張沛欣，邊培育，葉傳濤，鄭煦暘，范 超，張 穎，賈戰(zhàn)生，周 云

空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院 傳染科，西安 710038

HCV是黃病毒屬單股正鏈?zhǔn)筛蜶NA病毒，會(huì)引起高比例的慢性丙型肝炎(超過(guò)80%)。它是導(dǎo)致肝纖維化、肝硬化、肝細(xì)胞癌的主要原因，在許多國(guó)家是肝移植最常見(jiàn)的指征。HCV感染后，機(jī)體能夠產(chǎn)生固有免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)。固有免疫作用包括抗原遞呈細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞引起的細(xì)胞毒作用，導(dǎo)致感染細(xì)胞裂解和自然殺傷細(xì)胞分泌IFNγ等細(xì)胞因子，抑制HCV復(fù)制。適應(yīng)性免疫作用則產(chǎn)生病毒特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，特異性地識(shí)別和裂解感染細(xì)胞，產(chǎn)生病毒特異性抗體，中和細(xì)胞外的病毒顆粒。本研究小組[1]此前發(fā)現(xiàn)，沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1(sirtuin1,SIRT1)在HCV感染者CD4+T淋巴細(xì)胞上表達(dá)增高，抵抗細(xì)胞衰老。SIRT1在CD8+T淋巴細(xì)胞上的表達(dá)情況尚無(wú)研究。大量研究表明，HCV特異性CD8+T淋巴細(xì)胞免疫功能障礙是機(jī)體無(wú)法徹底清除病毒，導(dǎo)致持續(xù)感染的主要原因，其機(jī)制包括天然免疫的不足、病毒逃逸突變、抑制性受體的表達(dá)、CD4+輔助性T淋巴細(xì)胞免疫輔助功能受損、細(xì)胞因子的負(fù)性調(diào)節(jié)作用等[2]。本研究擬檢測(cè)并比較HCV感染者經(jīng)直接抗病毒藥物(DAA)治療前后CD8+T淋巴細(xì)胞衰老、負(fù)性調(diào)節(jié)因子相關(guān)指標(biāo)的變化，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2017年1月-2018年12月于空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院就診的HCV感染者及治愈者的血清和外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)《2016年歐洲肝病學(xué)會(huì)丙型肝炎治療指南》[3]。實(shí)驗(yàn)分為HCV感染者、HCV治愈者和健康對(duì)照組?？笻CV治療采用索磷布韋聯(lián)合達(dá)卡他韋方案。治愈者指慢性丙型肝炎患者完成12周抗病毒治療，達(dá)到病毒學(xué)應(yīng)答，HCV RNA均低于檢測(cè)下限，肝功能指標(biāo)ALT、AST正常。

1.2 試劑與方法

1.2.1 主要試劑 流式抗體CD3、CD4、CD8、CD57，SIRT1等購(gòu)自美國(guó)BD公司；反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)的 p53、p21引物購(gòu)自上海生工公司；用于磁珠分選細(xì)胞的CD8+T淋巴細(xì)胞分離試劑盒購(gòu)自德國(guó)美天旎公司，RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒，定量反轉(zhuǎn)錄PCR(qRT-PCR)試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司，Luminex液相懸浮芯片檢測(cè)由上海華盈生物醫(yī)藥科技有限公司提供。RPMI1640等常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)基、無(wú)抗生素?zé)o血清的OPT-MEM Ⅰ培養(yǎng)液、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD8+T淋巴細(xì)胞SIRT1、CD57、PD-1、Tim-3的表達(dá) Ficoll-Pague密度梯度離心法分離外周血中的PBMC，洗滌后加入CD8、CD57、PD-1表面抗體，4 ℃避光孵育30 min后洗滌，1500 r/min離心5 min 后棄上清。SIRT1、Tim-3為胞內(nèi)染色，用Inside Stain kit中的固定液4℃固定30 min，1500 r/min離心5 min后棄上清；加破膜液180 μl，1500 r/min離心5 min后棄上清。加50 μl 破膜液，加SIRT1、Tim-3抗體，室溫避光孵育30 min，1500 r/min離心5 min后棄上清，加流式緩沖液，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.3 RT-PCR檢測(cè)p53、p21 mRNA的表達(dá) 以CD8+T淋巴細(xì)胞分離試劑盒分離PBMC中的CD8+T淋巴細(xì)胞，用TRIzol提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過(guò)RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞衰老相關(guān)信號(hào)p53、p21 mRNA的表達(dá)水平。設(shè)計(jì)GAPDH、p53、p21分子的qRT-PCR引物，GAPDH上游引物：5′-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3′，下游引物：5′-CAAAGTTGTCATGGATGHACC-3′；p53 上游引物：5′-AGCGCTTCGAGATGTTCCGA-3′,下游引物：5′-TTCAGGTGGCTGGAGTGAGC-3′；p21 上游引物：5′-GGGATGTCCGTCAGAACCCA-3′，下游引物：5′-CACCCTCCAGTGGTGTCTCG-3′。RT-PCR反應(yīng)條件: 95 ℃ 5 min，進(jìn)入循環(huán)95 ℃ 10 s，60 ℃ 5 s，共循環(huán)42次，60 ℃ 5 s，65 ℃ 5 s，95 ℃ 30 s。生成擴(kuò)增曲線及熔解曲線，得出Ct值，各目的基因的表達(dá)量與內(nèi)參基因GAPDH進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，得到各基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 Luminex液相懸浮芯片檢測(cè)外周血衰老相關(guān)的分泌表型(senescence associated secretory phenotype，SASP)為檢測(cè)3組人群SASP，按照Luminex液相懸浮芯片檢測(cè)試劑盒操作手冊(cè)制備樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，取微珠在振蕩器上 1400 r/min，振蕩30 s，使用RD2-1稀釋微珠；用振蕩器1400 r/min，再次震蕩30 s，每孔50 μl加入96孔板中；取50 μl準(zhǔn)備好的標(biāo)曲、樣品和 Blank 加入對(duì)應(yīng)孔中，850 r/min振蕩，避光，室溫孵育2 h。洗滌，每孔加入50 μl稀釋好的Biotin Antibody Cocktail，850 r/min振蕩，避光，室溫孵育1 h。洗滌后每孔加入50 μl稀釋好的Streptavidin-PE，850 r/min振蕩，避光，室溫孵育30 min，洗滌后送入已校正的Luminex 200機(jī)器中讀值。

1.3 倫理學(xué)審查 本研究經(jīng)空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)：TDLL-2016142)，并與患者及健康對(duì)照者簽署知情同意書(shū)。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 共納入HCV感染者26例，HCV治愈者22例，健康對(duì)照者20例。各組男女比例及年齡、HCV RNA定量、基因分型和肝功能指標(biāo)見(jiàn)表1。

2.2 外周血CD8+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù) 流式細(xì)胞儀檢測(cè)健康對(duì)照組12例、HCV組18例、HCV治愈組15例3組人群PBMC中CD8+T淋巴細(xì)胞的水平，3組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.081，P=0.922)(圖1)。

2.3 CD8+T淋巴細(xì)胞上SIRT1、CD57、PD-1、Tim-3的表達(dá)水平 流式細(xì)胞儀檢測(cè)健康對(duì)照組12例、HCV組18例、HCV治愈組15例3組人群CD8+T淋巴細(xì)胞上SIRT1、CD57、PD-1、Tim-3的表達(dá)水平(圖2)。SIRT1在3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.712，P=0.003),與健康對(duì)照相比，HCV組SIRT1表達(dá)水平明顯升高(P<0.001)，經(jīng)治療后，HCV治愈組表達(dá)水平下降，且與HCV組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，HCV治愈組與健康對(duì)照組比較，SIRT1表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。CD57在3組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.203，P=0.817)。PD-1在3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.202，P=0.022)，與健康組相比，PD-1在HCV組明顯升高(P=0.008)，經(jīng)治療后略有下降，HCV治愈組與健康對(duì)照組、HCV組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。Tim-3在3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.575，P=0.016)，與健康對(duì)照組相比，Tim-3在HCV組(P=0.005)和HCV治愈組(P=0.047)均升高，HCV組和HCV治愈組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組一般臨床資料

2.4 CD8+T淋巴細(xì)胞上p53及p21的表達(dá)水平 RT-PCR檢測(cè)健康對(duì)照組、HCV組及治愈組3組人群CD8+T淋巴細(xì)胞上p53及p21的表達(dá)，每組8例(圖3)。結(jié)果顯示，p53表達(dá)倍數(shù)變化在3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=11.144，P<0.001)，HCV組及HCV治愈組p53表達(dá)水平較健康對(duì)照組明顯下降(P值均<0.001)。p21表達(dá)倍數(shù)變化在3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.594，P=0.006)，HCV組及HCV治愈組p21表達(dá)水平較健康對(duì)照組明顯下降(P值均<0.05)。

2.5 外周血SASP相關(guān)分子的表達(dá)水平 Luminex液相懸浮芯片檢測(cè)外周血SASP，包括IL-2、IL-6、CXCL1 GRO、TNFα(圖4)。其中健康對(duì)照組20例，HCV組21例，治愈組22例，IL-2、CXCL1 GRO在3組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值分別為0.748、0.616，P值均>0.05)。IL-6在3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.920，P=0.025)，HCV組較健康對(duì)照組明顯升高(P=0.007)，HCV治愈組與HCV組、健康對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。TNFα在3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.337，P=0.003)，HCV組較健康對(duì)照組和HCV治愈組均明顯升高(P值均<0.05)，HCV治愈組與健康對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

研究[4]發(fā)現(xiàn)肝硬化的HCV患者CD8+T淋巴細(xì)胞功能受損，CD8+T淋巴細(xì)胞亞群比例改變。通過(guò)DAA治療后，其受損的CD8+T淋巴細(xì)胞功能并無(wú)好轉(zhuǎn)，表現(xiàn)為CD107a及穿孔蛋白減少。DAA治療對(duì)于提高炎性因子和降低抑制性分子TGFβ并無(wú)效果。在慢性HCV感染過(guò)程中，肝纖維化的嚴(yán)重性與CD8+T淋巴細(xì)胞的功能亢進(jìn)相關(guān)，經(jīng)DAA治療后，即使病毒已清除，這種效應(yīng)仍持續(xù)存在。本試驗(yàn)檢測(cè)了DAA治療前后，CD8+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)在健康對(duì)照者、HCV感染者、HCV治愈者3組人群中并無(wú)差異。

Sirtuin蛋白是一組具有煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性的組蛋白去乙?；D(zhuǎn)移酶，參與機(jī)體一系列生物學(xué)活動(dòng)，在調(diào)控衰老和壽命方面發(fā)揮重要作用。SIRT1通過(guò)多種信號(hào)通路參與炎癥反應(yīng)、新陳代謝、細(xì)胞增殖、凋亡和衰老等過(guò)程。SIRT1與衰老關(guān)系密切，且在衰老細(xì)胞中表達(dá)減少。p53作為重要的抑癌基因，在多種細(xì)胞損傷應(yīng)激反應(yīng)中通過(guò)引起細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡來(lái)維持基因組的穩(wěn)定性。作為SIRT1主要底物，p53的功能發(fā)揮取決于其活性，p53的乙?；诎┗蛘T導(dǎo)細(xì)胞衰老和復(fù)制性衰老中都起關(guān)鍵作用，且能被 SIRT1抑制[5]。SIRT1對(duì)p53的去乙?；勺柚蛊鋵?duì)衰老的誘導(dǎo)。p21是p53最經(jīng)典的靶基因，亦是細(xì)胞周期抑制因子。在DNA 損傷、缺氧及癌基因激活等刺激下，p53對(duì)細(xì)胞周期G1監(jiān)測(cè)點(diǎn)的調(diào)控主要由p21介導(dǎo)[6]。p21的過(guò)表達(dá)則可導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯，并出現(xiàn)一系列衰老征象，如衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶活性增加，細(xì)胞扁平、脹大等。有研究[7]發(fā)現(xiàn)，持續(xù)感染將導(dǎo)致CD8+T淋巴細(xì)胞衰老，在HCV慢性感染者中，CD4+T淋巴細(xì)胞的端粒長(zhǎng)度和肝硬化的進(jìn)展與臨床預(yù)后不佳相關(guān)。筆者團(tuán)隊(duì)[1]此前也發(fā)現(xiàn)HCV感染者CD4+T淋巴細(xì)胞比健康對(duì)照者端粒長(zhǎng)度短，衰老細(xì)胞更多，但SIRT1的表達(dá)比健康對(duì)照者更高。有學(xué)者[8]研究了在HCV感染者的肝組織中T淋巴細(xì)胞周期性蛋白抑制劑p21、p27、p16，發(fā)現(xiàn)隨著纖維化程度增加，p21表達(dá)增加。也有學(xué)者[9]發(fā)現(xiàn)HCV特異性CD4+T淋巴細(xì)胞和 CD8+T淋巴細(xì)胞高表達(dá)PD-1。HCV感染者CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞中后期分化的T淋巴細(xì)胞明顯增多，提示免疫衰老。此外，還發(fā)現(xiàn)血漿中病毒載量與T淋巴細(xì)胞上CD57、PD-1的表達(dá)水平呈正相關(guān)。

本研究中HCV組與健康對(duì)照組相比，外周CD8+T淋巴細(xì)胞上SIRT1表達(dá)上升，經(jīng)過(guò)治療，HCV治愈組SIRT1表達(dá)水平下降，且與HCV組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與健康對(duì)照組無(wú)顯著性差異。衰老標(biāo)志分子CD57在3組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。HCV感染組及治愈組CD8+T淋巴細(xì)胞上p53、p21水平較健康對(duì)照組下降。推測(cè)在HCV感染后，外周循環(huán)CD8+T淋巴細(xì)胞衰老，導(dǎo)致SIRT1反應(yīng)性增高，抑制p53、p21的表達(dá)，HCV治愈后，CD8+T淋巴細(xì)胞衰老狀態(tài)部分恢復(fù)，SIRT1水平下降至與健康對(duì)照組無(wú)差異，但p53、p21表達(dá)水平低。衰老T淋巴細(xì)胞的增殖功能被抑制，有促炎的特征并且分泌高濃度的促炎因子，也稱作SASP，其與免疫功能有關(guān)[10]。

本研究中HCV組與健康對(duì)照組相比，外周CD8+T淋巴細(xì)胞上PD-1、Tim-3表達(dá)水平上升，經(jīng)治療后，HCV治愈組表達(dá)下降，但是HCV治愈組與HCV組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與本研究一致的，DAA治療清除HCV對(duì)CD8+T淋巴細(xì)胞功能和線粒體損傷恢復(fù)作用有限，PD-1和Tim-3在治療前后無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[11]。使用PD-1/PD-L1阻滯劑和Tim-3阻滯劑后，HCV特異性CD8+T淋巴細(xì)胞仍有增殖能力。此前有研究[12]分析了慢性HCV感染者CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞的衰竭狀態(tài)和促炎因子，發(fā)現(xiàn)PD-1在HCV肽刺激的CD4+T淋巴細(xì)胞上表達(dá)上升，Tim-3在HCV肽刺激的CD8+T淋巴細(xì)胞上表達(dá)上升。而促炎因子IL-2、TNFα、IL-17A和IL-6在T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)中顯著下降。研究者認(rèn)為慢性HCV感染導(dǎo)致CD4+T和CD8+T淋巴細(xì)胞功能衰竭，病毒持續(xù)感染。而本研究分析了HCV感染者外周血SASP，其中IL-2、CXCL1 GRO在3組人群中均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，IL-6、TNFα在HCV治愈組比健康對(duì)照組升高，HCV治愈組和HCV組相比稍有下降，其中TNFα有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。有研究[13]證實(shí)慢性丙型肝炎患者血清 IL-6水平均明顯高于健康對(duì)照組，在以索磷布韋為基礎(chǔ)的抗HCV治療12周后，慢性丙型肝炎患者血清IL-6水平均較基線明顯降低；升高表達(dá)的IL-6 可發(fā)揮促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖、拯救衰竭細(xì)胞功能的作用[14]。有研究[15]對(duì)使用DDA治療4周就獲得持續(xù)病毒性應(yīng)答(SVR)和復(fù)發(fā)的HCV感染者與基線和治療終點(diǎn)的CD8+T淋巴細(xì)胞進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)PD-1陽(yáng)性的CD8+T淋巴細(xì)胞及細(xì)胞毒性能力和獲得早期SVR相關(guān)，與本研究一致的是，Tim-3、TNFα在早期獲得SVR的CD8+T淋巴細(xì)胞上表達(dá)升高。

綜上，本研究分析了HCV感染者DAA治療前后CD8+T淋巴細(xì)胞衰老、功能相關(guān)指標(biāo)的變化。發(fā)現(xiàn)與健康對(duì)照組相比，HCV感染者CD8+T淋巴細(xì)胞衰老，HCV組CD8+T淋巴細(xì)胞上SIRT1表達(dá)水平升高，HCV治愈后，CD8+T淋巴細(xì)胞衰老狀態(tài)部分恢復(fù)，SIRT1水平下降至與健康對(duì)照組無(wú)差異，p53、p21在HCV組和HCV治愈組表達(dá)水平均降低；HCV感染者CD8+T淋巴細(xì)胞上PD-1、Tim-3表達(dá)水平升高，分泌的IL-6和TNFα表達(dá)水平升高。DAA治療后衰老緩解，T淋巴細(xì)胞功能部分恢復(fù)，HCV治愈組CD8+T細(xì)胞PD-1和IL-6、TNFα的水平與健康對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。