蔣芝 徐君 馮美江

PD是一種與年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病，以運(yùn)動(dòng)遲緩、靜止性震顫、姿勢(shì)平衡障礙和肌強(qiáng)直等癥狀為主要臨床表現(xiàn)。PD的具體病因及發(fā)病機(jī)制尚未明確，目前的治療方式只能改善臨床癥狀，并不能逆轉(zhuǎn)PD的病情進(jìn)展。近年來(lái)，干細(xì)胞移植治療PD引起了人們的關(guān)注。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord mesenchymalstemcell，HUC-MSCs）來(lái)源于新生兒的臍帶組織，具有來(lái)源廣泛、免疫源性低、取材無(wú)創(chuàng)性、無(wú)倫理問題、不受供體年齡因素影響等優(yōu)勢(shì)，成為干細(xì)胞移植治療PD的理想種子細(xì)胞［1］。研究證明，HUC-MSCs能被誘導(dǎo)分化為多巴胺能樣神經(jīng)元，移植治療PD大鼠模型后能改善其行為學(xué)癥狀［2-3］。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derivedneurotrophicfactor，BDNF）是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族中的一員，可促進(jìn)干細(xì)胞向神經(jīng)元的分化、成熟［4］，并提高移植的細(xì)胞在PD模型動(dòng)物腦內(nèi)的存活能力［5］。據(jù)一項(xiàng)meta分析顯示，PD病人血清中BDNF水平是降低的［6］。BDNF過表達(dá)載體的構(gòu)建，除了可補(bǔ)充PD病人BDNF的不足外，同時(shí)可提高移植細(xì)胞的存活率，可能是細(xì)胞移植治療PD不可或缺的部分。本研究旨在體外構(gòu)建并鑒定BDNF過表達(dá)的HUC-MSCs源性多巴胺能樣神經(jīng)元。

1 材料與方法

1.1 材料 熒光二抗（塞爾維生物公司），抗-NeuN抗體、抗-Nurr1抗體和抗-β-tubulinⅢ抗體（北京博奧森），抗-酪氨酸羥化酶（TH）抗體（購(gòu)自 Abcam），DAPI（南京貝斯特公司），pEGFP-N1-GFP-BDNF慢病毒載體（漢恒生物科技有限公司），堿性成纖維生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、成纖維生長(zhǎng)因子 8（fibroblast growth factor 8，F(xiàn)GF8）、N2 因子（武漢艾美捷科技有限公司），胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基（美國(guó)GIBCO公司），Lipofectamine 2000（上海嶸葳達(dá)實(shí)業(yè)有限公司），維生素C（Vit-c）、音猬因子（Sonic Hedgehog，SHH）、BDNF siRNA（5'-GCGCCCATGAAAGAAGTAA-3'，漢恒生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 HUC-MSCs的分離與培養(yǎng)：本實(shí)驗(yàn)遵循倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)和國(guó)家相關(guān)規(guī)范。在無(wú)菌條件下收集健康足月剖宮產(chǎn)新生兒臍帶組織（來(lái)自南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院），用生理鹽水沖洗后去除臍動(dòng)、靜脈，分離出華通氏膠并將其剪成約 1 mm的3塊小組織，接種于DMEM/F12完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)至90%融合度時(shí)進(jìn)行傳代。按照1：3傳代培養(yǎng)，取P3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 HUC-MSCs的誘導(dǎo)分化：將P3代以1×104個(gè)/孔密度接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后更換神經(jīng)誘導(dǎo)液［DMEM/F12、50μg/mLVit-c、250ng/mLSHH、100 ng/mL FGF8、50 ng/mL bFGF、N2因子（100×）］。誘導(dǎo)9 d后，向誘導(dǎo)液中加入50 ng/mL BDNF（加入BDNF時(shí)，24孔板不更換誘導(dǎo)液），繼續(xù)誘導(dǎo)3 d。每天觀察、拍照，將未誘導(dǎo)的HUC-MSCs作為對(duì)照。

1.2.3 免疫熒光鑒定：未分化的HUC-MSCs和HUCMSCs源性的多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞分別以2×105/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)。用4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS沖洗3次，每次5 min。5%小牛血清蛋白（BSA）常溫封閉20 min后，分別將兔抗 NeuN（稀釋濃度為 1：500）、兔抗 β-tubulinⅢ（1：1000）的一抗加入相應(yīng)孔中，4℃孵育過夜；加入相應(yīng)的熒光二抗（1：100）避光孵育1 h后，PBS沖洗3次，每次5 min；加入DAPI（1：1000）避光染色10 min；50%甘油封片。熒光顯微鏡下拍照，采用Image J軟件對(duì)熒光圖片進(jìn)行半定量分析。陽(yáng)性表達(dá)率=陽(yáng)性細(xì)胞/DAPI。

1.2.4 慢病毒介導(dǎo)的pEGFP-N1-GFP-BDNF的轉(zhuǎn)染與鑒定：將細(xì)胞分為HUC-MSCs組、多巴胺能樣神經(jīng)元組、多巴胺能樣神經(jīng)元+空載體組、多巴胺能樣神經(jīng)元+BDNF載體組和多巴胺能樣神經(jīng)元+BDNF siRNA組。將HUC-MSCs源性的多巴胺能樣神經(jīng)元細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)18～24h后，用含有6μg/mL polybrene的2 mL新鮮培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基，并加入30 μL的含有pEGFP-N1-GFP-BDNF的病毒懸液。37℃孵育4 h后，加入2 mL新鮮培養(yǎng)基稀釋polybrene，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用新鮮培養(yǎng)基替換含有病毒顆粒的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染48 h后，通過檢測(cè)綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的表達(dá)，證實(shí)慢病毒載體將GFPBDNF轉(zhuǎn)染到HUC-MSCs源性的多巴胺能樣神經(jīng)元中。應(yīng)用免疫熒光檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞Nurr1和TH的共表達(dá)情況，檢測(cè)方法同前，其中行熒光雙標(biāo)時(shí)將一抗混合液加入各組中孵育過夜，主要一抗：鼠抗Nurr1（1：1000）和兔抗 TH 的一抗（1：1000）。

1.2.5 BDNF siRNA轉(zhuǎn)染：HUC-MSCs源性的多巴胺能樣神經(jīng)元細(xì)胞接種于6孔板中，待培養(yǎng)至70%左右融合度后，用最低必需培養(yǎng)基改良型減血清培養(yǎng)基（Opti-MEMⅠ）稀釋的Lipofectamine 2000與BDNF siRNA分別在室溫下孵育5 min，輕輕混勻，再繼續(xù)孵育20 min，然后小心加入待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中。細(xì)胞在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育72h后，在熒光顯微鏡下拍照觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0和GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。2組間比較采用 t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。每組數(shù)據(jù)來(lái)自至少3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 分離培養(yǎng)及誘導(dǎo)后HUC-MSCs的形態(tài)學(xué)變化根據(jù)上述方法從臍帶組織中分離出HUC-MSCs，培養(yǎng)至P3代，可見細(xì)胞大小及形態(tài)較為一致，呈梭形細(xì)胞；誘導(dǎo)后細(xì)胞呈神經(jīng)元樣形態(tài)（圖1）。

圖1 誘導(dǎo)前后細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化（×100）

2.2 HUC-MSCs誘導(dǎo)分化后NeuN和 β-tubulinⅢ的表達(dá)與Nurr1和TH的共表達(dá) 免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，HUC-MSCs誘導(dǎo)分化后，神經(jīng)元特異性標(biāo)記物NeuN陽(yáng)性表達(dá)率為（53.88±1.31）%，較誘導(dǎo)前明顯增高（P＜ 0.01）；β-tubulin-Ⅲ陽(yáng)性表達(dá)率為（89.22±0.94）%，也較誘導(dǎo)前明顯增高（P＜0.001）（圖2）；且多巴胺能神經(jīng)元標(biāo)記物Nurr1和TH的共表達(dá)也顯著增加（P＜0.001）（圖 3）。

圖2 免疫熒光檢測(cè)誘導(dǎo)前后細(xì)胞中NeuN、β-tubulinⅢ的表達(dá)

圖3 免疫熒光檢測(cè)誘導(dǎo)前后細(xì)胞中Nurr1和TH的共表達(dá)

2.3 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞中GFP表達(dá) 熒光顯微鏡觀察結(jié)果表明，多巴胺能樣神經(jīng)元+空載體組、多巴胺能樣神經(jīng)元+BDNF載體組細(xì)胞中可見明顯的GFP表達(dá)；而HUC-MSCs組、多巴胺能樣神經(jīng)元組和多巴胺能樣神經(jīng)元+BDNFsiRNA組細(xì)胞皆未見明顯綠色熒光（圖4）。

圖4 熒光檢測(cè)各組細(xì)胞中GFP的表達(dá)（×200）

2.4 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞中Nurr1和TH的共表達(dá) 免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與HUC-MSCs組相比，多巴胺能樣神經(jīng)元組、多巴胺能樣神經(jīng)元+空載體組、多巴胺能樣神經(jīng)元+BDNF載體組的Nurr1和TH的共表達(dá)顯著增高（P＜0.001），多巴胺能樣神經(jīng)元+BDNF siRNA組也明顯增多（P＜0.01）。多巴胺能樣神經(jīng)元組和多巴胺能樣神經(jīng)元+空載體組之間Nurr1和TH的共表達(dá)無(wú)明顯差異（P＞0.05）。而多巴胺能樣神經(jīng)元+BDNF組Nurr1和TH的共表達(dá)較多巴胺能樣神經(jīng)元組、多巴胺能樣神經(jīng)元+空載體組明顯增多（P＜0.01）。多巴胺能樣神經(jīng)元+BDNF siRNA組Nurr1和TH的共表達(dá)較多巴胺能樣神經(jīng)元組和多巴胺能樣神經(jīng)元+空載體組明顯減少（P＜0.01），較多巴胺能樣神經(jīng)元+BDNF組也明顯降低（P＜0.001）（圖5）。

3 討論

圖5 免疫熒光檢測(cè)各組細(xì)胞Nurr1和TH共表達(dá)

研究證明，抑制BDNF的表達(dá)可導(dǎo)致大量多巴胺能神經(jīng)元丟失［7］。因此，BDNF對(duì)神經(jīng)元的發(fā)育、分化、存活和增殖起著重要的促進(jìn)作用，并可以促進(jìn)干細(xì)胞向神經(jīng)元的分化與成熟，促進(jìn)移植的多巴胺能樣神經(jīng)元存活以及多巴胺的釋放［8-9］。已有研究表明，BDNF對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病如PD、AD等均可發(fā)揮有效的治療作用［10-11］。

本研究在體外誘導(dǎo)分化HUC-MSCs，發(fā)現(xiàn)其不僅形態(tài)上趨向于神經(jīng)元，且神經(jīng)元特異性標(biāo)記物NeuN和β-tubulinⅢ表達(dá)明顯增加，過表達(dá)BDNF的細(xì)胞中，特異性多巴胺能神經(jīng)元標(biāo)記物Nurr1和TH的共表達(dá)明顯增高，證實(shí)BDNF可以促進(jìn)HUC-MSCs在體外向多巴胺能樣神經(jīng)元細(xì)胞分化，且分化后的細(xì)胞明顯增加。這可能是由于BDNF可通過MAPK/ERK和PI3K/Akt依賴的信號(hào)通路來(lái)刺激HUC-MSCs向神經(jīng)分化，并促進(jìn)分化后細(xì)胞的存活［12］，這也與以往的研究一致［13］。Nurr1是一種特異性表達(dá)于中腦多巴胺能神經(jīng)元的轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)節(jié)對(duì)氧化應(yīng)激的抗性，起到對(duì)多巴胺能神經(jīng)元保護(hù)的作用［12］。TH是多巴胺生物合成過程中的限速酶，被認(rèn)為是多巴胺能神經(jīng)元的特異性標(biāo)記物。轉(zhuǎn)染后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)BDNF的HUC-MSCs源性多巴胺能樣神經(jīng)元組中Nurr1和TH的共表達(dá)較HUC-MSCs源性多巴胺能樣神經(jīng)元組進(jìn)一步增加，BDNF siRNA干擾后細(xì)胞中的Nurr1和TH的共表達(dá)顯著減少。我們的結(jié)果又進(jìn)一步證明BDNF可促進(jìn)多巴胺能樣神經(jīng)元的分化與成熟。Chen等［15］發(fā)現(xiàn)，BDNF通過與高親和力受體TrkB結(jié)合，啟動(dòng)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路，進(jìn)一步抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)增殖，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞起保護(hù)作用。而BDNF促進(jìn)HUC-MSCs源性多巴胺能樣神經(jīng)元的轉(zhuǎn)化與成熟是否與PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)尚待進(jìn)一步研究。

總之，我們的研究結(jié)果表明，HUC-MSCs在體外可成功向多巴胺能樣神經(jīng)元誘導(dǎo)分化，慢病毒介導(dǎo)的BDNF轉(zhuǎn)染HUC-MSCs源性多巴胺能樣神經(jīng)元能促進(jìn)干細(xì)胞的分化和多巴胺能樣神經(jīng)元的存活和成熟。我們推測(cè)BDNF過表達(dá)的HUC-MSCs源性多巴胺能樣神經(jīng)元的構(gòu)建用于治療PD的療效可能優(yōu)于單純的干細(xì)胞移植，但結(jié)果如何仍需在今后的體內(nèi)試驗(yàn)中進(jìn)一步觀察與驗(yàn)證。