趙佳偉， 施敏， 鄭金旭

(1. 江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 江蘇 鎮(zhèn)江 212013； 2. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院消化內(nèi)科， 上海 213300； 3. 江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

急性肝損傷是一種嚴(yán)重影響人生命健康甚至危及生命的疾病，其發(fā)病多與氧化應(yīng)激的發(fā)生相關(guān)，在氧化應(yīng)激發(fā)生時(shí)，肝臟內(nèi)活性氧水平大幅度上升[1]?；钚匝跄軌蛲ㄟ^脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)變性方式造成細(xì)胞的損傷和變性[2]，研究表明間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體能夠修復(fù)受損組織[3-4]。本研究旨在考察間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體對(duì)D-氨基半乳糖(D-galactosamine hydrochloride, D-GalN)/脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)誘導(dǎo)的急性肝損傷模型小鼠的治療效果。從細(xì)胞和動(dòng)物水平考察外泌體減輕氧化應(yīng)激、保護(hù)肝臟的效果，為急性肝損傷的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

DMEM、RMPI 1640培養(yǎng)基、α-MEM、胎牛血清、青霉素/鏈霉素雙抗溶液(美國Gibco公司)，胰酶(北京蘭博利德公司)，醋酸雙氧鈾(北京中鏡科儀技術(shù)有限公司)，L02人肝細(xì)胞系(上海中科院細(xì)胞庫)，CD9兔抗小鼠單克隆抗體、CD63小鼠抗小鼠單克隆抗體、山羊抗兔二抗、山羊抗小鼠二抗(英國Abcam公司)，BCA蛋白定量試劑盒(美國Thermo Scientific公司)，小鼠成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)試劑盒(賽業(yè)生物有限公司)，丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)測(cè)定試劑盒(日本Toshiba公司)，電泳儀(美國Bio-Rad公司)，多色熒光凝膠成像儀(以色列DNR公司)，CCK-8試劑盒、二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯(2′,7′-dichlorofluorescin diacetate, DCFH-DA)活性氧熒光探針、D-GalN、LPS、超氧化物歧化酶活性檢測(cè)試劑盒、丙二醛含量檢測(cè)試劑盒、過氧化氫酶活性檢測(cè)試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)，JEM-1400透射電鏡(日本電子株式會(huì)社)、尼康A(chǔ)1型激光共聚焦顯微鏡(日本Nikon公司)，Vectra熒光顯微鏡(美國Perkin Elmer公司)，NTA納米顆粒跟蹤分析儀(德國Particle Metrix公司)，全自動(dòng)生化分析儀(日本Toshiba公司)。

1.2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定

采用全骨髓法提取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。5～6周的雌性Balb/c小鼠處死后消毒備用，取出小鼠的股骨和脛骨，將骨髓沖出，轉(zhuǎn)移至50 mL無菌離心管，1 500 r/min離心5 min。加入紅細(xì)胞裂解液將紅細(xì)胞裂解，重復(fù)洗滌2次。獲取的細(xì)胞接種在6孔板內(nèi)，然后將細(xì)胞放入培養(yǎng)箱中靜置。培養(yǎng)48～72 h后第1次給細(xì)胞換液，培養(yǎng)至第10～14 d時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞傳代。利用流式細(xì)胞儀對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞表面的CD29、CD31、CD44、和CD117蛋白進(jìn)行鑒定。使用成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)干細(xì)胞的成骨分化。

1.3 間充質(zhì)干細(xì)胞的外泌體提取

預(yù)先使用超速離心機(jī)100 000×g離心4 h去除胎牛血清中的外泌體。取傳代至第三代的間充質(zhì)干細(xì)胞接種于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，收集間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞上清液。300×g離心10 min去除細(xì)胞，2 000×g離心10 min去除死細(xì)胞，10 000×g離心30 min去除細(xì)胞碎片，100 000×g離心2次各70 min，最終獲得外泌體[5]。利用BCA試劑盒測(cè)定外泌體的濃度。獲得的外泌體短期4℃儲(chǔ)存，長期-80℃凍存。

1.4 透射電鏡下觀察外泌體形態(tài)

取1滴外泌體滴加在普通碳支持膜銅網(wǎng)上，室溫靜置5 min，之后吸去多余液體，室溫靜置風(fēng)干，滴加10 μL醋酸雙氧鈾溶液負(fù)染1 min。再次吸去多余液體，室溫風(fēng)干后在透射電鏡下觀察外泌體的形態(tài)。

1.5 納米顆粒追蹤分析儀檢測(cè)外泌體粒徑

使用雙蒸水稀釋收集的外泌體(1 ∶5 000～1 ∶ 20 000)至適宜濃度后上機(jī)檢測(cè)，每次上樣量不少于3 mL，調(diào)整參數(shù)設(shè)置方案后對(duì)樣品的粒徑和電位進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法鑒定外泌體表面標(biāo)志蛋白

配制10%的分離膠和5%的濃縮膠，每孔上樣約30 μg。分別使用90 V和120 V的恒定電壓進(jìn)行電泳。恒定電壓100 V的條件下電轉(zhuǎn)1 h，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后取出PVDF膜，放于5%脫脂牛奶封閉液中，脫色搖床上常溫封閉1 h。一抗選用兔抗小鼠CD9抗體(1 ∶ 2 000)和小鼠抗小鼠CD63抗體(1 ∶ 1 000)，放入4℃冰箱孵育過夜。二抗選用辣根氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔(1 ∶ 3 000)和山羊抗小鼠二抗(1 ∶2 000)，脫色搖床上室溫放置1 h。滴加DAB發(fā)光液顯色并拍照。

1.7 L02細(xì)胞內(nèi)活性氧含量檢測(cè)

L02肝細(xì)胞傳代后接種在玻璃底的24孔板內(nèi)，培養(yǎng)基使用RMPI 1640(10%血清和1%雙抗)，分為對(duì)照組，H2O2損傷(PBS)組，H2O2損傷+Exo(Exo)組，除對(duì)照組外其他組均加入0.2 mmol/L的H2O2溶液。共同孵育24 h后，置換含有DCFH-DA 活性氧熒光探針的培養(yǎng)基，按說明書進(jìn)行操作后放置于熒光顯微鏡下觀察。

1.8 CCK-8法檢測(cè)L02細(xì)胞活性

L02肝細(xì)胞傳代后接種在96孔板內(nèi)，每孔約8 000個(gè)細(xì)胞，分別加入0，0.5,1,2.5,5,10,15,20 μg/mL Exo納米顆粒，細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24或48 h，使用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活性。另外，96孔板內(nèi)接種L02細(xì)胞后，培養(yǎng)基使用含0.2 mmol/L的H2O2溶液，同時(shí)加入0,1,2.5,5,10 μg/mL Exo納米顆粒，檢測(cè)Exo對(duì)受自由基損傷的L02細(xì)胞的保護(hù)作用。

1.9 丙二醛含量檢測(cè)

稱取約0.1 g肝臟組織，加入1 mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿； 8 000×g4℃離心10 min，取上清液，置冰上待測(cè)。依次加入丙二醛檢測(cè)工作液、蒸餾水、樣本和試劑，混合液在100℃水浴中保溫60 min后，置于冰浴中冷卻，10 000×g常溫離心10 min。最后吸取200 μL上清液于96孔板中檢測(cè)450、532和600 nm處的光密度(D)值。

1.10 過氧化氫酶含量檢測(cè)

稱取約0.1 g肝臟組織，加入1 mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿； 8 000×g4℃離心10 min，取上清液，置冰上待測(cè)。過氧化氫酶檢測(cè)工作液37℃水浴15 min，96孔板中加入10 μL樣本和190 μL工作液，立即混勻并計(jì)時(shí)，記錄240 nm下初始1 min和2 min后的D值(D1和D2)。

1.11 超氧化物歧化酶含量檢測(cè)

稱取約0.1 g肝臟組織，加入1 mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿； 8 000×g4℃離心10 min，取上清液，置冰上待測(cè)。依次加入樣品和試劑盒中的試劑。充分混勻，37℃水浴30 min后，560 nm處測(cè)定各管D值。

1.12 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

SPF級(jí)5～6周雌性Balb/c小鼠30只，體重為(20±2)g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)1118032100038。小鼠在適宜條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由飲食。

肝損傷模型制備：配制50 g/L 的D-GalN溶液以及1 g/L 的LPS溶液，放置于4 ℃?zhèn)溆?，現(xiàn)配現(xiàn)用。Balb/c小鼠分為3組，分別為對(duì)照組，D-GalN/LPS肝損傷組(PBS組)，D-GalN/LPS肝損傷Exo治療組(Exo組)。PBS組和Exo組小鼠每只按照500 mg/kg D-GalN以及10 μg/kg LPS的比例混合后腹腔注射D-GalN/LPS的混合溶液，對(duì)照組腹腔注射等體積的PBS緩沖液。模型制備后立即給予治療，Exo組尾靜脈給予2.5 mg/kg小鼠體重的外泌體，PBS組和對(duì)照組尾靜脈給予等體積的PBS緩沖液。8 h后在肝損傷達(dá)到高峰時(shí)處死小鼠，收集血清檢測(cè)轉(zhuǎn)氨酶水平，取出小鼠肝臟用于HE染色。

1.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定

小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞原代細(xì)胞培養(yǎng)到第3代之后純度較高，此時(shí)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物CD29、CD44呈陽性表達(dá)，陽性率大于95%，CD31和CD117 呈陰性表達(dá)(圖1A)。

間充質(zhì)干細(xì)胞具有分化能力，用成骨分化培養(yǎng)基培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞，3周后進(jìn)行茜素紅染色，顯微鏡下觀察到成骨分化后的細(xì)胞外面的沉積鈣結(jié)節(jié)與茜素紅染液結(jié)合，鈣結(jié)節(jié)被染成深紅色(圖1B)。

2.2 外泌體的鑒定

外泌體為粒徑50～150 nm的囊泡，電鏡下表現(xiàn)為橢圓形或“茶托形”(圖2A、2B)。在可視化操作界面下，能夠觀察到納米顆粒分散較為均一，沒有明顯的團(tuán)聚現(xiàn)象(圖2C)。蛋白印跡實(shí)驗(yàn)觀察到CD9的一條條帶，而CD63由于蛋白磷酸化的關(guān)系，通常含有兩個(gè)條帶(圖2D)。

A：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)；B：成骨分化染色(×100)

A：外泌體透射電鏡(×30 000)；B：外泌體粒徑電位；C：粒徑追蹤分析(×300)；D：蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)CD63和CD9表達(dá)

2.3 L02細(xì)胞活性氧水平及細(xì)胞活性的考察

結(jié)果表明，H2O2刺激后，PBS組L02細(xì)胞在共聚焦顯微鏡下表現(xiàn)出明顯的熒光信號(hào)，強(qiáng)于對(duì)照組，而Exo治療組的熒光信號(hào)明顯下降，說明Exo治療組中細(xì)胞內(nèi)活性氧水平下降(圖3A)。

不同濃度外泌體與L02細(xì)胞共同孵育24或48 h，細(xì)胞活性沒有明顯改變(圖3B)，說明間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體對(duì)細(xì)胞本身沒有毒性。將L02細(xì)胞與0.2 mmol/L的H2O2溶液共同孵育，并在培養(yǎng)基中加入不同濃度的間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體，結(jié)果表明，相較于H2O2刺激組，加入10 μg/mL外泌體后L02細(xì)胞活性明顯增加(t=9.731，P<0.05)，見圖3C。

2.4 外泌體緩解D-GalN/LPS誘導(dǎo)的小鼠肝損傷

由圖4A可見，模型小鼠的肝臟中出現(xiàn)了大量的脂肪變性和炎癥細(xì)胞浸潤，相較于對(duì)照組有明顯的肝臟損傷；Exo組能夠減輕肝臟的損傷，減少肝臟內(nèi)細(xì)胞的脂肪變性和炎癥細(xì)胞浸潤，說明外泌體對(duì)急性肝損傷小鼠具有良好的治療作用。小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶檢測(cè)結(jié)果表明，PBS組丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶水平較對(duì)照組升高(t=10.55,P<0.01;t=9.16,P<0.01)，而在外泌體治療后，相較于PBS組，Exo組丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶水平明顯降低(t=9.048，P<0.05)，天冬轉(zhuǎn)氨酶水平也明顯下降(t=8.328，P<0.05)，見圖4B、4C。

A：L02細(xì)胞活性氧熒光探針檢測(cè)活性氧；B：外泌體對(duì)L02細(xì)胞的毒性檢測(cè)；C：外泌體改善H2O2導(dǎo)致的L02細(xì)胞活性下降

2.5 外泌體改善肝臟氧化應(yīng)激損傷

PBS組丙二醛水平較對(duì)照組明顯升高(t=4.294,P<0.05)，表明肝臟受到了氧化應(yīng)激損傷，Exo組較PBS組丙二醛水平顯著下降(t=4.644,P<0.05)；PBS組過氧化氫酶和超氧化物歧化酶的活性較對(duì)照組明顯下降(t=6.822,P<0.05;t=4.119,P<0.05)，Exo組過氧化氫酶水平較PBS組顯著上升(t=5.104,P<0.05)，超氧化物酶水平較PBS組升高(t=3.450,P<0.05)，見圖5。

A：各組肝臟組織HE染色；B：丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶檢測(cè)；C：天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶檢測(cè)；a:P<0.01,與對(duì)照組比較；b：P<0.05，與PBS組比較

a:P<0.05,與對(duì)照組比較；b：P<0.05，與PBS組比較

3 討論

急性肝損傷多表現(xiàn)為肝功能急劇下降，嚴(yán)重時(shí)甚至完全喪失，同時(shí)并發(fā)其他臟器的功能障礙。國內(nèi)病因大多與肝炎病毒的感染有關(guān)，在歐美國家則主要?dú)w因于過量飲酒，其他因素如有毒的化學(xué)物質(zhì)、脂肪肝和藥物也可以引起急性肝臟損傷[6-7]。在氧化應(yīng)激發(fā)生時(shí)，體內(nèi)氧化劑和抗氧化劑水平發(fā)生紊亂，導(dǎo)致肝臟內(nèi)活性氧水平大幅度上升?；钚匝踉斐杉?xì)胞和組織的嚴(yán)重?fù)p傷。因此，有必要尋找一種能夠清除活性氧，保護(hù)肝臟免受損傷，促進(jìn)肝臟損傷修復(fù)的治療方法[8]。

多項(xiàng)研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)于多種組織臟器的損傷具有修復(fù)功能，Cheng等[9]在順鉑誘導(dǎo)的腎臟損傷小鼠模型中使用了間充質(zhì)干細(xì)胞治療，發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞能夠通過分泌一系列有效的細(xì)胞因子，促進(jìn)腎臟的損傷修復(fù)，減少順鉑導(dǎo)致的腎小管細(xì)胞毒性。間充質(zhì)干細(xì)胞治療具有明顯的治療效果，但也存在一些隱患。一方面是間充質(zhì)干細(xì)胞的大小，在全身血管中流動(dòng)存在一定的困難，在體循環(huán)過程中可能會(huì)滯留在肺部血管導(dǎo)致肺栓塞[10-11]；另一方面是細(xì)胞的活性，間充質(zhì)干細(xì)胞輸入到活體組織后，細(xì)胞活性得不到維持。[11]。

外泌體作為天然分泌的納米級(jí)囊泡，具有多種生物學(xué)功能，近年來愈發(fā)受到國內(nèi)外研究者的關(guān)注[12-14]。Gangadaran等[15]研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞的外泌體能夠通過激活血管內(nèi)皮生長因子受體來加速四肢缺血性損傷的恢復(fù)過程。本研究選用間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體作為治療急性肝損傷的藥物。首先，進(jìn)行間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)、外泌體的收集與鑒定；其次，考察間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體對(duì)肝細(xì)胞的保護(hù)作用；最后，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體對(duì)肝損傷小鼠肝臟組織具有保護(hù)作用，降低肝臟的轉(zhuǎn)氨酶水平，下調(diào)丙二醛含量，提高過氧化氫酶和超氧化物酶的活性。

間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體在氧化應(yīng)激損傷中發(fā)揮著重要的損傷修復(fù)作用，能夠?qū)Ω渭?xì)胞損傷、心臟損傷、腎臟損傷和神經(jīng)元損傷等產(chǎn)生修復(fù)作用[16]。Jiang等[17]研究發(fā)現(xiàn)，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體通過抑制氧化應(yīng)激損傷保護(hù)CCl4誘導(dǎo)的肝損傷，但未對(duì)深層次機(jī)制做出解釋。Yan等[18]則發(fā)現(xiàn)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體能夠改善CCl4誘發(fā)的小鼠肝衰竭，減少肝臟細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷和凋亡，從機(jī)制上來說，干細(xì)胞來源的外泌體內(nèi)含有谷胱甘肽過氧化物酶，能夠分解體內(nèi)的過氧化物，減少自由基帶來的損傷，外泌體通過遞送谷胱甘肽過氧化物酶減少肝臟細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷以及細(xì)胞凋亡。Wang等[19]的研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體能夠促進(jìn)心肌梗死大鼠模型中心臟的損傷修復(fù)，這一組織損傷修復(fù)作用可能與外泌體內(nèi)含有的生物活性物質(zhì)相關(guān)，這些生物活性物質(zhì)能夠激活受體細(xì)胞下游的信號(hào)通路，從而發(fā)揮組織修復(fù)作用。Lin等[20]研究表明，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體能夠保護(hù)缺血再灌注損傷腎臟的組織結(jié)構(gòu)和功能，減少缺血再灌注導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷，下調(diào)了氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步研究表明這一作用依賴于外泌體促進(jìn)血管新生的功能，增加了腎臟的血液流動(dòng)。

綜上，本研究結(jié)果顯示間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體能夠通過調(diào)控氧化應(yīng)激來保護(hù)肝臟細(xì)胞，減少肝臟損傷，促進(jìn)肝臟組織的修復(fù)，為急性肝損傷的治療提供了新的思路。