柳 鑫 徐有青 崔純瑩 趙志剛*
(1. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院藥學(xué)部,北京 100070; 2. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院消化內(nèi)科,北京 100070; 3. 首都醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,北京 100069)
急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是發(fā)生在胰腺內(nèi)部和胰腺外周的一種急性炎性反應(yīng)。胰腺腺泡內(nèi)聚集的溶酶體酶與消化酶,催化胰蛋白酶原生成胰蛋白酶,導(dǎo)致腺泡細(xì)胞裂解[1]。急性胰腺炎會(huì)引起器官衰竭,在急性炎性反應(yīng)階段,胰腺內(nèi)小葉動(dòng)脈括約肌受損,發(fā)生局部性狹窄,血流量減少,胰腺組織發(fā)生壞死,胰腺外器官受損,引起肺、腎臟與肝臟等多器官功能紊亂,這是導(dǎo)致重癥急性胰腺炎發(fā)病與死亡的原因之一[2],在美國(guó),每年每10萬成年人中,約有40例急性胰腺炎患者死于器官功能障礙[3]。
嚴(yán)重高三酰甘油血癥導(dǎo)致急性胰腺炎易感性增加,在急性胰腺炎的誘發(fā)因素中占比達(dá)到近10%[4]。流行病學(xué)調(diào)查[5]顯示,當(dāng)患者的血漿三酰甘油濃度高于1 000 mg/dL與2 000 mg/dL時(shí),發(fā)生急性胰腺炎的比例分別為5%和10%~20%。在體內(nèi)脂質(zhì)代謝過程中,脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase,LPL)作為三酰甘油水解的限速酶[6],其發(fā)揮作用依賴于糖基化磷脂酰肌醇錨定高密度脂蛋白結(jié)合蛋白1(glycosylphosphatidylinositol-anchored high-density lipoprotein binding protein 1,GPIHBP1)[7]。GPIHBP1在血管內(nèi)皮下與LPL結(jié)合,作為其發(fā)揮脂解作用時(shí)的重要錨定結(jié)合蛋白,當(dāng)GPIHBP1基因發(fā)生功能缺失性突變,將導(dǎo)致LPL無法正常發(fā)揮脂質(zhì)分解作用,引起血漿三酰甘油濃度極度升高[8]。
目前,有關(guān)GPIHBP1基因敲除小鼠應(yīng)用于急性胰腺炎的研究尚未見報(bào)道,嚴(yán)重高三酰甘油血癥急性胰腺炎是否會(huì)引起急性肺損傷,也未明確。本研究擬采用GPIHBP1基因敲除小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn),建立急性胰腺炎動(dòng)物模型,探討嚴(yán)重高三酰甘油血癥時(shí)急性胰腺炎與肺損傷的關(guān)系。
GPIHBP1基因敲除小鼠,由美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室提供,為C57BL/6J背景,8周齡,雄性小鼠;對(duì)照為同窩野生型小鼠。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):LA2010-059,環(huán)境溫度為20~24 ℃,正常日光周期,自由進(jìn)食及飲水,保持墊料干燥。
雨蛙素購自美國(guó)Sigma公司,生化試劑盒(淀粉酶、三酰甘油、總膽固醇與血糖等試劑盒)購自中生北控生物科技公司。
實(shí)驗(yàn)分為2組:WT組(野生型)和GPIHBP1-/-組(GPIHBP1基因敲除),每組6只。采用PCR鑒定和血脂分析(血漿三酰甘油濃度測(cè)定),雙重篩選確認(rèn)基因型。所采用引物見表1。監(jiān)測(cè)體質(zhì)量,禁食12 h,內(nèi)眥取血,檢測(cè)血漿葡萄糖與脂質(zhì)含量。
表1 基因型鑒定的引物序列
兩組小鼠自由飲水狀態(tài)禁食12 h,腹腔注射雨蛙素(50 μg/kg),1次/h,連續(xù)注射7次,誘導(dǎo)胰腺炎,24 h 后處死小鼠,采用PBS灌流,取胰腺與肺組織,進(jìn)行形態(tài)分析。
禁食12 h后,在不同時(shí)間點(diǎn)(0、9、12及24 h),內(nèi)眥采血,肝素抗凝,高速離心(4 ℃,12 000 r/min,60 min),小心吸取下層澄清液3 μL入96孔板,加入淀粉酶工作液100 μL,37 ℃孵育3 min,入酶標(biāo)儀分別于605 nm波長(zhǎng)處讀取不同時(shí)間點(diǎn)(1 min末、2 min 末、3 min末)的A值,計(jì)算淀粉酶活性(U/L)= [A值(3 min)-A值(1 min)]/2×3 245×稀釋倍數(shù),當(dāng)[A值(3 min)-A值(1 min)]/2>0.3時(shí),用去離子水稀釋測(cè)定,每組樣品測(cè)定3次,取平均值。
取胰腺與肺組織,分別給予25%~100%(體積分?jǐn)?shù))乙醇浸泡10 min,脫水,二甲苯浸泡,至組織透明,加入液態(tài)石蠟,在60 ℃保溫30 min,采用石蠟切片,用二甲苯脫蠟,無水乙醇洗脫二甲苯,分別使用蘇木精-伊紅染色1 min,二甲苯洗脫處理后,中性樹膠封片,采集圖像,分別進(jìn)行胰腺與肺組織病理評(píng)分(表2,3)。
表2 胰腺組織病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)
表3 肺組織病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)
給予1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))異戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠,經(jīng)氣管插管,行肺泡灌洗,灌入0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液500 μL/次,共6次,抽吸計(jì)回收量。收集灌洗液于離心管中,回收率>80%為合格標(biāo)本。取10 μL用于細(xì)胞計(jì)總數(shù),細(xì)胞懸液滴于計(jì)數(shù)板上,使懸液自由充滿蓋片下方間隙,勿留氣泡,在光鏡下觀察并數(shù)出四角大格內(nèi)的細(xì)胞數(shù),壓線時(shí)只計(jì)上線和右線的細(xì)胞,然后按下式計(jì)算出細(xì)胞總數(shù):細(xì)胞數(shù)=(四大格中的細(xì)胞總數(shù)/4)×104/mL;回收液細(xì)胞總數(shù)=每毫升細(xì)胞數(shù)×回收肺泡灌洗液總量。
為了鑒定基因型,本研究設(shè)計(jì)兩對(duì)引物,其中一對(duì)引物設(shè)計(jì)在敲除片段上,野生型在517 bp處有一亮條帶顯示,而敲除小鼠無亮帶顯示,另一對(duì)引物設(shè)計(jì)在敲除片段的上游與下游,在野生小鼠中,由于PCR產(chǎn)物較長(zhǎng),無法有效獲得PCR產(chǎn)物,而在敲除小鼠中,由于刪除一段后在801 bp處可見一亮條帶(圖1)。GPIHBP1-/-小鼠體質(zhì)量及血糖值與WT小鼠比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,圖2A、B),GPIHBP1-/-小鼠血漿三酰甘油與總膽固醇濃度均明顯高于WT小鼠,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖2C、D)。
圖1 GPIHBP1-/-小鼠基因型鑒定Fig.1 Genotype identification of GPIHBP1-/- miceGPIHBP1: glycosylphosphatidylinositol-anchored high-density lipoprotein binding protein 1.
圖2 GPIHBP1-/-小鼠血漿脂質(zhì)升高Fig.2 GPIHBP1-/- mice showed higher plasma levels of lipidsA: body weight; B: glucose; C: triglyceride; D: total cholesterol;n=6,*P<0.05; WT: wild type; GPIHBP1:glycosylphosphatidylinositol-anchored high-density lipoprotein binding protein 1.
隨著時(shí)間變化,GPIHBP1-/-小鼠與WT小鼠血漿淀粉酶活性均發(fā)生明顯改變(F時(shí)間=21.359,P=0.004),但組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F組間=0.203,P=0.668)(圖3)。
圖3 GPIHBP1-/-小鼠血漿淀粉酶活性Fig.3 Amylase activity in GPIHBP1-/- mice WT: wild type; GPIHBP1: glycosylphosphatidylinositol-anchored high-density lipoprotein binding protein 1.
與WT小鼠相比,GPIHBP1-/-小鼠胰腺水腫病變顯著,小葉內(nèi)部有較寬間隙,炎性細(xì)胞于葉間積聚(圖4)。胰腺病理評(píng)分比較,GPIHBP1-/-小鼠明顯高于WT小鼠,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表3)。
肺組織病理切片HE染色結(jié)果顯示,GPIHBP1-/-小鼠較WT小鼠肺組織病理改變較顯著,光鏡下可見肺泡間隔內(nèi)毛細(xì)血管擴(kuò)張充盈,炎細(xì)胞浸潤(rùn)明顯,偶
見支氣管壁增厚、氣道上皮壞死、糜爛和氣道壁炎細(xì)胞浸潤(rùn)、杯狀上皮化生、平滑肌細(xì)胞增生肥大等表現(xiàn)(圖5)。對(duì)肺組織肺泡間隔內(nèi)炎細(xì)胞浸潤(rùn)指標(biāo)進(jìn)行病理評(píng)分,GPIHBP1-/-小鼠高于WT小鼠,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
表3 兩種小鼠胰腺組織和肺組織病理學(xué)評(píng)分
圖4 GPIHBP1-/-小鼠胰腺病理損傷明顯加重Fig.4 Pathological damage of pancreas in GPIHBP1-/- mice significantly aggravated(HE staining,Scale bar=200 μm)A: WT mice; B: GPIHBP1-/- mice; WT: wild type; GPIHBP1: glycosylphosphatidylinositol-anchored high-density lipoprotein binding protein 1.
圖5 GPIHBP1-/-小鼠肺病理損傷顯著加重Fig.5 Pathological damage of lungs in GPIHBP1-/- mice significantly aggravated(HE staining, Scale bar=200 μm)A: WT mice; B: GPIHBP1-/- mice; WT:wild type; GPIHBP1: glycosylphosphatidylinositol-anchored high-density lipoprotein binding protein 1.
對(duì)誘導(dǎo)急性胰腺炎后的GPIHBP1-/-小鼠與WT小鼠分別行支氣管插管和肺泡灌洗,對(duì)肺泡灌洗液細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)(圖6),GPIHBP1-/-小鼠支氣管肺泡灌洗液中細(xì)胞總數(shù)百分比較WT小鼠增加1.63倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
圖6 GPIHBP1-/-小鼠肺泡灌洗液細(xì)胞總數(shù)增加Fig.6 Total number of cells in alveolar lavage increased in GPIHBP1-/- mice*P<0.05; WT:wild type; GPIHBP1: glycosylphosphatidylinositol-anchored high-density lipoprotein binding protein 1.
本研究中GPIHBP1基因缺失導(dǎo)致的嚴(yán)重高三酰甘油血癥小鼠,急性胰腺炎易感性增高,肺組織病理明顯改變,急性肺泡炎性反應(yīng)加重,肺泡間隔內(nèi)中性粒細(xì)胞增多。
在探索嚴(yán)重高三酰甘油血癥急性胰腺炎與肺損傷病理改變時(shí),本研究采用了一種特殊的基因工程動(dòng)物模型:GPIHBP1基因敲除小鼠。GPIHBP1基因敲除后,可導(dǎo)致血漿三酰甘油升高10倍以上(超過1 000 mg/dL),且不影響動(dòng)物的全身狀態(tài),繁殖容易,存活率高,是一種較為理想的嚴(yán)重高三酰甘油血癥小動(dòng)物模型。給予雨蛙素誘導(dǎo)急性胰腺炎后,GPIHBP1基因敲除小鼠的血漿淀粉酶活性隨時(shí)間發(fā)生明顯變化,盡管組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但在臨床中也確有相關(guān)報(bào)道[9-10]。高三酰甘油血癥胰腺炎患者的血漿淀粉酶活性在正常范圍內(nèi)波動(dòng),血漿淀粉酶活性可能并不是一個(gè)較靈敏的生物標(biāo)志物,對(duì)于臨床診療意義不大。
在急性胰腺炎進(jìn)展過程中產(chǎn)生的大量炎性細(xì)胞因子,是引起胰腺外組織產(chǎn)生炎性反應(yīng)的重要原因之一[11]。其病理進(jìn)程可分為三個(gè)階段,局部刺激引起鈣離子釋放,酶原激活,胰腺細(xì)胞受損,出現(xiàn)早期癥狀如上腹部疼痛;進(jìn)而在損傷的腺泡細(xì)胞內(nèi)部,出現(xiàn)酶原活化的正反饋調(diào)節(jié),胰腺自身逐漸被消化,炎性反應(yīng)向胰腺外組織擴(kuò)散;在炎性反應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)散中,血管通透性升高,胰腺內(nèi)外募集的多種炎性反應(yīng)因子進(jìn)一步侵襲胰腺外組織。其中,肺組織最早出現(xiàn)病理改變[12]。肺損傷在急性胰腺炎患者中發(fā)生率較高,這也是導(dǎo)致急性胰腺炎并發(fā)多器官功能障礙的重要原因。當(dāng)患者出現(xiàn)急性胰腺炎合并急性肺損傷或急性呼吸窘迫綜合征時(shí),病死率達(dá)到30%~40%[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,GPIHBP1基因缺失引起的嚴(yán)重高三酰甘油血癥,在誘發(fā)急性胰腺炎后伴有肺損傷病理改變,肺泡灌洗液中細(xì)胞數(shù)目增多。
磷脂酶A2含量增加與肺損傷具有一定的相關(guān)性[14]。在生理狀態(tài)下,II型肺細(xì)胞產(chǎn)生的表面活性物質(zhì)能夠維持肺泡穩(wěn)定性,如果肺表面活性物質(zhì)的數(shù)量與功能發(fā)生改變,肺組織的結(jié)構(gòu)與功能會(huì)隨之發(fā)生病變[15]。急性胰腺炎時(shí)釋放大量炎性反應(yīng)因子及多種生物活性物質(zhì),包括磷脂酶A2,后者能水解肺泡表面活性物質(zhì)。嚴(yán)重高三酰甘油血癥時(shí)急性胰腺炎易感性增加,可能與游離脂肪酸增多及炎性反應(yīng)密切相關(guān)[5]。另一方面,嚴(yán)重高三酰甘油血癥時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞功能發(fā)生紊亂,多種炎性反應(yīng)因子如磷脂酶A2募集于血液中及內(nèi)皮細(xì)胞下[16],這可能也是嚴(yán)重高三酰甘油血癥時(shí)急性胰腺炎并發(fā)肺損傷的重要機(jī)制之一。
通過建立急性胰腺炎肺損傷模型,對(duì)進(jìn)一步探討急性胰腺炎時(shí)的肺損傷病理機(jī)制,以及改善臨床癥狀與降低病死率尤為重要[17-18]。目前,臨床對(duì)癥治療主要集中于兩方面:抑制炎性反應(yīng)與改善肺功能。臨床前研究及臨床試驗(yàn)[19-20]嘗試通過藥物調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)降低肺損傷,但均未獲得實(shí)質(zhì)性進(jìn)展。近些年,重癥急性胰腺炎合并肺損傷的病死率有所下降,主要緣于重癥監(jiān)護(hù)病房(intensive care unit,ICU)護(hù)理對(duì)肺通氣功能的改善。但是,在急性胰腺炎的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中,尚缺乏能夠有效改善肺損傷的治療手段,而在臨床實(shí)踐中,也缺乏有效措施來抑制急性胰腺炎引起的全身性炎性反應(yīng)。
本研究應(yīng)用GPIHBP1基因缺失的嚴(yán)重高三酰甘油血癥小鼠模型,誘導(dǎo)急性胰腺炎,胰腺與肺組織病理損傷均明顯加重,初步證實(shí)GPIHBP1基因敲除小鼠可作為理想的嚴(yán)重高三酰甘油血癥動(dòng)物模型,用于進(jìn)一步的肺損傷發(fā)病機(jī)制研究,對(duì)進(jìn)一步調(diào)節(jié)急性胰腺炎引起的遠(yuǎn)端組織器官功能紊亂,以及促進(jìn)臨床轉(zhuǎn)化,具有一定的臨床理論與實(shí)用價(jià)值。