徐琛， 劉競麗

(廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院神經內科， 廣西 南寧 530000)

miRNA是一種短鏈非編碼小RNA，與靶基因mRNA 3′UTR端相互作用，阻止其翻譯[1]。研究報道，miR124在腦中高表達，可激活PI3K/AKT/mTOR通路，參與缺血性腦卒中發(fā)生[2]。在外周神經損傷后不同時間鞘內注射miR133b-3p，可防止或逆轉神經病理性疼痛，如機械性疼痛或寒冷性疼痛[3]。另有報道證實表沒食子兒茶素沒食子酸酯能夠改善脂多糖誘導的大鼠慢性阻塞性肺疾病， 通過調控肺 miR133a/b-3p 和 TGF-β1/Smad3 水平，抑制氧化應激和炎癥[4]。關于miR133b-3p在缺血性腦灌注損傷后的表達及機制尚不明確，本研究通過高通量測序選出大鼠腦缺血再灌注損傷后差異表達的miR133b-3p并通過qRT-PCR驗證其表達，通過雙熒光素酶靶點驗證報告證實miR133b-3p與bcl2l2的靶向調控關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 28只成年雄性SD大鼠250～300 g，購自廣西醫(yī)科大學動物實驗中心，動物合格證編號：SYXK桂2014- 0003。隨機均分為假手術組和腦缺血再灌注組，每組14只。每組取造模后任意12只行神經行為學評分；5只行TTC染色；6只行qRT-PCR實驗；3只行Tunnel實驗。實驗通過廣西醫(yī)科大學動物倫理委員會批準。

1.1.2 試劑與儀器 佳靈線栓(廣州佳靈生物技術有限公司)；動物麻醉機(深圳瑞沃德生物技術有限公司)；異氟烷(北京友誠生物技術有限公司)；TTC染色液(大連美侖生物技術有限公司)；Trizol(美國Life公司)；逆轉錄試劑盒，實時熒光定量PCR檢測試劑盒，大鼠miR133b-3p驗證引物均為廣州復能生物技術有限公司產品；Tunnel試劑盒、蛋白酶K(瑞士Roche公司)；人腎胚293T細胞(廣州銳博生物技術公司實驗室)；DMEM，胰酶均為美國Gibco公司產品；Lipo6000TM轉染試劑(上海碧云天生物技術有限公司)；pmiR-RB-Report載體(廣州銳博生物技術有限公司)；分光光度計(美國Promega公司)。

1.2 腦缺血再灌注模型建立

將大鼠置于麻醉機誘導盒，異氟烷誘導麻醉3 min，期間異氟烷濃度維持在1.5%～1.8%；然后將大鼠固定于平板上，分離頸總動脈、頸內動脈、頸外動脈，結扎頸總動脈近心端，并且結扎頸外動脈與頸內動脈分叉處；在頸總動脈剪一小口，插入線栓到分叉處約18 mm，用縫線結扎血管切口，縫合皮膚；2 h后拔除線栓；腦缺血再灌注組再灌注24 h，假手術組分離肌肉組織，僅顯露血管。

1.3 動物造模的評判

1.3.1 神經行為學評分 兩組在再灌注24h后按照文獻[5]進行神經行為學評分：0分，無神經行為學癥狀；1分，爪子彎曲；2分，向對側轉圈；3分，向對側傾倒；4分，不能行走，無意識。

1.3.2 梗死體積測量 斷頭取腦組織于-20 ℃冷凍20 min；冠狀面切片，依次切5片，厚度約2 mm；2% TTC染液37 ℃避光孵育20～30 min；每10 min晃動切片；數(shù)碼相機拍照；用IPP6.0軟件計算梗死體積，按照文獻[6]，梗死體積百分率計算公式：(對側半球體積-非梗死同側半球體積)/對側半球體積×100%。

1.4 梗死中心區(qū)腦組織TUNNEL染色檢測細胞凋亡率

兩組在再灌注24 h后分別予以4%低聚甲醛灌注，取視交叉前后約2 mm腦組織；4%低聚甲醛固定24 h；石蠟包埋后切3 μm薄片；二甲苯脫蠟，5 min/次，2次；90%乙醇，80%乙醇，70%乙醇脫水，各10 min；蛋白酶K 37 ℃消化30 min；PBS洗滌，玻片干后加入TUNNEL反應液，37 ℃孵育1 h；PBS洗3次；與DAB反應；以蘇木精染色細胞核。顯微鏡下(×100)隨機取3個視野觀察腦梗死中心區(qū)，細胞計數(shù)取平均值，陽性細胞核為棕色，陰性細胞核為藍色，根據凋亡陽性細胞與細胞總數(shù)比值計算細胞凋亡率。

1.5 實時熒光定量PCR檢測miR133b-3p表達

用Trizol從腦梗死中心區(qū)組織中提取總RNA；取1 μg在20 μL 體系中行逆轉錄，反應條件：37 ℃ 60 min，85 ℃持續(xù)5 min，4 ℃保存。用逆轉錄模板行qRT-PCR反應：95 ℃變性30 s，95 ℃變性10 s，65 ℃退火延伸30 s，40個循環(huán)。熔融曲線分析參數(shù)： 95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min。每個PCR混合物含2 μL逆轉錄反應產物，4 μL 5×BlazeTaqqPCR混合物，0.1 μL ROX 參考染料，加無酶水至20 μL。miR133b-3p特異引物：5′-TCCCCTTCAACCAGCTAA-3′,使用5S RNA為miRNA內參。每個樣本重復3次。采用2-ΔΔCt法計算miR133b-3p相對表達。

1.6 miR133b-3p靶基因預測

利用靶基因數(shù)據庫(miRWalk和target scan)查找miR133b-3p對應的與凋亡相關的靶基因。

1.7 質粒構建

從大鼠基因組DNA的PCR中擴增包含miR133b-3p結合位點的bcl2l2基因的3′UTR序列，然后克隆至pmiR-RB-Report報告載體的SgfⅠ/XhoⅠ位點。使用以下引物組產生特異性片段：正向，5′-GCACTGCGATCGCTTCTTTTGAAGCCATCCATG-3′，反向，5′-GCGCTCGAGCCCTGAACCCCGATACATAA-3′。

1.8 雙熒光素酶分析

實驗分為2組：野生型bcl2l2+miR133b-3p模擬物組，野生型bcl2l2+miR133b-3p模擬物陰性對照組；人腎胚293T細胞于37 ℃，5%CO2常規(guī)培養(yǎng)；取對數(shù)生長期293T細胞，以1.0×104/孔細胞密度接種于96孔板，每孔100 μL，于37 ℃培養(yǎng)24 h；取5 μL opti-MEM稀釋miR133b-3p模擬物或陰性對照，靶基因 3′UTR雙報告基因載體或突變載體，5 μL opti-MEM稀釋 0.25 μL轉染試劑，分別靜置5 min，二者混合，輕輕搖勻，靜置 5 min；每孔加入90 μL培養(yǎng)基，再加入上述10 μL 混合液。其中，miR133b-3p模擬物轉染濃度均為 50 nmol/L，質粒濃度為 50 ng/孔，每組設 3個復孔，轉染 6 h；更換培養(yǎng)液，轉染 48 h；每孔加入35 μL PBS和35 μL Luciferase底物，振蕩10 min，轉移至96孔板，測定熒光值。

1.9 統(tǒng)計分析

2 結果

2.1神經行為學評估和腦梗死體積比較

由圖1可見，腦缺血再灌注組神經行為學評分明顯高于假手術組(Z=-4.365，P<0.01)。肉眼觀，TTC染色顯示腦缺血再灌注組有梗死灶(白色為梗死組織)，假手術組無梗死灶。腦梗死再灌注組梗死體積百分率約為(32.42±16.3)%,見圖2。

圖1 各組大鼠神經行為學評分

圖2 兩組大鼠腦組織TTC染色

2.2 腦梗死中心區(qū)細胞凋亡率比較

由圖3可見，腦缺血再灌注組和假手術組大鼠腦梗死中心區(qū)均可見凋亡細胞；腦缺血再灌注組細胞凋亡率明顯高于假手術組(t=-4.232，P<0.05)，表明腦梗死后細胞凋亡明顯。

圖3 腦梗死中心區(qū)細胞凋亡率(×100，TUNNEL染色)

2.3 miR133b-3p在腦梗死組織中的表達

由圖4可見，腦缺血再灌注組中miR133b-3p表達量較假手術組明顯降低(t=4.91，P<0.01)。

圖4 qRT-PCR檢測miR133b-3p表達量

2.4 miRNA靶基因預測與功能分析

靶基因數(shù)據庫預測結果顯示，miR133b-3p可能與凋亡相關的靶基因為bcl2l2。

由圖5可見，野生型bcl2l2+miR133b-3p模擬物組熒光強度明顯低于野生型bcl2l2+miR133b-3p模擬物陰性對照組(t=5.295，P<0.05)。由此表明，bcl2l2可能是miR133b-3p靶基因。

圖5 雙熒光素酶靶點驗證報告結果

3 討論

本研究顯示大鼠腦缺血再灌注損傷后miR133b-3p表達明顯降低；此外，再灌注24 h腦梗死面積明顯增大，神經行為學評分升高，細胞凋亡數(shù)增多，提示miR133b-3p可能參與腦缺血再灌注損傷后細胞凋亡。

研究表明，bcl2l2與其家族成員bcl-2功能類似，參與腫瘤發(fā)病[7]。另有研究證明，在細胞毒性條件下，bcl2l2可以抑制細胞凋亡，提高細胞存活率[8]。研究證實bcl2l2是與凋亡相關的靶基因，且與缺血性心臟病細胞凋亡相關[9]。此外，bcl2l2在腦缺血發(fā)病中發(fā)揮重要作用，過表達bcl2l2可逆轉miR-29b誘導的神經元凋亡，miR-29b通過抑制bcl2l2，在一定程度上促進神經元死亡[10]。本研究中通過生物學信息技術分析miR133b-3p可能與凋亡相關的靶基因，雙熒光素酶靶點驗證報告提示轉染miR133b-3p后，相對熒光強度明顯下調(P<0.05)，表明miR-133b-3p通過調控與凋亡相關的靶基因bcl2l2在腦缺血再灌注損傷模型中發(fā)揮作用。

綜上所述，miR-133b-3p是一種新的與凋亡相關調控因子，可能通過與靶基因bcl2l2結合，參與缺血性腦梗死的發(fā)生。