損傷保護(hù)作用的功能食品、保健食品及藥品提供科學(xué)的參考價(jià)值。