倪修凡， 張尤歷， 徐岷

(1. 江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 江蘇 鎮(zhèn)江 212013； 2. 江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科， 江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

外泌體是一種直徑30～100 nm的小囊泡[1]，來自細(xì)胞內(nèi)吞途徑中的多泡體，通過胞膜內(nèi)陷形成囊泡釋放至細(xì)胞外基質(zhì)中，介導(dǎo)其包裹的蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等參與細(xì)胞間信息傳遞過程[2]。近來研究顯示，在消化道腫瘤發(fā)展中，通過外泌體介導(dǎo)的核酸分子起重要作用，其中，長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, LncRNA)是關(guān)鍵的影響因子。LncRNA可通過外泌體的介導(dǎo)，以多種方式調(diào)控受體細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[3]。本文針對外泌體源性LncRNA在消化道腫瘤中的作用機(jī)制，以及其作為消化道腫瘤生物標(biāo)志物的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 外泌體與消化道腫瘤

近來研究發(fā)現(xiàn)，外泌體作為信息通訊的關(guān)鍵物質(zhì)，通過參與調(diào)控腫瘤微環(huán)境、影響腫瘤細(xì)胞耐藥、調(diào)節(jié)上皮—間充質(zhì)轉(zhuǎn)化以及促腫瘤血管生成等過程對消化道腫瘤的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生重要影響。例如，Wang等[4]發(fā)現(xiàn)缺氧誘導(dǎo)的胰腺癌外泌體富集miR-301a-3p并釋放至受體細(xì)胞，激活PI3K信號通路，從而誘導(dǎo)引發(fā)巨噬細(xì)胞M2極化，促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖與遷移。結(jié)腸癌SW480細(xì)胞分泌的外泌體經(jīng)HepG2細(xì)胞攝取后，促進(jìn)信號調(diào)節(jié)激酶ERK1/2磷酸化，激活MAPK信號通路促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[5]。同時(shí)，作為一個(gè)具有穩(wěn)定性、特異性的囊泡，外泌體還可通過電穿孔方式導(dǎo)入siRNA靶向KRAS治療胰腺癌[6]。

2 LncRNA與消化道腫瘤

LncRNA是轉(zhuǎn)錄長度200個(gè)核苷酸以上的RNA[7]，本身不具有編碼蛋白質(zhì)的功能，是RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物，所以在研究初期，人們認(rèn)為其是轉(zhuǎn)錄過程中的“垃圾”和“噪音”[8]。隨著研究深入，人們逐漸發(fā)現(xiàn)LncRNA可從三個(gè)方面調(diào)控基因表達(dá)，即表觀遺傳學(xué)調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[9]。雖然參與調(diào)控各腫瘤發(fā)展的LncRNA不同，但主要通過影響細(xì)胞增殖遷移、提升耐藥性、促進(jìn)血管生成等方式影響腫瘤進(jìn)展[10]。例如，在胃癌中，LncRNA-UCA1可通過與miR-203相互作用，致靶向轉(zhuǎn)錄本ZEB2釋放進(jìn)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移[11]。LncRNA-RoR可通過激活Hippo/YAP通路進(jìn)而促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖及侵襲[12]。LncRNA-HOTAIR在肝癌化療的研究中起重要調(diào)控作用，敲除LncRNA-HOTAIR后肝癌細(xì)胞順鉑化療敏感性得到明顯提升，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其可能通過抑制STAT3/ABCB1信號通路參與腫瘤耐藥的調(diào)控[13]。以上研究結(jié)果表明，LncRNA可通過多種方式調(diào)控消化道腫瘤進(jìn)展。

3 外泌體源性LncRNA對于消化道腫瘤的影響

外泌體介導(dǎo)的miRNA參與調(diào)節(jié)腫瘤進(jìn)展以及作為生物標(biāo)志物已有較多的研究[12]。研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA包裹存在于外泌體中[14]。然而對于外泌體介導(dǎo)的LncRNA而言，則不及miRNA研究得廣泛和透徹。LncRNA較miRNA擁有較長核酸片段，包裹進(jìn)入外泌體的含量約占外泌體總RNA含量3%[15]。實(shí)際上，這些經(jīng)外泌體介導(dǎo)的LncRNA通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲遷移、促進(jìn)血管生成、調(diào)節(jié)腫瘤干細(xì)胞特性、促進(jìn)腫瘤耐藥以及調(diào)控腫瘤微環(huán)境在消化道腫瘤發(fā)生發(fā)展中起決定性作用，詳見表1。

表1 外泌體源性LncRNA在消化道腫瘤中的作用

3.1 外泌體源性LncRNA對消化道腫瘤細(xì)胞侵襲遷移的影響

TUC339在肝癌細(xì)胞中可通過調(diào)節(jié)趨化因子受體通路及調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化促進(jìn)腫瘤生長，重要的是，TUC339在肝癌細(xì)胞外泌體中高度富集，因此擴(kuò)大了自身作用方式[20]。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化是腫瘤遷移侵襲重要因素，其特征表現(xiàn)為E-鈣黏附蛋白表達(dá)下降以及N-鈣黏附蛋白、波形蛋白等表達(dá)增多[31]。PCAT1在食管癌中高表達(dá)，同時(shí)其通過外泌體介導(dǎo)，作為miR-326的內(nèi)源性競爭RNA促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞增殖，血清外泌體中PCAT1作為無創(chuàng)性生物標(biāo)志物可作為食管癌篩查的指標(biāo)[16]。LncRNA-ZFAS1在胃癌組織、血清外泌體中呈高表達(dá)，且與臨床病理分期相關(guān)[19]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，外泌體介導(dǎo)的LncRNA-ZFAS1通過上調(diào)cyclinD1、p-ERK和Bcl-2蛋白表達(dá)進(jìn)而增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的增殖及遷移能力[19]。此外，LncRNA-HULC亦通過外泌體包裹傳遞，調(diào)節(jié)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達(dá)增加促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖遷移[25]。LncRNA-NONHSAT105177在胰腺導(dǎo)管腺癌癌組織中呈低表達(dá)，通過下調(diào)鋅指轉(zhuǎn)錄因子、波形蛋白、N-鈣黏蛋白等表達(dá)從而抑制胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞增殖和遷移，其可通過外泌體包裹更強(qiáng)地發(fā)揮信息傳遞及腫瘤調(diào)控作用[24]。由此證實(shí)，外泌體也可攜帶抑癌性核酸分子。LncRNA-91H可通過結(jié)直腸癌外泌體包裹，上調(diào)HNRNPK表達(dá)促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖及遷移[28]。上述結(jié)果表明，外泌體源性LncRNA可通過靶向相關(guān)蛋白、激活信號通路進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲遷移。

3.2 外泌體源性LncRNA對消化道腫瘤干細(xì)胞特性調(diào)節(jié)的影響

腫瘤干細(xì)胞是具有自我更新能力且同時(shí)產(chǎn)生異質(zhì)性的腫瘤細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞的干細(xì)胞特性調(diào)節(jié)能力是評判腫瘤惡性程度的關(guān)鍵指標(biāo)[32]。LncRNA-Sox2ot在胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞的外泌體中高度富集，外泌體介導(dǎo)的LncRNA-Sox2ot可競爭性結(jié)合下游分子miR-200調(diào)控Sox2表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)胰腺導(dǎo)管腺癌上皮—間充質(zhì)轉(zhuǎn)化及腫瘤干細(xì)胞特性[26]。同時(shí)，血漿外泌體包裹的LncRNA-Sox2ot表達(dá)與胰腺導(dǎo)管腺癌患者預(yù)后分期及總生存率高度相關(guān)[26]。LncRNA-FMR1-AS1差異性高表達(dá)于女性食管鱗癌患者，其與TLR7受體結(jié)合，進(jìn)一步激活下游TLR7/NF-κB信號通路，促進(jìn)c-Myc表達(dá)，促進(jìn)食管鱗癌的增殖遷移；食管鱗癌干細(xì)胞可通過外泌體介導(dǎo)LncRNA-FMR1-AS1將干細(xì)胞表型轉(zhuǎn)移到腫瘤微環(huán)境中的非干細(xì)胞受體[17]。Ren等[29]發(fā)現(xiàn)，LncRNA-H19通過外泌體傳遞，激活β-catenin信號通路，促進(jìn)結(jié)直腸癌干細(xì)胞特性調(diào)控，影響腫瘤進(jìn)展。由此表明，外泌體源性LncRNA通過調(diào)節(jié)腫瘤干細(xì)胞特性促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展。

3.3 外泌體源性LncRNA對消化道腫瘤血管生成的影響

血管生成是腫瘤細(xì)胞賴以生長的關(guān)鍵因素，癌細(xì)胞通過血管汲取養(yǎng)分從而促進(jìn)自身侵襲和轉(zhuǎn)移[33]。研究人員通過對比CD90+肝癌細(xì)胞與正常肝癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)CD90+腫瘤干細(xì)胞可釋放富集LncRNA-H19的外泌體，進(jìn)而作用血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管內(nèi)皮生長因子及其受體，調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞血管生成，進(jìn)而增強(qiáng)CD90+肝癌細(xì)胞對于內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖與遷移[21]。此與Ren等[29]研究一致，提示LncRNA-H19可能是外泌體介導(dǎo)的腫瘤相關(guān)影響分子。

3.4 外泌體源性LncRNA在消化道腫瘤耐藥中的作用

Takahashi等[22]研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA-VLDLR在肝細(xì)胞癌耐藥株中高表達(dá)，可通過外泌體釋放至化療敏感細(xì)胞，導(dǎo)致化療敏感細(xì)胞對化學(xué)耐藥抵抗明顯增強(qiáng)，LncRNA-VLDLR通過上調(diào)ABC-G2表達(dá)增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對于索拉菲尼的化療抵抗。類似研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA-RoR亦參與多柔比星肝癌細(xì)胞外泌體的耐藥性傳遞[23]。吉非替尼治療食管癌是目前較為普遍的食管癌化療方案，但依然存在細(xì)胞耐藥的問題。研究發(fā)現(xiàn)[18]，LncRNA-PAPT1在吉非替尼耐藥的食管鱗癌細(xì)胞中高表達(dá)，其經(jīng)耐藥細(xì)胞株所分泌的外泌體包裹，通過調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax信號通路促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞對于吉非替尼的耐藥。以上研究證實(shí)，耐藥細(xì)胞株通過外泌體介導(dǎo)的LncRNA致細(xì)胞耐藥性增強(qiáng)，該過程顯示出外泌體作為媒介物的重要作用，也表明lncRNA在過程中起決定性作用。

3.5 外泌體源性LncRNA在消化道腫瘤微環(huán)境及免疫反應(yīng)中的作用

近來發(fā)現(xiàn)，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中起重要作用，尤其在發(fā)生M2極化之后[34]。外泌體介導(dǎo)的LncRNA亦參與腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞M2型極化過程。結(jié)直腸癌細(xì)胞介導(dǎo)的LncRNA-RPPH1參與巨噬細(xì)胞M2型極化過程；此外，結(jié)直腸癌患者術(shù)前血漿外泌體中LncRNA-RPPH1水平較高，在腫瘤切除后其表達(dá)明顯水平下降[30]，提示LncRNA-RPPH1不僅可作為治療結(jié)直腸癌的重要靶點(diǎn)，還可作為結(jié)直腸癌診斷以及術(shù)后隨訪的重要指標(biāo)。腫瘤細(xì)胞對于免疫系統(tǒng)監(jiān)測逃逸為目前造成腫瘤細(xì)胞難以被清除及攻克的最大難題[35]，LncRNA同樣也參與該過程。最近研究表明[27]，經(jīng)胰腺癌外泌體處理的樹突狀細(xì)胞較未處理的樹突狀細(xì)胞顯示出較弱激活CD8+及CD4+的能力，進(jìn)一步通過微陣列及數(shù)據(jù)庫整合發(fā)現(xiàn)胰腺癌外泌體介導(dǎo)的LncRNA-ENST00000560647極可能是促進(jìn)樹突狀細(xì)胞免疫逃逸的最關(guān)鍵原因[27]。

4 外泌體源性LncRNA作為消化道腫瘤的生物標(biāo)志物

目前對于消化道腫瘤仍缺乏特異性較高的生物標(biāo)志物，外泌體作為一種較為穩(wěn)定的囊泡，雖然包含有成百上千種不同的LncRNA，但對于特定腫瘤的特異性LncRNA并不多。具體見表2。

表2 外泌體源性LncRNA在各消化道腫瘤中的診斷價(jià)值

在結(jié)直腸癌研究中，Dong等[36]招募76例結(jié)直腸癌患者，篩選出39個(gè)與癌癥相關(guān)的候選LncRNA，其中，BCAR4的AUC值最高，為0.936，預(yù)示其可作為潛在的結(jié)直腸癌生物標(biāo)志物。除此以外，Liu等[37]研究證實(shí)外泌體源性的LncRNA-CRNDE-h來源于早期的結(jié)直腸癌細(xì)胞，通過招募148例結(jié)直腸癌患者、80名健康對照者進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA-CRNDE-h在結(jié)直腸癌患者外泌體中顯著升高，其AUC值為0.892。

在導(dǎo)致肝癌的危險(xiǎn)因素中，乙肝病毒、丙肝病毒及飲酒是最常見的三種[42]。Zhang等[38]招募35例慢性丙肝、22例丙肝誘發(fā)肝硬化和10例丙肝相關(guān)肝細(xì)胞癌患者，結(jié)合患者基本情況、臨床血清學(xué)指標(biāo)、臨床影像學(xué)資料進(jìn)行調(diào)查分析發(fā)現(xiàn)，丙肝病毒導(dǎo)致的肝細(xì)胞癌患者血清外泌體LncRNA-HEIH顯著增高，提示外泌體源性的 LncRNA-HEIH可作為丙肝病毒相關(guān)性的肝癌生物標(biāo)志物。在另一組關(guān)于肝癌的研究中，Xu等[39]通過對60例肝細(xì)胞癌患者、85例肝硬化患者、96例慢性乙肝患者、60名健康對照者的血清外泌體中LncRNA分析發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞癌組外泌體中兩個(gè)LncRNA(ENSG00000258332.1及LINC00635)明顯高于其余組，將兩種LncRNA與甲胎蛋白聯(lián)合測定對于肝細(xì)胞癌的診斷價(jià)值，AUC值為0.894；此外，兩種LncRNA均與淋巴轉(zhuǎn)移即TNM分期相關(guān)，且術(shù)后兩種LncRNA水平均顯著降低[39]，由此表明血清外泌體來源的兩種LncRNA對肝細(xì)胞癌患者臨床分期和治療的預(yù)后具有良好的參考價(jià)值。

在胃癌研究中，Zhao等[40]招募126例胃癌患者、120名健康對照者，結(jié)果顯示胃癌組血清外泌體中LncRNA-HOTTIP表達(dá)水平明顯上調(diào)，且與浸潤深度、TNM分期顯著相關(guān)，同時(shí)ROC曲線下AUC值為0.827。由此提示，血清外泌體源性LncRNA-HOTTIP可能是胃癌診斷和預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。在早期胃癌的研究中，Lin等[41]從5名健康者、10例Ⅰ期胃癌患者的血漿分離出外泌體，通過分析發(fā)現(xiàn)LncUEGC1在早期胃癌患者中表達(dá)顯著上調(diào)，同時(shí)，其可包裹在外泌體中，LncUEGC1在診斷中區(qū)分早期胃癌患者與健康者時(shí)AUC值分別為0.876，高于癌胚抗原的診斷準(zhǔn)確性。

5 總結(jié)

外泌體作為信息傳遞的媒介，使得其內(nèi)部富集的LncRNA在調(diào)控腫瘤的進(jìn)展中顯示出高效性與準(zhǔn)確性。外泌體源性LncRNA可以從多個(gè)方面調(diào)控腫瘤的進(jìn)展，同時(shí)血清、血漿中的外泌體源性LncRNA可充當(dāng)生物標(biāo)志物更好地應(yīng)用于臨床診斷。但目前的研究仍具有局限性，影響各消化道腫瘤最具特異性的外泌體源性LncRNA尚需進(jìn)一步明確；同時(shí)歸納以及整理影響腫瘤的LncRNA也將有助于數(shù)據(jù)庫的建立，從而更好地完成從實(shí)驗(yàn)室走向臨床應(yīng)用。