張黎莎， 錢粉紅

(江蘇大學附屬醫(yī)院呼吸內科， 江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

哮喘發(fā)病同時受環(huán)境及遺傳因素影響[1]。DNA甲基化是表觀遺傳學的重要組成部分，也是哮喘發(fā)病中重要的生物學標志物[2]。研究發(fā)現(xiàn)，胎兒出生時全基因組DNA甲基化水平與兒童期哮喘風險相關，以及包括香煙煙霧或交通尾氣暴露等多種變應原刺激可改變基因甲基化水平誘發(fā)哮喘[3-5]。然而，目前我國哮喘患者全基因組甲基化水平是否與健康者存在差異尚不清楚。

α肌動蛋白2(actin alpha 2，ACTA2)位于10號染色體，主要功能為編碼肌動蛋白，在所有細胞中均有廣泛表達。研究表明，ACTA2可通過影響細胞骨架功能促進肺腺癌侵襲和轉移[6]。ACTA2基因突變或缺失可引起平滑肌收縮力減弱，此外，ACTA2表達降低可激活NF-κB，致IL-6表達升高[7-9]。但ACTA2甲基化水平與哮喘發(fā)病關系尚不清楚。因此，本研究首先對哮喘患者鼻黏膜上皮細胞全基因組DNA甲基化水平進行檢測分析，其次對ACTA2基因在哮喘患者中的差異性甲基化表達進行研究，綜合分析哮喘患者甲基化改變情況。

1 對象與方法

1.1 研究對象

1.1.1 全基因組甲基化測序(850K芯片)研究對象 選擇2017年10月至2018年10月于江蘇大學附屬醫(yī)院呼吸科門診就診的成人哮喘患者6例為哮喘組，另選擇同期、同居住地、年齡相近、性別比例相似，且與哮喘組患者無直接血緣關系的健康體檢者5例為對照組，一般資料如表1所示。本研究通過江蘇大學附屬醫(yī)院倫理委員會批準，且受試者均已簽署臨床研究知情同意書。

1.1.2 ACTA2啟動子檢測分析[重亞硫酸鹽法(BSP)]研究對象 選擇2018年10月至2019年10月于江蘇大學附屬醫(yī)院呼吸科門診就診的成人哮喘患者12例為哮喘組，另選擇同期、同居住地、年齡相近、性別比例相近，且與哮喘組患者無直接血緣關系的健康體檢者12例為對照組。研究對象一般資料如表2所示。

入組標準：年齡18～65歲；有明確哮喘診斷病史，符合支氣管哮喘防治指南[10]，且有明顯胸悶或喘息等呼吸系統(tǒng)癥狀；無過敏性鼻炎病史，無明顯流涕、鼻塞等鼻部癥狀，且近期無鼻腔給藥史。排除標準：有明確腫瘤及化療藥物使用史；近1月內有上呼吸道感染病史；既往有心腦血管疾?。蝗焉餇顟B(tài)。

1.1.2 實驗材料 鼻腔采樣器Rhino-Pro?Curette(美國ASI公司)；Ⅰ型膠原酶(美國Sigma公司)；甲基化轉化試劑盒(美國Zymo公司)；動物組織/細胞基因組DNA提取試劑盒(上海索萊寶公司)。

1.2 全基因組甲基化測序

1.2.1 標本采樣 清潔鼻腔并以少量生理鹽水濕潤鼻腔；以鼻刮匙于下鼻甲處反復輕刮5～10次；將鼻刮匙下端置入0.1%膠原酶中，震蕩數(shù)分鐘；37 ℃水浴消化1 h。

1.2.2 DNA提取及處理 將消化后所得細胞1 500 r/min常溫離心5 min；取細胞沉淀，按照試劑盒說明書提取DNA，紫外分光光度計檢測其總量大于2 μg，D(260 nm)/D(280 nm)≈1.8為合格標準。每份樣本取1 μg DNA，按照甲基化轉化試劑盒說明書操作。

1.2.3 甲基化850K芯片 芯片檢測過程主要包括擴增、孵育、沉淀、雜交、洗脫等步驟，芯片結果導出后進行區(qū)域分析。具體實驗操作委托上海天昊生物科技有限公司完成。

1.2.4 基因本體論(Gene Ontology，GO)分析 通過GCBI的在線實驗室分析平臺(https:∥www.gcbi.com.cn/gclib/html/index)對篩選獲得的差異基因進行GO功能分析。

1.3 ACTA2啟動子檢測分析

1.3.1 引物設計 采用Primer3對處理之后的序列進行引物設計，上海天昊公司進行引物合成。ACTA2上游引物為5′-AGTGATAGATGTAAAATATAGGGTGATGG-3′，下游引物5′-ACTAAACACACTAAAAAT-TTCAATATTCCTTT-3′。

1.3.2 BSP測序 重亞硫酸鹽處理后進行多重PCR反應及Illumina Hiseq平臺高通量測序，具體實驗操作委托上海天昊生物科技有限公司完成。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 全基因組甲基化測序結果

2.1.1 基本資料 如表1 所示，兩組性別、年齡、BMI、外周血白細胞計數(shù)等等數(shù)據(jù)間差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。哮喘組FEV1/FVC(%)、FEV1pred(%)均明顯低于健康對照組(P<0.05)。

表1 全基因組測序研究對象基本臨床資料比較

2.1.2 差異性甲基化總體分布 此次一共檢測除X、Y染色體外22條常染色體，共找到102 812個差異性甲基化位點，共涉及15 000余個基因。差異性甲基化位點在各染色體均有分布，且高甲基化與低甲基化改變可存在于同一條染色體。如圖1所示，高甲基化位點共87 615個，低甲基化位點共15 197個。

圖1 差異性甲基化位點總體比例

2.1.3 甲基化區(qū)域在各功能區(qū)分布 本研究中檢測所得的差異性甲基化區(qū)域絕大多數(shù)集中在基因體及基因間區(qū)，位于啟動子區(qū)域的差異性甲基化位點占10%～20%，分布比例如圖2所示。

1stExon:第一個外顯子區(qū)域；3′UTR:3′UTR序列；5′UTR:5′UTR序列；Body:基因區(qū)域；ExonBnd:外顯子區(qū)域；IGR:基因間區(qū)域；TSS1500:轉錄起始位點上游200～1 500 bp；TSS200:轉錄起始位點上游200 bp

2.1.4 GO分析 本研究中所涉及的GO功能分析包括三個方面：生物學過程、細胞組分、分子功能。哮喘患者鼻黏膜上皮細胞中相關的甲基化差異顯著區(qū)域的GO富集結果分析如圖3所示，其中包括了平滑肌細胞增殖及上皮管腔形成等各個方面。ACTA2基因與其中的血管平滑肌收縮、蛋白質磷酸化的正向調控、信號傳感器的活動及線粒體功能等方面相關。

圖3 全基因組差異性位點GO功能富集分析

2.2 ACTA2啟動子檢測分析

2.2.1 基本資料 如表2所示，兩組性別、年齡、BMI、外周血白細胞計數(shù)等數(shù)據(jù)間差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。 哮喘組FEV1/FVC(%)、FEV1pred(%)均明顯低于健康對照組(P<0.05)。

表2 BSP測序研究對象基本臨床資料比較

2.2.2ACTA2啟動子甲基化水平比較 如圖4示，哮喘組ACTA2啟動子區(qū)位點cg19791409甲基化水平明顯高于健康對照組(Z=-3.233，P=0.001)。

圖4 兩組ACTA2啟動子甲基化水平的比較

3 討論

本研究采用850K甲基化芯片技術和BSP法分別對哮喘患者鼻黏膜上皮細胞中全基因組甲基化水平和ACTA2基因啟動子區(qū)甲基化水平進行檢測；結果顯示，哮喘患者鼻黏膜上皮細胞全基因組中存在廣泛甲基化，且不同基因的高甲基化和低甲基化改變可同時存在于各常染色體；其次，大多數(shù)甲基化改變發(fā)生在基因體或基因間區(qū)，僅有10%～20%的甲基化修飾發(fā)生在啟動子區(qū)域，共涉及數(shù)千個不同基因。研究表明，啟動子區(qū)高甲基化抑制基因表達[11]，起到類似于基因沉默的作用，反之則上調基因表達。除啟動子區(qū)外，基因其他功能區(qū)甲基化造成的影響還未有明確定論。有研究通過構建特殊的DNA片段的熒光素酶報告載體，人為改變基因啟動子區(qū)甲基化水平，證實DNA甲基化程度能顯著影響啟動子區(qū)轉錄活性[12]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)在哮喘兒童鼻黏膜上皮細胞中，存在多個與上皮屏障功能及免疫調節(jié)等相關基因(如FBXL7，NTRK1等)啟動子區(qū)發(fā)生甲基化；且使用ROC曲線分析上述基因甲基化水平用于哮喘的診斷價值時，顯示其曲線下面積>90%，準確率約為80%[13]。由此提示，鼻黏膜上皮細胞DNA甲基化程度與哮喘發(fā)病存在一定相關性。

本研究對出現(xiàn)啟動子區(qū)差異性甲基化的基因進行GO分析，按P值分類排序后發(fā)現(xiàn)，與上皮管腔形成、平滑肌細胞增殖與調節(jié)等相關可能參與哮喘發(fā)病的基因，選取ACTA2作為目的基因，以BSP法對啟動子區(qū)域甲基化位點水平進行定量檢測分析，發(fā)現(xiàn)ACTA2基因啟動子在哮喘患者中出現(xiàn)明顯高甲基化改變。分析其機制可能為ACTA2啟動子高甲基化抑制基因表達，使得其自身表達下調，激活NF-κB相關信號通路[7]，或可通過減弱平滑肌細胞收縮力，引起平滑肌增生紊亂等途徑導致哮喘發(fā)生[8]。

以往呼吸道疾病研究常以支氣管上皮細胞為最佳標本，然而由于其采樣過程為侵入性操作，哮喘患者不易接受。但是，本研究采用鼻黏膜上皮細胞進行哮喘研究，易于患者接受。有學者對哮喘患者的各種組織標本如鼻黏膜上皮細胞、血液、口腔上皮細胞、氣道上皮細胞進行甲基化程度對比，結果顯示鼻黏膜上皮細胞甲基化水平與支氣管上皮最為相似，并優(yōu)于傳統(tǒng)使用的血液標本[14]。已有研究在哮喘患者的鼻黏膜上皮細胞中尋找到cg23602092、cg14830002、cg23602092等與哮喘癥狀及誘發(fā)因素相關的甲基化位點[15]。由此說明，鼻黏膜上皮細胞可作為哮喘甲基化研究的良好替代樣本。本研究未闡述相關作用通路及具體作用機制，有待后期通過培養(yǎng)細胞，人工改變其甲基化水平來進一步研究。

總之，哮喘患者鼻黏膜上皮細胞中全基因組甲基化水平與健康者相比有明顯差異，且ACTA2啟動子甲基化水平明顯升高，其具體作用機制仍需進一步研究。