鄭 洋，王嘉孺，劉露露，王佳慧，趙鐵建

1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)賽恩斯新醫(yī)藥學(xué)院醫(yī)學(xué)系，南寧 530021；2 廣東醫(yī)科大學(xué)護(hù)理學(xué)院，廣東 東莞 523000；3 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院教學(xué)部，南寧 530022；4 廣西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生理教研室，南寧 530021

肝纖維化是慢性或反復(fù)性肝損傷的最終共同途徑，以細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白主要是膠原蛋白的過(guò)度積累為特征。晚期慢性纖維化常發(fā)展成為肝硬化，且伴有結(jié)構(gòu)喪失和功能衰竭的并發(fā)癥發(fā)生[1-3]。肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(liver sinusoidal endothelial cells, LSEC)構(gòu)成了肝血竇的血管壁, 是肝內(nèi)非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的主要類(lèi)型。已分化的LSEC電鏡下有其特征性的窗孔結(jié)構(gòu), 且窗孔內(nèi)皮下缺乏完整的基膜，這種特征性結(jié)構(gòu)在肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞與血液物質(zhì)交換中起著關(guān)鍵作用[4]。在肝纖維化發(fā)生早期，LSEC就會(huì)出現(xiàn)去窗孔化，內(nèi)皮下基底膜形成，這種現(xiàn)象被稱(chēng)為肝竇毛細(xì)血管化，是肝纖維化形成的一個(gè)重要病理學(xué)改變[5-7]。

豬通常被稱(chēng)作“六畜之首”?？脊艑W(xué)家發(fā)現(xiàn)，早在近萬(wàn)年前，人類(lèi)就開(kāi)始馴化并飼養(yǎng)野豬了。野豬性格兇猛，發(fā)起怒來(lái)連“獸中之王”老虎也要怕它三分。而被馴化的家豬，不但一改野豬的習(xí)性，而且在外貌上也發(fā)生了很大的變化。豬渾身都是寶，不僅是重要的肉食來(lái)源，還是制作皮革的原料，就連糞便也是上等的農(nóng)肥呢。

莪木醇為廣西道地藥材莪術(shù)的主要活性成分，具有抗纖維化作用，但具體作用機(jī)制仍不清楚。

Toll樣受體(TLR)是一類(lèi)天然免疫受體，能引發(fā)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致炎性介質(zhì)的釋放，在天然免疫防御中起重要作用。其中TLR4是人類(lèi)發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)TLR相關(guān)蛋白，革蘭陰性菌細(xì)胞壁的主要成分脂多糖(LPS)是其主要配體[8]。近年研究[9]發(fā)現(xiàn)，TLR4表達(dá)于各類(lèi)肝臟細(xì)胞中，可以調(diào)節(jié)肝臟細(xì)胞的天然免疫反應(yīng)，在肝臟疾病的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。LPS/TLR4信號(hào)通路在肝星狀細(xì)胞(HSC)和LSEC活化可以促進(jìn)肝纖維化的形成[10]，通過(guò)TLR4/MyD88/NF-κB、MARK兩條重要的信號(hào)通路直接增強(qiáng)肝臟的炎癥反應(yīng)，影響HSC和LSEC等自身細(xì)胞活化、增殖、凋亡、膠原的分泌合成及促纖維化細(xì)胞因子分泌，促進(jìn)肝纖維化形成。TLR4信號(hào)通路上的NF-κB是增強(qiáng)肝臟炎癥反應(yīng)、參與調(diào)控LSEC增殖和凋亡、促進(jìn)膠原合成及分泌的一個(gè)重要炎癥轉(zhuǎn)錄因子，可觸發(fā)炎性細(xì)胞因子大量釋放，如IL-6、TNFα、IL-8等[11]，增強(qiáng)肝臟的炎癥反應(yīng)形成“炎性瀑布”，最終導(dǎo)致肝纖維化形成。本研究以L(fǎng)SEC的TLR4/NF-κB信號(hào)通路為研究對(duì)象，通過(guò)免疫印跡和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)檢測(cè)該信號(hào)通路上關(guān)鍵分子TLR4和NF-κB的表達(dá)水平，利用免疫熒光檢測(cè)NF-κB的表達(dá)及入核情況。

1 材料與方法

1.1 材料

治療后，平衡針灸治療組患者的生活質(zhì)量評(píng)分為（78.12±8.12）分，常規(guī)針灸治療組患者的生活質(zhì)量評(píng)分為（65.12±7.56）分，組間數(shù)據(jù)比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見(jiàn)表2。

1.1.2 藥物與試劑 莪術(shù)醇(阿拉丁C114054-20 mg)、HE試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，G1120)、Msson試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，G1340)、LPS(Sigma L2880)、小鼠抗大鼠TLR4一抗(Santa Cruz，J1016)、兔多抗P65(65 kD)(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，10745-1-AP)、兔單抗P-P65(65 kD)(CST，3033)、DAPI(碧云天，C1002)。

植物基質(zhì)沙墊是江蘇綠東坡環(huán)境工程有限公司生產(chǎn)的一種采用高密度、耐用、防腐蝕特殊性聚酯纖維和特殊工藝編織成的雙層或多層編織物，現(xiàn)場(chǎng)鋪設(shè)在受保護(hù)的坡面上，按順序注入各種混合基質(zhì)，使坡面受到保護(hù)，并可迅速恢復(fù)原有植被，達(dá)到自然狀態(tài)。植物基質(zhì)沙墊無(wú)骨料，無(wú)鋼筋，水上水下整體施工，無(wú)需圍堰和船舶拖排，施工簡(jiǎn)易，安全可靠，整體性強(qiáng)，防護(hù)性好，抗沖刷（5～6m/s），抗水壓（30t/m2）、防淘蝕，適用性強(qiáng)，生態(tài)美觀(guān)。植物基質(zhì)沙墊根據(jù)各種工況要求，可設(shè)計(jì)成反濾型、無(wú)濾型、植草型、抗浪型等多種類(lèi)型，可廣泛應(yīng)用于堤岸防護(hù)、水資源保護(hù)和水土保持工程中。

1.1.3 主要儀器 低速離心機(jī)(Eppendorf，5702R)、水平搖床(江蘇海門(mén)其林貝爾儀器制造有限公司，TS-1)、組織切片機(jī)(美國(guó)WPI公司，NVSLM1)、RT-PCR儀(ABI QuantStudio 6)、PCR儀(東勝創(chuàng)新生物科技有限公司，EDC-810)。

據(jù)表1所示，從調(diào)查覆蓋的地理區(qū)域來(lái)說(shuō)，本調(diào)查所收集到的招聘信息涵蓋了全國(guó)大部分省（直轄市、自治區(qū)），獲得的招聘信息是比較充分的。

2.2 TLR4和NF-κB mRNA表達(dá)水平 各組間TLR4 mRNA和NF-κB mRNA比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.001)。與陽(yáng)性對(duì)照組比較，莪術(shù)醇干預(yù)組和PDTC組TLR4 mRNA、NF-κB mRNA的表達(dá)水平均明顯降低(P值均<0.05)。莪術(shù)醇干預(yù)組和PDTC組TLR4 mRNA、NF-κB mRNA的表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)(表3)。

1.2.3 RT-PCR法檢測(cè)TLR4和NF-κB mRNA 在細(xì)胞中加入1 ml Trizol試劑，用槍吹打混勻，移至無(wú)RNase的1.5 ml EP管中，裂解10 min，加入200 μl氯仿，劇烈顛倒混勻數(shù)次，室溫放置5 min，4 ℃以14 256×g離心15 min。轉(zhuǎn)移上層水相(約400 μl)于另一新1.5 ml EP管中，加入400 μl異丙醇，混勻后室溫靜置10 min。4 ℃以14 256×g離心10 min可見(jiàn)RNA沉淀。棄上清，加入無(wú)RNase的75%乙醇1 ml，渦旋混勻后，4 ℃以9900×g離心5 min。棄上清，干燥RNA沉淀5～10 min，將沉淀溶于20 μl DEPC水中。在cDNA反應(yīng)體系中將RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)條件為25 ℃ 5 min，50 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min，4 ℃ 10 min，將得到的cDNA放入RT-PCR反應(yīng)體系中，反應(yīng)條件為50 ℃ 2 min，95℃ 10 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。取PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像分析系統(tǒng)上成相，利用分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度掃描，得到光密度值(IOD)，以GAPDH為內(nèi)對(duì)照，TLR4和P65NF-κB上下游引物及長(zhǎng)度見(jiàn)表1。

1.2.4 免疫印跡檢測(cè)TLR4和NF-κB 提取細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離、轉(zhuǎn)膜。用含5% 脫脂奶粉的TBST(封閉液)浸泡PVDF膜，室溫?fù)u床封閉2 h。用封閉液稀釋相應(yīng)的一抗，用封閉液稀釋相應(yīng)的HRP標(biāo)記二抗，使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，37℃搖床孵育2 h。洗去多余的二抗，通過(guò)ECL顯色系統(tǒng)顯色，用BandScan分析膠片灰度值。

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)KM小鼠50只，周齡2周，體質(zhì)量12～16 g，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)[SCXK(湘)2016-0002]，使用許可證號(hào)[SYXK(桂)2015-0001]。所有小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

表1 引物序列表

2.3 TLR4和NF-κB蛋白的表達(dá)水平 各組間TLR4和NF-κB比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.001)。莪術(shù)醇干預(yù)組TLR4表達(dá)水平明顯低于陽(yáng)性對(duì)照組和PDTC組(P值均<0.05)；莪術(shù)醇干預(yù)組和PDTC組磷酸化NF-κB表達(dá)水平明顯低于陽(yáng)性對(duì)照組(P值均<0.05)(圖2，表4)。

1.3 動(dòng)物倫理學(xué)審查 本研究方案經(jīng)由廣西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批，符合實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理與使用準(zhǔn)則。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組 50只小鼠按隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為3組：模型組(n=19)、莪術(shù)醇組(n=21)和空白組(n=10)，除去建模過(guò)程中死亡的小鼠，最后每組各10只。模型組和莪術(shù)醇組給予40%CCl4花生油混合液(劑量2 μl/g)，腹腔注射，每周2次，連續(xù)8周，空白組給予等量的花生油。在造模結(jié)束后，莪術(shù)醇組給予30 mg/kg莪術(shù)醇灌胃處理，給藥容積為1 ml/100 g，其余2組給予等量的生理鹽水。細(xì)胞共分為4組，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，生長(zhǎng)狀態(tài)良好的原代大鼠LSEC，用內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度到5×104個(gè)/ml，接種96孔板，每孔100 μl細(xì)胞懸液，同時(shí)設(shè)空白孔，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜(在細(xì)胞孔周?chē)變?nèi)加入100 μl無(wú)菌PBS)。2%DMEM培養(yǎng)基處理空白對(duì)照組；LPS陽(yáng)性對(duì)照組用5 μg/ml LPS處理3 h；莪術(shù)醇干預(yù)組用45 μg/ml莪術(shù)醇預(yù)處理30 min后再用5 μg/ml LPS處理3 h；PDTC(NF-κB特異性抑制劑)組用25 μg/ml PDTC預(yù)處理30 min后再用5 μg/ml LPS處理3 h，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

2 結(jié)果

2.1 肝組織病理檢查結(jié)果 各組小鼠肝組織HE染色結(jié)果(圖1)顯示，空白組：肝細(xì)胞以匯管區(qū)為中心呈現(xiàn)放射狀排列，未見(jiàn)明顯異常病理學(xué)改變，肝竇清晰；模型組：肝小葉之間分界不清，存在假小葉，肝細(xì)胞排列不規(guī)則，有空泡樣的改變，大量膠原組織產(chǎn)生；莪術(shù)醇組：病變情況較模型組有所改善。Masson染色結(jié)果(圖1)顯示，空白組：肝組織內(nèi)有少量膠原沉積；模型組：有大量膠原纖維沉積在肝小葉和肝竇內(nèi)；莪術(shù)醇組：肝組織內(nèi)膠原沉積較模型組改善。

依據(jù)肝纖維化病理Ishak評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[13]對(duì)HE圖片進(jìn)行分析，正常為0分；匯管區(qū)有纖維化為1分；匯管區(qū)有纖維間隔形成為2分；匯管區(qū)大面積纖維化為3分；匯管區(qū)有纖維化伴明顯的匯管-中央橋接纖維化為4分；明顯的匯管-中央橋接纖維化伴有結(jié)節(jié)為5分；有肝硬化形成為6分。模型組Ishak評(píng)分顯著高于空白組(P<0.05)，莪術(shù)醇組Ishak評(píng)分顯著低于模型組(P<0.05)；模型組膠原表達(dá)水平顯著高于空白組(P<0.05)，莪術(shù)醇組膠原表達(dá)顯著低于模型組(P<0.05)(表2)。

1.2.2 LSEC分離培養(yǎng) LSEC的分離參照文獻(xiàn)[12]，采用肝臟膠原酶灌注結(jié)合Percoll密度梯度沉降法及細(xì)胞選擇性貼壁法。將Percoll密度梯度離心分離所得的LSEC，放到適宜的培養(yǎng)基(10%胎牛血清)，飽和濕度，5%CO2中培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)成鋪路石樣形態(tài)，待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)約80%融合度時(shí)，用0.25%的胰蛋白酶和0.02%的乙二胺四乙酸(EDTA)消化收集細(xì)胞。

表2 各組Ishak評(píng)分以及膠原表達(dá)情況

表3 TLR4和NF-κB基因mRNA表達(dá)情況

1.2.5 免疫熒光檢測(cè)NF-κB表達(dá)及入核情況 每組細(xì)胞用PBS洗3次，每次3 min，然后用4%多聚甲醛溶液固定15 min，PBS洗滌細(xì)胞3次。用含山羊血清的0.5%Triton X-100孵育細(xì)胞，與熒光標(biāo)記羊抗兔IgG抗體共同孵育。使用熒光倒置顯微鏡進(jìn)行可視化。

2.4 莪術(shù)醇可以減少NF-κB入核及表達(dá) 陽(yáng)性對(duì)照組較空白對(duì)照組NF-κB表達(dá)水平增加，莪術(shù)醇干預(yù)組較陽(yáng)性對(duì)照組表達(dá)水平有所下降，PDTC組較陽(yáng)性對(duì)照組表達(dá)水平下降(圖3)。

本文通過(guò)對(duì)小說(shuō)女主人公安娜·卡列尼娜分析和把握，分別從這一人物的正面形象和負(fù)面形象出發(fā)，力圖能夠展現(xiàn)出一個(gè)鮮活飽滿(mǎn)的魅力女性形象，但不得不承認(rèn)的一點(diǎn)是，安娜形象的分析并不僅僅是局限于以上的幾點(diǎn)內(nèi)容，而應(yīng)該是更加豐富的、更加復(fù)雜的。作為一個(gè)男性作家托爾斯泰以他獨(dú)特的視角和細(xì)膩的筆觸，將自己獨(dú)特的女性觀(guān)融入小說(shuō)創(chuàng)作，塑造了安娜·卡列尼娜這樣一個(gè)復(fù)雜而迷人的女性形象。

3 討論

肝纖維化是慢性肝炎進(jìn)一步發(fā)展的重要階段，是ECM大量沉積的一種病理生理過(guò)程[14]。眾所周知，肝纖維化最終會(huì)導(dǎo)致肝硬化和肝衰竭。研究[15]表明肝纖維化可以被逆轉(zhuǎn)。筆者早期研究[16]表明，莪術(shù)醇具有抗纖維化作用。現(xiàn)有數(shù)據(jù)表明，莪術(shù)醇可以恢復(fù)肝竇毛細(xì)血管化。LSEC構(gòu)成了肝血竇的血管壁，是肝內(nèi)非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的主要群體，約占肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的50%。已分化的LSEC電鏡下可見(jiàn)其特征性的窗孔結(jié)構(gòu)，且窗孔內(nèi)皮下缺乏完整的基膜，窗孔占據(jù)總表面積的6%～8%，這種多孔性結(jié)構(gòu)在肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞與血液物質(zhì)交換中起著關(guān)鍵作用[17-18]。肝纖維化或體外培養(yǎng)的LSEC功能及形態(tài)發(fā)生重要改變，一是LSEC的失窗孔化，表現(xiàn)為窗孔數(shù)目的減少和孔徑變小，甚至消失；二是肝竇內(nèi)皮下形成高密度基底膜，這一現(xiàn)象于1963年由Schaffner等[19]發(fā)現(xiàn)并命名為肝竇毛細(xì)血管化。LSEC的失窗孔導(dǎo)致其通透性降低，各種代謝產(chǎn)物不容易進(jìn)入血循環(huán)，加重肝病理性損傷；同時(shí)減弱了肝細(xì)胞和血液之間氧及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的交換，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷和肝竇塌陷，而肝竇的塌陷會(huì)導(dǎo)致肝內(nèi)血管網(wǎng)減少，在門(mén)靜脈高壓的形成過(guò)程中起重要作用[20-21]。

表4 TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)水平

LSEC不僅是構(gòu)成肝竇壁的主要成分，并且可以合成和分泌NO，調(diào)節(jié)肝內(nèi)血管舒張和收縮，對(duì)肝竇血流的調(diào)節(jié)起重要作用。NO具有強(qiáng)大的血管擴(kuò)張作用，它以旁分泌形式直接刺激可溶性鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶，使環(huán)鳥(niǎo)苷酸增多，從而引起Ca2+降低和血管擴(kuò)張。NO還可以通過(guò)抑制HSC中α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)引起HSC舒張[22-23]。eNOS-NO-cGMP 信號(hào)通路是調(diào)控LSEC窗孔形成的重要通路[24]。當(dāng)NF-κB信號(hào)通路活化時(shí)，IκB激酶被激活，使其磷酸化進(jìn)而泛素化降解NF-κB抑制蛋白IκBα，胞質(zhì)中IκBα水平下降，使NF-κB P65亞基從抑制狀態(tài)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)入核，P65的入核能激活多種炎癥因子的表達(dá)，同時(shí)能調(diào)節(jié)iNOS基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致肝臟微循環(huán)的紊亂[25-26]。TLR4/NF-κB信號(hào)通路是調(diào)控機(jī)體炎癥反應(yīng)的經(jīng)典通路之一，TLR4是LPS的主要受體，參與了LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和氧化損傷[27]。目前研究[28-29]表明, TLR4介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路在肝纖維化的發(fā)展中發(fā)揮了重要作用, HSC在靜止和活化狀態(tài)下均表達(dá)TLR4, 而活化狀態(tài)下的HSC則表達(dá)完整的TLR4/NF-κB信號(hào)通路在肝纖維化的發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。Shi等[30]研究表明, 當(dāng)TLR4與LPS結(jié)合后, 通過(guò)MyD88-NF-κB通路激活HSC, 活化的HSC分泌TGFβ等重要纖維化因子, 同時(shí)又分化成為肌成纖維細(xì)胞并產(chǎn)生大量的ECM累積在肝組織中, 最終形成肝纖維化。

當(dāng)然，女貪官腐敗還有諸多其他動(dòng)機(jī)，例如僥幸心理、補(bǔ)償心理、攀比心理等。筆者認(rèn)為，僥幸心理只是上述投機(jī)心理的別樣稱(chēng)呼，基于不平衡心理而生的補(bǔ)償心理只是一種自我報(bào)償心理，仍不出“報(bào)償”的范疇，而攀比心理看似 “趨寡”實(shí)為“追風(fēng)”，只是對(duì)“從眾”的表面偏離，仍屬?gòu)谋娦睦淼姆懂牐视诖瞬辉僬撌觥?/p>

本實(shí)驗(yàn)以小鼠和LSEC為研究對(duì)象，在動(dòng)物層面證實(shí)莪術(shù)醇可以改善肝纖維化的病理改變；在細(xì)胞層面發(fā)現(xiàn)莪術(shù)醇可以明顯抑制TLR4和NF-κB的表達(dá)，對(duì)NF-κB的入核也有明顯的抑制。由此推測(cè)莪術(shù)醇可能是通過(guò)抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮抗肝纖維化的作用。具體的分子機(jī)制有待進(jìn)一步的研究，為莪術(shù)醇臨床治療肝纖維化提供科學(xué)依據(jù)。