張鶴 劉雪梅 曾子修 劉曉漢 張昕洋 田楊 徐榛敏 張?jiān)蕩X

能量代謝紊亂被認(rèn)為是腦梗死急性期主要病理機(jī)制之一,腦缺血是線粒體損傷的重要因素,線粒體作為細(xì)胞代謝的重要場(chǎng)所,其損傷主要體現(xiàn)在ATP合成減少、氧化損傷及鈣離子穩(wěn)態(tài)失調(diào)等,這些損傷共同作用誘導(dǎo)線粒體通透性改變,從而誘發(fā)神經(jīng)元的凋亡[1-2]。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是細(xì)胞能量感應(yīng)分子,具有感知細(xì)胞能量狀態(tài)的功能,可調(diào)節(jié)細(xì)胞的新陳代謝、周期進(jìn)程及細(xì)胞生長(zhǎng)[3]。研究表明[4-5],mTOR通過(guò)雌激素相關(guān)受體 α(estrogenrelated receptor α,ERRα) 可 調(diào)控谷氨酰 胺酶(glutaminase,GlS),從而影響線粒體谷氨酰胺的回補(bǔ)代謝,為三羧酸循環(huán)(tricarboxylic acid,TCA)和脂質(zhì)合成等能量代謝提供一定的物質(zhì)基礎(chǔ)。

苦碟子注射液具有活血止痛、清熱祛瘀的功效。臨床研究發(fā)現(xiàn)[6],苦碟子注射液對(duì)腦梗死急性期血瘀證兼熱證或熱證均具有良好的臨床效果；注射用血栓通具有活血祛瘀、通脈活絡(luò)的功效。二藥目前都已是上市的臨床一線用藥,單獨(dú)使用治療腦梗死均有一定的療效,二藥聯(lián)合治療腦梗死是否可起到協(xié)同增效的目的及其作用機(jī)制仍不明確。因此,在本次研究中,借助大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞腦梗死(middle cerebral artery occlusion rats,MCAO)模型,從mTOR-ERRα-GLS信號(hào)通路的角度探討清熱活血中藥聯(lián)用(苦碟子注射液+注射用血栓通)的協(xié)同增效作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠95只,體重(200±20)g,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006。大鼠飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,室溫22～25℃,濕度40%～60%,12小時(shí)晝夜交替。本次實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)東方醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 藥物與試劑

苦碟子注射液(通化華夏藥業(yè)有限責(zé)任公司,Z20025450)；注射用血栓通(凍干)(廣西梧州制藥(集團(tuán))股份有限公司,15030509)；2,3,5-三苯基氯化四氮唑(Sigma,T8877)；蛋白提取液(天德悅生物科技有限公司,WB0028)；BCA蛋白濃度測(cè)定套裝(天德悅生物科技有限公司,WB0028)；SDS-PAGE預(yù)制膠套裝(北京百奧思科生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司,MD911919)；蛋白上樣buffer(Amresco,0332)；封閉液(Proteintech B400040)；電泳液(北京百奧思科生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司,MD6620)；轉(zhuǎn)膜液(北京百奧思科生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司,MD6621)；中等蛋白分子量 marker(Thermo,26617)；酶標(biāo)二抗羊抗鼠(北京百奧思科生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司,MD2142)；酶標(biāo)二抗羊抗兔(天德悅生物科技有限公司S004)；Anti-Glutaminase antibody(Abcam,Ab93434)；mTOR Antibody(Thermo Fisher,2972)；Anti-Estrogen Related Receptor alpha antibody(Abcam,Ab76288)。

1.3 主要儀器與耗材

MCAO栓線(北京西濃科技有限公司,A4-243250)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科技有限公司,DHG-9145A)；制冰機(jī)(SCOTSMAN,AF10)；低溫離心機(jī)(Sigma,3-30K)；去離子水儀(PALL,Purelab Plus)；PVDF 膜(Millipore,ISEQ00010)；脫色搖床(海門(mén)其林貝爾儀器制造公司,TS-100)；旋渦混勻器(海門(mén)麒麟醫(yī)用儀器廠,XW-80A型)；電泳儀(北京百晶生物技術(shù)有限公司,BG-subMIDI)；SDS-PAGE電泳系統(tǒng)(Bio-rad Mini-PROTEAN?)；凝膠成像系統(tǒng)(UVP,GelDoc-It310)；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Bio-rad 170-8280)。

1.4 急性腦缺血再灌注大鼠模型

參照Longa等[7]建立改良的線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞腦梗死模型,缺血1.5小時(shí),再灌注72小時(shí)。采用10%水合氯醛按照400 mg/kg進(jìn)行腹腔麻醉。麻醉后將大鼠仰臥位固定于手術(shù)臺(tái),頸部正中切口,逐層分離,暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈(common carotid artery,CCA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(internal carotid artery,ICA)和頸外動(dòng)脈(external carotid artery,ECA)。結(jié)扎CCA近心端及ECA,動(dòng)脈夾夾閉左側(cè)CCA,于CCA剪開(kāi)一斜口,將頂端光滑的魚(yú)線通過(guò)斜口插入,打開(kāi)動(dòng)脈夾,靜CCA分叉處進(jìn)入ICA直至大腦大腦中動(dòng)脈(middle carotid artery,MCA),結(jié)扎CCA遠(yuǎn)心端固定魚(yú)線,逐層縫合皮膚,魚(yú)線殘留端1 cm左右暴露于體外。缺血1.5小時(shí)后拔出魚(yú)線,再灌注72小時(shí)。

1.5 動(dòng)物分組與給藥

術(shù)后待大鼠清醒后根據(jù)Longa等[7]評(píng)分隨機(jī)分為模型組、清熱組、活血組和清熱活血組。假手術(shù)組,操作同模型組,暴露血管,但不進(jìn)行插線操作。本次實(shí)驗(yàn)共分為5組,每組19只。

根據(jù)大鼠體表面積公式dB(mg/kg)=dA×(RB/RA)×(WA/WB)1/3,其中dB是大鼠的公斤體重劑量,dA是人的公斤體重劑量,WA、WB是已知人和大鼠的體重,RA、RB是體型系數(shù)(RA=0.1,RB=0.09)。經(jīng)計(jì)算給予清熱組大鼠苦碟子注射液3.6 mL/kg,活血組給予注射用血栓通40 mg/kg。根據(jù)團(tuán)隊(duì)前期研究結(jié)果[8],清熱活血組劑量為苦碟子注射液1.8 mL/kg,1小時(shí)后予注射用血栓通80 mg/kg,假手術(shù)組大鼠不予處理,模型組予3.6 mL/kg生理鹽水。給藥采用腹腔注射的方式,術(shù)后3小時(shí)給藥一次,以后每天給藥1次,共給藥4次。

1.6 大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分

神經(jīng)行為學(xué)觀察：根據(jù)Garcia JH等[9]評(píng)分從6個(gè)方面來(lái)評(píng)定大鼠神經(jīng)功能損傷情況,即大鼠自主運(yùn)動(dòng)、體態(tài)對(duì)稱(chēng)性、前肢伸展功能、網(wǎng)屏實(shí)驗(yàn)、身體雙側(cè)觸覺(jué)和雙側(cè)胡須反射,神經(jīng)功能無(wú)缺損得分最高為18分,神經(jīng)功能損傷最嚴(yán)重者得分最低為0分。

1.7 TTC染色法評(píng)價(jià)腦梗死體積

處死動(dòng)物,快速取腦,置于-20℃,冰凍15分鐘,將腦組織由前向后冠狀切片,切為5片,厚度約為2 mm,浸泡于1%的2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-triphenyltetraznlium chloride,TTC)染液中,37℃避光孵育15～20分鐘,用4%多聚甲醛溶液固定腦切片,每組8只。腦梗死體積按如下公式計(jì)算：梗死半球體積百分比(%)=(各腦切片梗死面積×切片厚度之和)/(各腦切片面積×切片厚度之和)×100%。

1.8 干濕重法檢測(cè)腦含水量

提取各組大鼠左側(cè)大腦半球并稱(chēng)重,將腦組織置于110℃干燥箱中烘烤24小時(shí),將腦組織取出后立即稱(chēng)量缺血腦半球的干重,按照Billiot公式計(jì)算腦含水量：腦含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.9 Western blot法檢測(cè) mTOR、ERRα、GLS蛋白表達(dá)

提取各組大鼠左側(cè)大腦皮層組織總蛋白,加適量蛋白酶抑制劑的裂解液,冰上勻漿,在4℃ 條件下離心13000 r/min,20分鐘,取上清液,置于-80℃保存；BCA法蛋白定量,濃度測(cè)定后,加入5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液,混勻,濕法轉(zhuǎn)膜,放入5% 脫脂奶粉中封閉,室溫下?lián)u床震蕩1小時(shí)。5%脫脂奶粉配制一抗,mTOR兔多克隆抗體(1∶200),ERRα小鼠單克隆抗體(1∶100),GLS兔多克隆抗體(1∶100),β-action(1 ∶500)。PBST漂洗5分鐘×3次,加入辣根酶標(biāo)記羊抗兔、羊抗鼠二抗(1∶3000),室溫下?lián)u床震蕩1小時(shí)。PBST漂洗5分鐘×3次。滴加 ECL發(fā)光液1分鐘,置于成像系統(tǒng)曝光顯影條帶。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,運(yùn)用Image J軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行光密度值分析,以β-actin為內(nèi)參。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)來(lái)表示,組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 各組急性腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能評(píng)分

造模后,大鼠出現(xiàn)左側(cè)(同側(cè))Horner征陽(yáng)性,眼瞼下垂,眼裂變小,眼球內(nèi)陷及瞳孔縮小。右側(cè)(對(duì)側(cè))肢體活動(dòng)功能障礙,肌力減退,提尾懸空時(shí)呈強(qiáng)迫體態(tài),軀體向右側(cè)扭轉(zhuǎn),雙上肢交叉。與假手術(shù)相比,模型組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分顯著性降低(P＜0.01)。與模型相比,三個(gè)中藥組大鼠的神經(jīng)功能缺損均有改善(P＜0.05),但中藥各組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),詳見(jiàn)表1。

表1 各組急性腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較(±s)

表1 各組急性腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較(±s)

注：與假手術(shù)組相比,aP＜0.01；與模型組相比,bP＜0.05。

組別 鼠數(shù) 神經(jīng)功能評(píng)分(分)19 17.83±0.40模型組 19 10.20±1.03a清熱組 19 11.75±2.49b活血組 19 11.87±1.45b清熱活血組 19 13.11±1.45假手術(shù)組b

2.2 TTC染色測(cè)定各組急性腦缺血再灌注大鼠腦梗死體積

對(duì)大鼠腦組織切片進(jìn)行TTC染色,紅色為正常組織,白色則為梗死灶。假手術(shù)組大鼠腦切片染色后呈現(xiàn)紅色,模型組大鼠左側(cè)大腦皮層海馬及紋狀體可見(jiàn)白色梗死灶,各組中藥治療后腦梗死體積都有一定的改善。與模型組相比,中藥各組腦梗死體積均顯著性降低(P＜0.01)。在三個(gè)中藥組之間,清熱活血組大鼠腦梗死體積較清熱組和活血組大鼠腦梗死體積都有所降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),清熱組和活血組兩組間無(wú)明顯差異(P＞0.05),詳見(jiàn)圖1、表2。

表2 各組急性腦缺血再灌注大鼠腦梗死體積比較(±s)

表2 各組急性腦缺血再灌注大鼠腦梗死體積比較(±s)

注：與模型組相比,aP＜0.01；與清熱組及活血組相比,bP＜0.05。

組別 鼠數(shù) 腦梗死體積(%)33.16±4.02清熱組 8 27.83±2.56a活血組 8 25.33±2.66a清熱活血組 8 20.01±2.88模型組8 ab

2.3 各組急性腦缺血再灌注大鼠術(shù)后腦含水量的測(cè)定

造模后,大鼠腦組織都有一定程度的水腫,大鼠腦含水量增加。模型組大鼠腦含水量顯著高于假手術(shù)組(P＜0.01)。與模型組相比,各中藥組大鼠腦含水量顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)。各中藥組間比較無(wú)明顯差異(P＞0.05),詳見(jiàn)表3。

圖1 各組急性腦缺血再灌注大鼠腦組織TTC染色

表3 各組急性腦缺血再灌注大鼠術(shù)后腦含水量比較(±s)

表3 各組急性腦缺血再灌注大鼠術(shù)后腦含水量比較(±s)

注：與假手術(shù)組相比,aP＜0.01；與模型組相比,bP＜0.05,cP＜0.01。

組別 鼠數(shù) 腦含水量(%)77.10±0.49模型組 8 80.20±0.97a清熱組 8 79.10±0.61b活血組 8 78.20±1.20c清熱活血組 8 78.60±0.88假手術(shù)組8 c

2.4 各組急性腦缺血再灌注大鼠梗死側(cè)皮層mTOR-ERRα-GLS蛋白的表達(dá)

mTOR-ERRα-GLS信號(hào)通路蛋白表達(dá)情況如圖2、表4所示。與假手術(shù)組相比,模型組mTOR表達(dá)水平顯著降低(P＜0.01)。與模型組相比,清熱活血組mTOR表達(dá)增加(P＜0.05),清熱組和活血組mTOR有升高的趨勢(shì),但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

與假手術(shù)組相比,模型組ERRα表達(dá)顯著降低(P＜0.01)。與模型組相比,清熱組、活血組及清熱活血組ERRα表達(dá)水平均顯著增加(P＜0.01)。與清熱組相比,清熱活血組 ERRα表達(dá)增加(P＜0.05),清熱組與活血組之間ERRα表達(dá)無(wú)明顯差異(P＞0.05)。

與假手術(shù)組相比,模型組GLS表達(dá)顯著降低(P＜0.01)。與模型組相比,各中藥組GLS表達(dá)水平增加(P＜0.05或P＜0.01)。與清熱組相比,活血組、清熱活血組GLS表達(dá)增加(P＜0.05)。

圖2 各組大鼠梗死側(cè)皮層mTOR-ERRα-GLS蛋白的表達(dá)情況

表4 各組急性腦缺血再灌注大鼠mTOR-ERRα-GLS信號(hào)通路蛋白表達(dá)情況(n=3)

3 討論

腦梗死屬于中醫(yī)中風(fēng)病的范疇,其病因病機(jī)百家爭(zhēng)鳴、學(xué)說(shuō)頗多。劉完素提出“火熱致中”的理論為后世醫(yī)家開(kāi)啟了內(nèi)傷中風(fēng)的先河。目前公認(rèn)中風(fēng)病的病理因素主要包括風(fēng)(肝風(fēng))、火(心火、肝火)、痰(風(fēng)痰、濕痰)、血(血瘀)、氣(氣逆)、虛(陰虛、氣虛)六端,這些病理因素相互作用、相互影響,在腦梗死發(fā)生發(fā)展過(guò)程中常常為多種證素的組合,因此在治療上采用單一的治則不能滿足所有的證候,從而致療效受限。目前,腦梗死急性期多從“熱”、從“瘀”論治,本團(tuán)隊(duì)前期臨床研究發(fā)現(xiàn)[10],腦梗死急性期患者多表現(xiàn)多為昏瞀、不語(yǔ)、目眵多糊、呼吸急促、口臭、脈疾、痰色黃等火熱表征；除此之外,亦有瘀血表象,如面色晦暗、肌膚甲錯(cuò)等,苦碟子注射液具有清熱功效,注射用血栓通活血效力顯著,二者聯(lián)用,清熱與活血的藥效互補(bǔ),因此,提出了聯(lián)用清熱及活血中藥注射液治療腦梗死急性期可提高臨床療效的設(shè)想。在本次研究中觀察MCAO術(shù)后大鼠出現(xiàn)同側(cè)Horner征陽(yáng)性,對(duì)側(cè)肌力減退,走路時(shí)轉(zhuǎn)向病灶側(cè),提尾時(shí)身體扭向健側(cè),上述表現(xiàn)提示造模成功。缺血再灌注損傷后,大鼠神經(jīng)功能缺損明顯,各個(gè)治療組大鼠的神經(jīng)功能缺損及腦梗死體積較模型組都得到改善,而清熱組及清熱活血組改善效果更為明顯。在缺血再灌注過(guò)程中,大鼠腦組織出現(xiàn)了水腫,腦含水量增加,其中活血組及清熱活血組療效更為顯著。結(jié)合上述所有療效指標(biāo),可以看出苦碟子注射液、注射用血栓通聯(lián)合應(yīng)用對(duì)缺血再灌注損傷療效更佳。

能量障礙通常出現(xiàn)在腦缺血再灌注損傷的急性缺血期,由于血管閉塞,缺血缺氧造成各種神經(jīng)元細(xì)胞正常生理活動(dòng)所需能量物質(zhì)不能及時(shí)送達(dá),線粒體損傷及ATP生成障礙,從而導(dǎo)致能量代謝紊亂[11]。研究發(fā)現(xiàn)[12-13],苦碟子注射液及注射用血栓通均具有改善能量代謝障礙的藥理作用,故本研究從mTOR-ERRα-GLS信號(hào)通路為切入點(diǎn)觀察清熱活血中藥聯(lián)用協(xié)同增效的作用機(jī)制。mTOR的活性受到缺氧、ATP耗竭和DNA損傷的抑制,亦可被營(yíng)養(yǎng)和生長(zhǎng)因子的激活[14]。目前mTOR通路在腦缺血損傷過(guò)程中發(fā)揮的作用仍存在爭(zhēng)議。研究表明[15-16],幾種神經(jīng)保護(hù)劑如抗氧化劑褪黑素、雌二醇和水飛薊賓等可上調(diào)mTOR的表達(dá)。亦有研究報(bào)道[17],mTOR抑制劑在體外糖氧剝奪離體腦缺血模型中減輕了缺血對(duì)細(xì)胞損傷。在本次實(shí)驗(yàn)中,模型組 mTOR的表達(dá)降低,清熱活血組上調(diào)了mTOR的表達(dá)。mTOR通過(guò)ERRα可調(diào)控GLS,從而調(diào)節(jié)谷氨酰胺的含量。谷氨酰胺是人體內(nèi)含量最豐富的游離氨基酸。雖然谷氨酰胺不是必需氨基酸,但它可為細(xì)胞生長(zhǎng)提供最重要的含氮、含碳營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),并為細(xì)胞生長(zhǎng)提供能量[18]。谷氨酰胺提供能量的方式有兩種,一種是脫氨基生成谷氨酸,谷氨酸脫氨基生成α-酮戊二酸直接參與三羧酸循環(huán)循環(huán),另外一種是補(bǔ)充三羧酸循環(huán)合成的原料,即檸檬酸,使三羧酸循環(huán)循環(huán)順暢的進(jìn)行[19]。清熱組和活血組中ERRα、GLS較模型組表達(dá)增加,但只有清熱活血組mTOR、ERRα、GLS表達(dá)均增加。由此,可以推測(cè)清熱活血組分治療腦梗死急性期可起到協(xié)同增效的目的,其作用機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)控mTOR-ERRα-GLS信號(hào)通路,與增加腦組織中能量代謝,改善腦組織能量代謝紊亂密切相關(guān)。