葉立紅，鄭歡偉，黃肖雨，郭立杰，張海叢，劉志權，王翀奎

1 石家莊市第五醫(yī)院 a.病理科; b.肝病中心; c.藥劑科，石家莊 050021；2 河北中醫(yī)學院 實驗中心，石家莊 050200

藥物性肝損傷(drug-induced liver injury, DILI)的發(fā)病率逐年增加，并且是引起淤膽性肝炎最常見病因。證據表明，膽汁形成、分泌和排流障礙是導致膽汁淤積的主要機制，其中肝細胞膽汁分泌異常是其重要發(fā)生機制之一。位于肝細胞毛細膽管膜側上的3種主要跨膜轉運蛋白-ABCB11(膽汁酸鹽輸出泵，bile salt export pump，BSEP)、ABCC2(多藥耐藥相關蛋白2，multidrug resistance protein 2，MRP2)和ABCB4(多藥耐藥糖蛋白3，multidrug resistance associated protein 3，MDR3)對膽汁經肝細胞分泌入毛細膽管發(fā)揮了關鍵作用[1-2]。2015年中華醫(yī)學會發(fā)布的《藥物性肝損傷診治指南》[3]中，王泰齡教授根據藥物損傷靶點不同對DILI進行了病理學分類，分為肝細胞損傷型、膽管細胞損傷型、血管內皮細胞損傷型三大類。其中膽管細胞損傷型在病理形態(tài)上均表現(xiàn)為毛細膽管膽汁淤積伴/不伴肝細胞膽汁淤積，根據伴有肝細胞壞死程度的不同從病理上又分為3個亞型：混合性肝炎(肝細胞損傷嚴重)、膽汁淤積性肝炎(肝細胞損傷輕)和單純性膽汁淤積(無肝細胞損傷)。BSEP、MRP2和MDR3表達異常與多種膽汁淤積性疾病相關，其在上述3種亞型中表達特點如何？是否也存在表達異常？三者表達特點與不同病理形態(tài)的膽汁淤積有何關系？以及與血清TBil、DBil、ALP、GGT、TBA水平是否存在相關性？因此，本研究通過對膽管細胞損傷型DILI不同病理亞型的肝組織進行BSEP、MRP2、MDR3免疫組化及病理形態(tài)觀察，并對比與肝生化指標的相關性，從而探討轉運蛋白在膽管細胞損傷DILI各亞型中的表達特點及在膽汁淤積發(fā)生機制中的作用。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2010年1月-2017年6月石家莊市第五醫(yī)院有明確用藥史、經肝穿組織病理診斷為膽管細胞損傷型DILI的112例患者的臨床資料。根據2015年《藥物性肝損傷診治指南》[3]中的病理分類標準，對入選病例進行明確病理分型，分為混合性肝炎組(混合組，n=40)、膽汁淤積性肝炎(膽汁淤積組,n=40)、單純性膽汁淤積組(單純組,n=32)，同時選取20例無膽汁淤積的HBV攜帶者作為對照組。所有患者均有明確用藥史，并排除原發(fā)性膽汁性膽管炎、原發(fā)性硬化性膽管炎、膽道不全梗阻、酒精性肝病、脂肪性肝炎、嗜肝及非嗜肝病毒感染浩和遺傳代謝性疾病等。

1.2 主要試劑與儀器 BSEP(ABCB11)鼠單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，MRP2(ABCC2)兔單克隆抗體、MDR3(ABCB4)兔多克隆抗體購自美國Abcam公司，免疫組化試劑盒(PV-6000)、DAB顯色液、抗體稀釋液購自北京中杉金橋試劑公司，主要儀器為美智Powerlmager Version5.3圖像采集系統(tǒng)、OLYMPUS BX53顯微鏡及Image-Pro Plus 6.0(IPP)圖像分析軟件。

1.3 研究方法

1.3.1 肝組織常規(guī)病理檢測 所有入選病例肝穿標本均常規(guī)進行HE染色、網狀纖維+Masson染色、淀粉酶消化過碘酸希夫法染色(D-PAS)、CK7/CK19免疫組化染色，病理形態(tài)觀察由2名經驗豐富的病理醫(yī)師共同閱片并進行各病理亞型分組。

1.3.2 肝組織免疫組化檢測及結果判定 所有入選病例均切取3張石蠟切片，分別用于3種抗體的免疫組化標記。免疫組化采用SP法進行嚴格操作。PBS 代替第一抗體作為陰性對照。由于BSEP、MDR3、MRP2均表達于肝細胞毛細膽管膜側，因此免疫組化染色以在肝細胞膽管膜上出現(xiàn)棕黃色為陽性表達，無著色為陰性表達。

1.3.3 圖像分析軟件進行半定量評分 所有切片通過Image-Pro Plus 6.0(IPP)圖像分析軟件進行半定量分析，圖像采集均在完全相同的顯微鏡條件下拍攝，并對圖像分析軟件設定統(tǒng)一選色參數(shù)。除由于肝細胞壞死消失而造成3種轉運蛋白的表達缺失不作為觀察區(qū)域外，選取組織切片內除壞死區(qū)外全部區(qū)域進行顯微鏡下拍照分析。應用圖像分析軟件分別測量BSEP、MRP2、MDR3在每張切片的陽性區(qū)域面積、平均光密度值、積分光密度值(integrated optical density，IOD)，IOD=陽性區(qū)域面積×平均光密度值。測量得到IOD數(shù)據作為半定量分析的有效指標，并對不同組別間IOD值進行相互比較。

1.3.4 觀察指標 所有肝穿標本均進行連續(xù)切片，對比觀察每例病例組織切片內的病變形態(tài)特點(包括肝細胞淤膽、羽毛樣變性、毛細膽管淤膽)及BSEP、MRP2、MDR3免疫組化陽性表達變化，并與對照組進行對比分析；收集所有入選病例距肝穿時間最近一次肝生化指標中TBil、DBil、ALP、GGT、TBA值，與BSEP、MRP2、MDR3半定量評分進行相關性分析。

1.4 倫理學審查 本研究方案經石家莊市第五醫(yī)院倫理委員會審批(批號：SJZWY090112)，所納入患者均簽署知情同意書。

2 結果

2.1 一般資料 混合組40例患者中男18例(45%)，女22例(55%)，平均(45.6±15.4)歲；膽汁淤積組40例患者中男12例(30%)，女28例(70 %)，平均(43.2±15.1)歲；單純組32例患者中男14例(43.75%)，女18例(56.25%)，平均(47.4±19.0)歲。

2.2 病理形態(tài)學特點 混合組：病理形態(tài)以中或重度的肝細胞壞死為主，壞死區(qū)周圍有肝細胞及毛細膽管淤膽、膽栓形成(圖1a)。膽汁淤積組：病理形態(tài)以膽汁淤積為主，表現(xiàn)為肝細胞明顯腫脹、羽毛樣變性(膽鹽的毒性作用使受損肝細胞明顯腫脹、胞漿稀疏呈細網狀)，毛細膽管膽栓形成(圖1b)。膽汁淤積程度重于混合組，同時伴有輕度肝細胞壞死。單純組僅表現(xiàn)為中央靜脈周圍的毛細膽管淤膽、膽栓形成，肝細胞壞死輕微或無(圖1c)。

2.3 BSEP、MRP2、MDR3免疫組化表達特點及與病理形態(tài)的關系 膽汁淤積組、混合組、單純組分別與對照組比較，3種轉運蛋白在肝細胞膜上表達變化趨勢較一致，均表現(xiàn)為陽性表達減少(P值均<0.05)；BSEP、MRP2、MDR3在膽汁淤積組表達減弱較混合組及單純組更明顯，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)(表1)。BSEP、MRP2、MDR3特異性定位于肝細胞膜，在正常對照組沿肝細胞毛細膽管膜側呈微管狀陽性表達(圖2a)。各亞型組BSEP、MRP2、MDR3免疫組化表達特點及與病理形態(tài)的關系顯示：3種轉運蛋白在膽汁淤積腫脹變性及羽毛樣變性的肝細胞呈陰性表達(圖2b)，在毛細膽管膽汁淤積區(qū)沿擴張的毛細膽管壁呈陰性或弱陽性表達(圖2c)，其余非膽汁淤積區(qū)三者呈現(xiàn)稀疏陽性表達，其中肝細胞膽汁淤積腫脹及羽毛樣變性越明顯，陽性表達減少越顯著。

表1 4組間BSEP、MRP2、MDR3免疫組化IOD均值(取自然對數(shù))的比較

2.4 各組肝生化指標與3種轉運蛋白半定量評分的相關性 膽汁淤積組BSEP與TBA值呈中等強度負相關性(r=-0.640，P=0.008)，單純組MRP2與TBil、DBil值呈中等強度負相關性(r值分別為0.597、-0.643、P值分別為0.019、0.011)(表2)。

3 討論

肝臟是藥物代謝的重要器官，藥物誘導的肝內膽汁淤積在臨床上較為常見，已知有數(shù)百種藥物能導致膽汁淤積型DILI的發(fā)生[4]。膽汁淤積的發(fā)生機制非常復雜，當各種原因引起的膽汁形成、分泌、排泄障礙時均可導致膽汁淤積，其中肝細胞毛細膽管膜上的跨膜轉運蛋白功能障礙是造成膽汁分泌異常的重要原因之一。膽汁由肝細胞分泌是一個需要主動耗能的排泌過程, 其分泌的膽汁酸鹽及一些非膽汁酸鹽的有機陰離子(例如膽紅素、磷脂)主要依靠肝細胞毛細膽管膜側上的3種跨膜轉運蛋白BSEP、MRP2和MDR3來共同介導完成[5-6]。這3種轉運蛋白為ATP結合盒超家族成員，其表達異常是多種疾病中膽汁淤積的“原發(fā)事件”[7]。多數(shù)引起膽汁淤積的藥物都是ATP結合盒超家族成員反應底物[8]，超家族成員與這類藥物反應后會損傷毛細膽管細胞膜上的轉運蛋白，從而使膽汁排流障礙導致肝內淤積。BSEP在正常肝細胞中調節(jié)膽鹽平衡，通過ATP水解將膽汁酸鹽逆濃度梯度泵入毛細膽管，是形成毛細膽管內膽汁酸鹽依賴性膽汁流的主要驅動力[9]。BSEP表達降低，引起膽汁酸轉運及分泌減少，導致肝細胞膽汁酸蓄積，進而對肝細胞造成毒性損害，血清中膽汁酸水平升高。MRP2為有機陰離子的重要轉運體，是非膽汁酸鹽依賴性膽汁流形成的重要因素，也是唯一將結合膽紅素從肝細胞內轉運至毛細膽管內的轉運蛋白[10-11]。MRP2的表達減少會導致膽紅素分泌障礙及膽汁淤積、膽栓形成。MDR3為卵磷脂轉運蛋白，負責磷脂的轉運。膽汁中的膽汁酸鹽、磷脂和膽固醇等主要有機溶質常形成混合微粒，MDR3能有效的將磷脂從雙分子層膜內側移至外側膜，使膽汁中的膽鹽和膽固醇易于形成混合微粒。MDR3表達水平降低會減少卵磷脂的轉運，使膽汁中卵磷脂含量下降，膽鹽不形成微膠粒，膽鹽游離引起膽管細胞損傷，導致膽汁淤積[12]。

既往研究[13-14]顯示，某些經膽汁清除的藥物或其代謝產物可以通過抑制轉運蛋白功能和(或)下調其表達，從而抑制膽汁分泌、膽汁酸運輸導致膽汁淤積、高膽紅素血癥發(fā)生，是引起藥物性膽汁淤積的發(fā)生機制之一。本研究通過觀察BSEP、MRP2和MDR3在急性膽管細胞損傷型DILI各亞型肝組織中的表達變化以及與不同膽汁淤積形態(tài)改變的關系，結果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，3種轉運蛋白在膽管細胞損傷型DILI各亞型組肝組織陽性表達減少甚至不表達，尤其以膽汁淤積腫脹及羽毛樣變肝細胞明顯區(qū)陽性表達減少更顯著，在毛細膽管膽栓形成的肝細胞膽管膜側三者表達呈弱表達或缺失，表明3種轉運蛋白的表達均受到抑制，從而推測膽汁淤積性DILI發(fā)生發(fā)展與3種轉運蛋白功能或結構受損密切相關；3種跨膜轉運蛋白在各亞型組相同肝組織中的表達強弱較一致，表明藥物引起的肝細胞或毛細膽管淤膽，不像遺傳性膽汁淤積性肝病為單一轉運蛋白表達異常，而是會同時影響到3種跨膜轉運蛋白表達。各亞型組之間相互比較，膽汁淤積組3種轉運蛋白減少程度較混合組及單純組更明顯，尤其以羽毛樣變性及肝細胞淤膽腫脹的肝細胞減少為顯著，提示膽汁淤積組3種轉運蛋白損傷更嚴重，與膽汁淤積組的肝細胞及毛細膽管淤膽重于其他兩組相一致。

TBil、DBil、ALP、GGT、TBA為反映肝臟膽管損傷及膽汁淤積的肝生化指標，通過對各亞型組內3種轉運蛋白評分與上述肝生化指標的相關性分析顯示，膽汁淤積組BSEP表達評分與TBA峰值呈中等強度負相關性，考慮是與膽汁淤積組肝細胞羽毛樣變性較其他兩組為多見有關。羽毛樣變性是由于膽汁酸鹽的毒性作用引起得的受損肝細胞明顯腫脹的病理形態(tài)改變，負責膽汁酸鹽轉運的BSEP表達降低后造成肝細胞膽汁酸鹽分泌障礙，進而引起血漿中膽汁酸水平升高，因此使得膽汁淤積組BSEP與TBA水平呈負相關性。而混合組和單純組羽毛樣變性相對少見或無，多以毛細膽管淤膽為主要淤膽形態(tài)改變，因此兩組BSEP與TBA水平無明顯相關性。此外，單純組MRP2評分與TBil、DBil峰值呈中等強度負相關性，MRP2是唯一將膽紅素從肝細胞轉運至毛細膽管的轉運蛋白，其表達減少使得膽紅素轉運至毛細膽管障礙。單純組僅有毛細膽管淤膽而無肝細胞壞死，使得影響TBil、DBil升高的因素主要為毛細膽管淤膽，因此MRP2與TBil、DBil呈中等強度負相關性。而膽汁淤積組及混合組除了毛細膽管淤膽引起TBil、DBil升高外，還伴有不同程度的肝細胞壞死，肝細胞壞死亦可引起TBil、DBil升高，使得這兩組的TBil、DBil與MRP2無明顯相關性。其他肝生化指標與3種轉運蛋白免疫組化評分均無明顯相關性(P值均>0.05)，這是由于藥物引起膽汁淤積的除了藥物或其代謝產物抑制3種轉運蛋白在肝細胞膽管膜上的表達外，還包括肝細胞和毛細膽管側微絲微管功能障礙, 細胞膜的流動性、Na+-K+-ATP酶活性等因素[15]，轉運蛋白的表達異常并非引起藥物性膽汁淤積發(fā)生的唯一因素。并且，影響上述肝生化指標升高的因素也不僅包括肝細胞及毛細膽管淤膽，肝細胞炎癥壞死、其他各級膽管上皮細胞的損傷亦均可引起上述各指標的升高。

綜上所述，3種跨膜轉運蛋白BSEP、MDR3、MRP2在膽管細胞損傷型DILI各病理亞型均呈現(xiàn)表達水平降低，提示藥物或其代謝產物可損傷毛細膽管膜側3種跨膜轉運蛋白，是膽管細胞損傷型DILI膽汁淤積發(fā)生的重要機制之一。