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(1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,福建福州 350002;2.福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心,福建福州 350002)

2-苯基乙醇是一種玫瑰香型的風(fēng)味物質(zhì),世界每年產(chǎn)量約10000噸[1],有抑菌、抗腫瘤、強心的作用[2-4];它還是合成一些高附加值藥物比如苯乙醇苷的底物,故2-苯基乙醇在醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域也有重要應(yīng)用[5]。除此之外,2-苯基乙醇作為香味物質(zhì)在飲料[6]、香水以及化妝品[7]中應(yīng)用較多。天然2-苯基乙醇可以在玫瑰花瓣中提取得到,但是成本過高,得率較低[8-9],因此目前主要通過化工合成的方式來獲得,由于化工合成的過程中會含有苯類以及乙烯類有毒有害物質(zhì),添加到食品中會對食品安全造成一定的威脅[10-11],因此生物合成2-苯基乙醇的方式成為當(dāng)今研究的熱點。

目前發(fā)現(xiàn)生物合成2-苯基乙醇的方式是利用釀酒酵母的艾里希通路(Ehrlich pathway),通過L-苯丙氨酸生物轉(zhuǎn)化合成2-苯基乙醇或者利用碳源從頭合成[12-13],也可以通過基因工程[14-15]、酵母菌株雜交[16]、原位產(chǎn)物提取[17]等方法來提高2-苯基乙醇的生物合成量。除此之外,發(fā)現(xiàn)香灰菌也可以利用L-苯丙氨酸生物轉(zhuǎn)化合成2-苯基乙醇。經(jīng)鑒定,香灰菌(Hypoxylon sp.)為子囊菌亞門碳團(tuán)菌屬的真菌[18-20],是銀耳的伴生菌[21],只有與香灰菌共生培養(yǎng)時才有生長能力[22-23]。為了研究香灰菌如何利用L-苯丙氨酸生物合成香味物質(zhì)2-苯基乙醇,建立一種準(zhǔn)確的檢測香灰菌發(fā)酵液中L-苯丙氨酸和2-苯基乙醇含量的方法尤為重要。

目前L-苯丙氨酸的檢測方法主要有GSP分析儀和試劑盒等方法,主要應(yīng)用于醫(yī)療臨床研究,尤其是在新生兒干燥血片苯丙氨酸的含量與新生兒胎齡體重的關(guān)系方面[24-26],針對發(fā)酵液中L-苯丙氨酸含量的檢測目前報道不多。發(fā)酵液中2-苯基乙醇的檢測方法目前有紫外分光光度法[27]、氣相色譜分析法[28-29]以及氣質(zhì)聯(lián)用法[30],同時檢測發(fā)酵液中2-苯基乙醇和L-苯丙氨酸含量的相關(guān)研究較少。劉東亞等[31]利用高效液相色譜法對酵母菌發(fā)酵液進(jìn)行了檢測,將該檢測方法應(yīng)用于香灰菌發(fā)酵液的檢測時,發(fā)現(xiàn)存在以下問題:一方面,L-苯丙氨酸出峰較早,不能很好的與雜峰分離;另一方面,L-苯丙氨酸解離容易形成拖尾峰,這些均影響結(jié)果的準(zhǔn)確度,此外流動相甲醇∶水=1∶1會導(dǎo)致柱壓較高,對色譜柱和儀器損傷較大。

鑒于以上問題,本文擬建立一種新的同時檢測香灰菌發(fā)酵液中L-苯丙氨酸和2-苯基乙醇的方法,通過改變不同時間段流動相的配比,以期使L-苯丙氨酸和2-苯基乙醇與雜質(zhì)峰分離,并且使L-苯丙氨酸和2-苯基乙醇分離開來,實現(xiàn)一個樣本同時對兩種物質(zhì)進(jìn)行檢測;另外,流動相中加入弱酸,擬解決L-苯丙氨酸峰拖尾問題,為今后香灰菌生物轉(zhuǎn)化合成2-苯基乙醇的研究和開發(fā)提供依據(jù)。

1 實驗材料與方法

1.1 材料與儀器

2-苯基乙醇標(biāo)準(zhǔn)品 純度>99.5%,阿拉丁試劑(上海)有限公司;L-苯丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)品 純度>99%,上海麥克林生化科技有限公司;甲醇 色譜純,默克化工技術(shù)(上海)有限公司;超純水 電導(dǎo)率18.25 MΩ;PDA培養(yǎng)基 馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L，水1000 mL;發(fā)酵培養(yǎng)基 馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，L-苯丙氨酸4 g/L，水1000 mL。

LC20AD高效液相色譜儀配可變波長紫外檢測器、Inert Sustain C18色譜柱 島津公司;SB25-12DTDN超聲波清洗 寧波新芝生物科技有限公司;LE104E/02分析天平 METTLER TOLEDO,精度0.1 mg;有機系0.45 μm微孔過濾膜 津騰;ZQTY-70N恒溫?fù)u床 上海知楚儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗溶液的配制

1.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液的制備 準(zhǔn)確稱取0.5 g L-苯丙氨酸,用移液槍吸取0.5 mL 2-苯基乙醇(ρ=1.02 kg/L),用0.6%的乙酸溶液將L-苯丙氨酸和2-苯基乙醇定容于50 mL容量瓶中,配制成標(biāo)準(zhǔn)混合儲備液,其中L-苯丙氨酸的濃度為10 g/L,2-苯基乙醇的濃度為10.2 g/L。

1.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備 于5只10 mL容量瓶中分別加入1、2、3、4、5 mL標(biāo)準(zhǔn)混合儲備液,并用0.6%的乙酸溶液定容,得到濃度梯度為1、2、3、4、5 g/L的L-苯丙氨酸和濃度梯度為1.02、2.04、3.06、4.08、5.10 g/L的2-苯基乙醇標(biāo)準(zhǔn)混合液,標(biāo)準(zhǔn)混合液過0.22 μm有機系微孔濾膜后待上機檢測。

1.2.1.3 香灰菌發(fā)酵液樣品的制備 香灰菌菌種在PDA試管培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)接活化2次,將香灰菌菌種用接種針挖取約1 cm3的小塊接種到含有PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)4 d,在培養(yǎng)皿同一半徑上用直徑0.5 cm的打孔器打孔制備菌種塊,接種至含有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中,每瓶接種兩塊,置于28 ℃恒溫?fù)u床中,以160 r/min的振蕩速度培養(yǎng)6 d,將發(fā)酵液4000 r/min離心10 min,取上清液0.22 μm尼龍微孔濾膜過濾,濾液即為香灰菌發(fā)酵液樣品,待上機檢測。

1.2.2 液相色譜條件 色譜柱:C18(5 μm,250 mm×4.6 mm);柱溫30 ℃;進(jìn)樣量10 μL;流速0.7 mL/min;DAD檢測器,檢測波長258 nm;流動相A:0.6%乙酸水溶液;流動相B:甲醇,流動相洗脫梯度見表1。

表1 流動相梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions of mobile phase

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS 17.0,色譜采集及處理采用島津液相色譜儀配套的LC Solution色譜處理系統(tǒng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動相以及流動相成分的優(yōu)化

分別以乙腈和甲醇作為流動相的有機相部分進(jìn)行了實驗,結(jié)果表明,兩種溶液對L-苯丙氨酸以及2-苯基乙醇的分離效果相似,考慮到成本問題,選擇甲醇作為流動相的有機相部分。分別配制了20 mmol/L的磷酸二氫鉀、磷酸二氫銨、磷酸二氫鈉以及1%(V/V)的乙酸溶液作為流動相無機相部分進(jìn)行了實驗,結(jié)果如圖1所示,發(fā)現(xiàn)四種溶液均可出現(xiàn)較好的峰型,無拖尾峰形成,考慮到磷酸鹽溶液在色譜柱中純甲醇的環(huán)境下容易析出導(dǎo)致色譜柱堵塞,最終選用乙酸溶液作為流動相。

圖1 不同種類磷酸鹽水溶液以及乙酸水溶液色譜圖Fig.1 Chromatograms of different kinds of phosphate aqueous solutions and acetic acid aqueous solutions注:a:20 mmoL/L(M/V)磷酸二氫鉀;b:20 mmoL/L(M/V)磷酸二氫銨;c:20 mmoL/L(M/V)磷酸二氫鈉;d:1%(V/V)的乙酸。

同時分別以純水、0.3%、0.6%、0.9%的乙酸溶液作為流動相無機相部分進(jìn)一步實驗,結(jié)果如圖2所示,發(fā)現(xiàn)濃度0.6%、0.9%乙酸溶液均無拖尾峰形成,因此選擇0.6%(V/V)的乙酸溶液作為流動相。

圖2 不同濃度乙酸水溶液色譜圖Fig.2 Chromatogram of different concentration of acetic acid aqueous solution注:a:純水;b:0.3%乙酸水溶液;c:0.6%乙酸水溶液;d:0.9%乙酸水溶液。

2.2 紫外檢測器檢測波長的確定

在200～800 nm進(jìn)行全波長掃描檢測L-苯丙氨酸和2-苯基乙醇,結(jié)果見圖3和圖4,從圖3和圖4可知:L-苯丙氨酸和2-苯基乙醇均在258 nm處有吸收峰,最終選擇紫外檢測波長為258 nm。

圖3 L-苯丙氨酸全波長掃描光譜圖Fig.3 Full wavelength scan image of L-phenylalanine

圖4 2-苯基乙醇全波長掃描光譜圖 Fig.4 Full wavelength scan image of 2-phenylethanol

2.3 流速的確定以及方法優(yōu)化對比實驗

在劉東亞等[31]方法基礎(chǔ)上把流動相無機部分改為0.6%的乙酸水溶液,即以流動相甲醇:0.6%乙酸∶溶液=1∶1,流速1 mL/min,柱溫30 ℃,C18色譜柱(5 μm,250 mm×4.6 mm),進(jìn)樣量10 μL,在258 nm波長下進(jìn)行檢測,結(jié)果如圖5所示,圖5a為標(biāo)品色譜圖,圖5b為香灰菌發(fā)酵液樣品色譜圖,結(jié)果顯示樣品中L-苯丙氨酸分離效果較差,2-苯基乙醇可以分開,但峰形較寬,此時柱壓較高可達(dá)17.1 MPa,柱壓較高,不利于儀器的高效穩(wěn)定運轉(zhuǎn),綜上所述,此條件下不能高效準(zhǔn)確的同時檢測發(fā)酵液樣品中兩種物質(zhì)的含量。

圖5 兩種不同方法檢測色譜圖Fig.5 Chromatograms of two different detect methods注:a:傳統(tǒng)方法標(biāo)品色譜圖;b:傳統(tǒng)方法樣品色譜圖;c:優(yōu)化方法標(biāo)品色譜圖;d:優(yōu)化方法樣品色譜圖。

鑒于流動相的流速問題,流速較低保留時間較長,分離效果較差。流速過高則柱壓過大,因此對流動相流速0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL/min進(jìn)行了實驗,實驗結(jié)果表明:流速0.8、0.9、1.0 mL/min與0.7 mL/min分離效果均較好,考慮流速過快柱壓過高,最終選擇流速為0.7 mL/min。

以1.2.2步驟的液相色譜條件即檢測的最優(yōu)條件進(jìn)行檢測,結(jié)果如圖5c、5d所示,圖5c為標(biāo)品色譜圖,圖5d為香灰菌發(fā)酵液樣品色譜圖,兩種物質(zhì)分離效果均較好,且柱壓會隨時間的變化而變化,均小于17.1 MPa,有利于儀器的穩(wěn)定運行與保養(yǎng)。該方法分離效果好,柱壓低,準(zhǔn)確高效,可以很好的同時檢測發(fā)酵液中L-苯丙氨酸和2-苯基乙醇的含量。

2.4 實驗方法的驗證

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限 以1.2.1.2步驟配制6個不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液,在1.2.2步驟所描述最優(yōu)色譜條件下進(jìn)行測定,取3次平行測定的平均值,以標(biāo)準(zhǔn)液6個濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,以外標(biāo)法定量,建立線性回歸方程(表2),相關(guān)系數(shù)均大于0.999,線性關(guān)系良好。

表2 線性回歸方程Table 2 Linear regression equation

逐步稀釋標(biāo)準(zhǔn)混合溶液的濃度,上機檢測,結(jié)果表明:當(dāng)L-苯丙氨酸和2-苯基乙醇的峰高為基線噪音高的3倍和10倍時,檢測限分別為1.023和0.567 mg/L,定量限分別為3.409和1.890 mg/L。

2.4.2 方法的加標(biāo)回收率和精確度 按照1.2.1.3步驟的方法制備發(fā)酵液樣品,在其中添加兩種標(biāo)準(zhǔn)品,濃度分別為0.5、1.0、1.5 g/L,在最優(yōu)色譜條件進(jìn)行檢測,每個樣品檢測6次,取平均值,得到樣品的檢測量,結(jié)果為L-苯丙氨酸和2-苯基乙醇的含量分別是1.023和1.109 g/L。以平均值計算加標(biāo)回收率和方法的平均標(biāo)準(zhǔn)偏差,如表3所示,加標(biāo)回收率在98.53%～101.58%之間,由此證明方法的準(zhǔn)確度高。平均標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.67%～1.22%之間,精確度較高,符合試驗要求。

表3 加標(biāo)回收率測定結(jié)果Table 3 Standard recovery measurement results

2.4.3 儀器精密度實驗 取標(biāo)準(zhǔn)品混合液重復(fù)檢測6次(表4),結(jié)果L-苯丙氨酸和2-苯基乙醇的RSD分別為0.18%和0.31%。由此證明儀器精密度良好。

表4 儀器精密度實驗結(jié)果Table 4 The test results of instrument precision

2.5 樣品分析結(jié)果

在最優(yōu)色譜條件下對同批次相同條件下培養(yǎng)的6瓶香灰菌發(fā)酵液同時測定L-苯丙氨酸和2-苯基乙醇的含量,發(fā)酵培養(yǎng)基中L-苯丙氨酸的添加量均為4 g/L,每瓶香灰菌發(fā)酵液上機檢測3次取平均值,結(jié)果如表5所示,發(fā)酵液中2-苯基乙醇的產(chǎn)量較穩(wěn)定,在1.1153～1.3930 g/L之間,標(biāo)準(zhǔn)差在0.03～0.19之間,重復(fù)性良好,實驗誤差小,此方法可以很好的同時測定香灰菌發(fā)酵液中L-苯丙氨酸和2-苯基乙醇的含量。

表5 樣品檢測結(jié)果Table 5 The test results of samples

3 結(jié)論

本文通過優(yōu)化高效液相色譜法可以同時檢測香灰菌發(fā)酵液中的L-苯丙氨酸和2-苯基乙醇的含量,在最優(yōu)檢測條件下,即色譜柱:C18(5 μm,250 mm×4.6 mm);柱溫30 ℃;進(jìn)樣量10 μL;流速0.7 mL/min;DAD檢測器,檢測波長258 nm;流動相A:0.6%乙酸水溶液;流動相B:甲醇,流動相梯度洗脫,可以較好的分離目標(biāo)檢測物,線性關(guān)系良好,L-苯丙氨酸加標(biāo)回收率為99.16%～101.58%,2-苯基乙醇的加標(biāo)回收率為98.53%～101.06%,L-苯丙氨酸檢出限和定量限分別為1.023和3.409 mg/L,2-苯基乙醇檢出限和定量限分別為0.567和1.890 mg/L。該方法精確度和準(zhǔn)確度高,簡單高效,結(jié)果穩(wěn)定,且可以準(zhǔn)確高效的同時檢測發(fā)酵液中L-苯丙氨酸和2-苯基乙醇的濃度,為利用L-苯丙氨酸生物轉(zhuǎn)化合成天然香味物質(zhì)2-苯基乙醇的研究和開發(fā)奠定了理論基礎(chǔ)。