寧婷婷 徐俊玄 劉 思 閔 力 朱圣韜

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院消化分中心 國(guó)家消化系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 消化疾病癌前病變北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京消化中心，北京100050)

胃癌是嚴(yán)重危害人類健康的常見(jiàn)惡性腫瘤，根據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization, WHO)最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)[1]，2018年胃癌發(fā)病率和病死率分別位居全球惡性腫瘤的第五位和第三位。根據(jù)國(guó)家癌癥中心最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)[2]，2015 年我國(guó)新發(fā)胃癌病例約40 萬(wàn)，死亡病例約29 萬(wàn)，分別位居我國(guó)惡性腫瘤的第二位和第三位。胃癌的發(fā)病原因復(fù)雜，在分子水平上進(jìn)行機(jī)制研究，尤其是探索新的分子標(biāo)志物與治療靶點(diǎn)，對(duì)于促進(jìn)胃癌診療，提高患者的預(yù)后具有重要意義。

三結(jié)構(gòu)域蛋白(tripartite motif-containing protein，TRIM)家族成員廣泛、功能復(fù)雜，已被證實(shí)與細(xì)胞增生、DNA 損傷修復(fù)、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及免疫反應(yīng)等多種生理過(guò)程相關(guān)[3]。此外，TRIM家族蛋白參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，包括癌癥、炎性疾病、傳染性疾病、神經(jīng)精神疾病、染色體異常和發(fā)育性疾病等[4]。作為T(mén)RIM家族蛋白的一員，TRIM28可能參與了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。據(jù)報(bào)道[5-8]，乳腺癌、前列腺癌、肝細(xì)胞癌以及非小細(xì)胞肺癌等惡性腫瘤中，TRIM28作為致癌因子，可通過(guò)多條信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤的侵襲和遷移。然而TRIM28在胃癌中的表達(dá)、侵襲遷移等生物學(xué)功能及其潛在分子機(jī)制尚不清楚。本研究擬分析TRIM28在胃癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)情況以及TRIM28表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系，并進(jìn)一步通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討TRIM28表達(dá)調(diào)控對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響及潛在的分子作用機(jī)制，以期為胃癌患者提供新的診斷生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

TRIM28、β-catenin、c-Myc和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單抗購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司；二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；DMEM/F12培養(yǎng)基和磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和胰蛋白酶(Trypsin)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Lipofectamine 3000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。超純水儀購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；恒溫CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自日本三洋公司；無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)瓶和細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自美國(guó)Corning公司；多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)MD公司；TRIM28 siRNA購(gòu)自中國(guó)吉瑪基因公司。

1.2 生物信息分析

從TCGA官方網(wǎng)站上下載胃癌患者的mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)，分析比較胃癌患者與健康正常人中TRIM28的mRNA表達(dá)水平。同時(shí)利用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)分析TRIM28表達(dá)水平與胃癌患者預(yù)后的相關(guān)性。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

AGS人胃癌細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，培養(yǎng)于含10%(體積分?jǐn)?shù))FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基中，置于37℃含5%(體積分?jǐn)?shù))CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)AGS細(xì)胞密度至50%～70%，應(yīng)用Lipofectamine 3000試劑分別轉(zhuǎn)染control siRNA(健康對(duì)照組，NC組)以及TRIM28 siRNA(siTRIM28組)，依據(jù)轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。TRIM28 siRNA 購(gòu)自蘇州吉瑪有限公司。si-TRIM28-1序列為5′-GGAGAUGAUCCCUACUCAA-3′，si-TRIM28-2序列為5′-GCGUGCAAGUGGACGUUAATT-3′，NC siRNA序列為5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3′。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)

細(xì)胞總RNA提取按Trizol說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，TRIM28的RT-PCR檢測(cè)引物為5′-AAGGACCATACTGTGCGCTCTAC-3′(正向)與5′-ACGTTGCAATAGACAGTACGTTCAC-3′(反向)。GAPDH的qPCR檢測(cè)引物為5′-ATCAAGAAGGTGGTGAAGCA-3′(正向)與5′-AGACAACCTGGTCCTCAGTGT-3′(反向)。

1.5 Transwell試驗(yàn)

將不含血清的NC組和siTRIM28組的細(xì)胞懸液均勻接種在24孔板中，采用特制的Matrigel Invasion Chamber，在下室加入750 μL含10%(體積分?jǐn)?shù)) FBS的培養(yǎng)基，上室加入500 μL細(xì)胞懸液(無(wú)血清)，繼續(xù)在孵箱培養(yǎng)24 h，用鑷子小心取出Chamber，吸干上室液體，移到預(yù)先加入約800 μL甲醇的孔中，室溫固定30 min后DAPI 染色，觀察計(jì)數(shù)。

1.6 劃痕愈合試驗(yàn)

將NC組和siTRIM28組的細(xì)胞以5×105的細(xì)胞濃度均勻接種在6孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞匯合。使用無(wú)菌移液管尖端在每個(gè)孔中進(jìn)行劃痕處理。用無(wú)菌PBS進(jìn)行洗滌以清除細(xì)胞碎片，然后在不含F(xiàn)BS的純培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在6 h的時(shí)間點(diǎn)，在每孔的相同位置拍攝記錄遷移狀態(tài)。

1.7 Western blotting

取NC組和siTRIM28組的細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液(含蛋白酶抑制劑)提取總蛋白，采用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度后煮沸變性10 min。每孔加樣蛋白約30 μg 左右，按參考文獻(xiàn)[9]進(jìn)行操作，凝膠成像分析儀采集圖像并分析TRIM28、β-catenin和c-Myc蛋白。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

圖1 TRIM28在胃癌中的表達(dá)及與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系Fig.1 TRIM28 was highly expressed in gastric cancer and correlated with the outcome of patientsA: Analysis of TRIM28 in TCGA gastric RNA-seq data from 33 normal and 374 tumor samples (****P<0.000 1); B: Analysis of TRIM28 expression in GES-1 cell line and three gastric cancer cell lines (reference cell: GES-1, n=3); C-F: The relation of TRIM28 expression and overall survival of all (C), intestinal (D), diffuse (E), and mixed (F) gastric cancer; TRIM28: tripartite motif-containing protein 28.

2 結(jié)果

2.1 TRIM28在胃癌中的表達(dá)及與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系

2.1.1 TRIM28在胃癌組織中的表達(dá)

基于TCGA胃癌轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)，分析胃癌組織和正常胃組織中TRIM28的表達(dá)。結(jié)果(圖1A)顯示，胃癌組織中TRIM28 mRNA的相對(duì)表達(dá)量明顯高于正常胃組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1)。

2.1.2 qRT-PCR檢測(cè)TRIM28在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)

利用qRT-PCR檢測(cè)本科室自存的胃癌細(xì)胞系(AGS、HGC-27和BGC-823)和永生化胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1中TRIM28的表達(dá)情況。結(jié)果(圖1B)顯示，與永生化胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1相比，TRIM28在3株胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)上調(diào)。其中AGS細(xì)胞系中TRIM28表達(dá)水平最高。

圖2 敲低TRIM28對(duì)胃癌細(xì)胞的侵襲遷移能力的影響Fig.2 Silencing TRIM28 resulted in reduced invasion and migration properties of gastric cell line AGSA: The efficiency of TRIM28 knockdown in AGS cells (***P<0.001, n=3); B: Images of Transwell invasion test showed decreased invasion capability of AGS cells with knockdown of TRIM28; C: Quantification of the Transwell invasion assay results (**P<0.01, n=3); D: Images of wound healing migration test showed decreased migration capability of AGS cells with knockdown of TRIM28; E: Quantification of the wound healing migration assay results (*P<0.05, n=3); NC: normal control; TRIM28: tripartite motif-containing protein 28.

2.1.3 TRIM28與胃癌患者生存期的關(guān)系

為了進(jìn)一步明確TRIM28表達(dá)與胃癌預(yù)后之間的關(guān)系，筆者利用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)的胃癌數(shù)據(jù)集進(jìn)行在線生存分析。Meier Plotter數(shù)據(jù)結(jié)果顯示：TRIM28表達(dá)水平對(duì)患者的總生存時(shí)間有顯著影響。與低表達(dá)組相比，TRIM28高表達(dá)組胃癌患者的總存活時(shí)間縮短(P=4E-16)(圖1C)；同樣TRIM28的表達(dá)水平對(duì)腸型胃癌患者(P=1.7E-11)(圖1D)和彌漫型胃癌患者(P=0.004 8)(圖1E)具有相同的影響；但是對(duì)于混合型胃癌(圖1F)，TRIM28表達(dá)水平與胃癌患者的預(yù)后無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性(P=0.37)。

2.2 敲低TRIM28對(duì)胃癌細(xì)胞的侵襲遷移能力的影響

2.2.1 siRNA敲低TRIM28基因的效率

為驗(yàn)證si-TRIM28的基因敲低效率，以NC組及si-TRIM28-1 /si-TRIM28-2轉(zhuǎn)染48 h后的AGS細(xì)胞提取總mRNA進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。結(jié)果(圖2A)顯示，在轉(zhuǎn)染處理后，與對(duì)照組相比，si-TRIM28處理組TRIM28的mRNA水平顯著下降，證明si-TRIM28效果可靠，為后續(xù)功能學(xué)實(shí)驗(yàn)提供了保障。

2.2.2 TRIM28對(duì)胃癌細(xì)胞的侵襲能力的影響

利用Transwell試驗(yàn)檢測(cè)TRIM28對(duì)AGS胃癌細(xì)胞侵襲能力的影響。結(jié)果(圖2B、C)顯示，TRIM28基因敲低后，侵襲細(xì)胞的數(shù)量顯著減少，與NC組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01,n=3)。

2.2.3 TRIM28對(duì)胃癌細(xì)胞的遷移能力的影響

利用劃痕愈合試驗(yàn)檢測(cè)TRIM28對(duì)AGS胃癌細(xì)胞遷移能力的影響。結(jié)果(圖2D、E)顯示，TRIM28基因敲低后，AGS細(xì)胞的遷移能力明顯下降，與NC組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,n=3)。

2.3 TRIM28對(duì)Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

利用Western blotting試驗(yàn)檢測(cè)TRIM28對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響。結(jié)果如圖3所示，TRIM28基因敲低后，β-catenin以及下游靶基因c-Myc的蛋白表達(dá)水平明顯下降。這些結(jié)果表明，TRIM28能夠激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路。

圖3 干擾TRIM28后c-Myc和β-catenin的表達(dá)下調(diào)Fig.3 Western blotting showed downregulation of c-Myc and β-catenin in AGS cells with knockdown of TRIM28NC: normal control; TRIM28: tripartite motif-containing protein 28.

3 討論

TRIM家族在結(jié)構(gòu)上高度保守，從N端到C端的順序依次為鋅-指結(jié)構(gòu)(RING box)、1個(gè)或2個(gè)B-box結(jié)構(gòu)域和1個(gè)卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域。TRIM家族涉及多種生物學(xué)過(guò)程，如細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化、發(fā)育、腫瘤發(fā)生等[3]。近年來(lái)，TRIM家族與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系也逐漸受到關(guān)注[3]。研究[10-12]表明，多種TRIM家族成員在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要角色。作為T(mén)RIM家族中重要的一員，TRIM28在腫瘤中的作用日益受到重視[5-6, 13-15]。然而，TRIM28在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制目前尚未有報(bào)道。

在本研究中，筆者通過(guò)生物信息學(xué)分析和體外實(shí)驗(yàn)來(lái)研究TRIM28在胃癌中的表達(dá)和功能及其分子機(jī)制。結(jié)果顯示，胃癌組織和細(xì)胞株中TRIM28表達(dá)水平均明顯上調(diào)，而且TRIM28的異常高表達(dá)與胃癌患者預(yù)后差有關(guān)；這說(shuō)明TRIM28與胃癌緊密相關(guān)，并有作為診斷胃癌的生物標(biāo)志物的潛力。此外，本研究體外功能學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，干擾TRIM28可以抑制胃癌細(xì)胞侵襲和遷移?？傮w而言，本研究結(jié)果證明TRIM28可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞的侵襲和遷移。

TRIM家族蛋白作為致癌因子，可以通過(guò)Wnt信號(hào)通路在細(xì)胞增生、侵襲和遷移等惡性生物學(xué)行為過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，而且主要是通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路。TRIM59通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)母細(xì)胞瘤的增生[16]；甲狀腺癌中，干擾TRIM44可以下調(diào)β-catenin及其下游靶基因cyclin-D1和c-Myc的表達(dá)，進(jìn)而抑制甲狀腺癌細(xì)胞的增生、侵襲、遷移以及上皮間葉轉(zhuǎn)化[17]；在肝細(xì)胞癌中，TRIM66通過(guò)促進(jìn)β-catenin降解復(fù)合物中的GSK-3β磷酸化，激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，促進(jìn)肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展[18]；在卵巢癌中，干擾TRIM28可以下調(diào)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的β-catenin、支架蛋白(Axin)、T細(xì)胞因子1(T-cell factor 1, TCF1)和淋系增強(qiáng)子結(jié)合因子1(lymphoid enhancer binding factor 1, LEF1)，進(jìn)而抑制卵巢癌細(xì)胞侵襲、遷移和上皮間葉轉(zhuǎn)化等[13]。筆者猜測(cè)，在胃癌中TRIM28也可能參與對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的調(diào)控。本研究進(jìn)一步采用Western boltting法檢測(cè)β-catenin和下游靶基因c-myc的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，在胃癌中TRIM28能夠活化Wnt/β-catenin 信號(hào)通路。

綜上所述，本研究顯示，胃癌組織和細(xì)胞株中TRIM28高表達(dá)，而且TRIM28高表達(dá)的胃癌患者預(yù)后相對(duì)較差。TRIM28在胃癌進(jìn)展過(guò)程中作為癌基因發(fā)揮作用，并可能通過(guò)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路促進(jìn)胃癌細(xì)胞的侵襲和遷移。今后進(jìn)一步深入研究TRIM28將有望為治療胃癌提供新的有效的治療靶點(diǎn)。值得注意的是，異常表達(dá)的TRIM28能否成為診斷胃癌的生物標(biāo)志物，需要檢測(cè)更多樣本，同時(shí)還應(yīng)檢測(cè)患者和正常人群血液中TRIM28的表達(dá)情況。