李淑紅 劉勇 孫明蘭

摘要：為查明湘西北某規(guī)?；膛?chǎng)犢牛腹瀉的主要病因，采用細(xì)菌培養(yǎng)、平板劃線法分離、鑒別培養(yǎng)基分離、革蘭氏染色、生化鑒定等方法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分離與鑒定;選取28種抗菌藥用Kirby-Bauer紙片法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。結(jié)果表明，分離出9株沙門氏菌。沙門氏菌對(duì)丁胺卡那和頭孢他啶敏感，敏感率為7.14%;對(duì)慶大霉素和頭孢曲松中介，中介率7.14%;對(duì)諾氟沙星、紅霉素、氧氟沙星等24種藥物產(chǎn)生耐藥性，耐藥率為85.71%。說明沙門氏菌是引起該場(chǎng)犢牛腹瀉的主要原因之一，臨床上沙門氏菌的耐藥性較高，應(yīng)引起高度重視。

關(guān)鍵詞：犢牛腹瀉;沙門氏菌;分離鑒定;耐藥性

犢牛腹瀉的原因較多，分為單純性腹瀉，主要是由于母牛營(yíng)養(yǎng)不良、犢牛飼養(yǎng)管理不當(dāng)?shù)纫?細(xì)菌性腹瀉，主要是由致病性大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌等感染引起;病毒性腹瀉，主要是由輪狀病毒、冠狀病毒等引起;寄生蟲感染引起的腹瀉，主要是由隱孢子蟲、賈第蟲、球蟲等引起[1]。腹瀉的犢牛生長(zhǎng)發(fā)育受阻，如果不及時(shí)診斷、治療，則易導(dǎo)致機(jī)體抵抗力下降甚至死亡，給奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2-3]。

細(xì)菌性腹瀉中的沙門氏菌（salmonella）是嚴(yán)重危害人類及畜禽健康的主要致病菌之一，各種年齡的動(dòng)物均可感染，幼年動(dòng)物感染率高且造成的影響和危害更嚴(yán)重[4]。湘西北地區(qū)某規(guī)?；膛?chǎng)部分犢牛發(fā)生腹瀉，為查找病因，減少經(jīng)濟(jì)損失，試驗(yàn)對(duì)引起犢牛腹瀉的細(xì)菌進(jìn)行分離鑒定，并對(duì)分離菌株進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)和耐藥性分析，為臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 病料來源于2018年11月湘西北地區(qū)某規(guī)?；膛?chǎng)9頭20～40日齡腹瀉犢牛。

1.1.2 藥品及主要試劑 營(yíng)養(yǎng)肉湯（NB）、營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA）、伊紅美藍(lán)瓊脂（EMB）、麥康凱瓊脂（MAC）、亞硫酸鉍（BS）瓊脂、SS瓊脂培養(yǎng)基;腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定管（11種 10支）;結(jié)晶紫、番紅、95%乙醇等;丁胺卡那、慶大霉素、諾氟沙星等28種藥敏紙片，均購(gòu)于杭州微生物試劑有限公司。

1.1.3 主要儀器 垂直凈化工作臺(tái)（SP-DJ），中國(guó)上海浦東物理光學(xué)儀器廠生產(chǎn);立式壓力蒸汽滅菌器（BXM-30R），上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司生產(chǎn);生化培養(yǎng)箱（LRH-150），上海一恒科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn);電子天平（BS223S），北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司生產(chǎn)[5]。

1.2 方法

1.2.1 病料采集 用滅菌棉簽采取9頭腹瀉犢牛直腸處新鮮糞樣，分別放入有營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的試管中，做好標(biāo)記，將試管置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng) 18～24 h。

1.2.2 細(xì)菌分離鑒定 將增菌培養(yǎng)18～24 h的含病原菌的肉湯樣品，分別劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA）、伊紅美藍(lán)瓊脂（EMB）、麥康凱瓊脂（MAC）、亞硫酸鉍（BS）瓊脂、SS瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h，觀察結(jié)果。

1.2.3 革蘭氏染色鏡檢 挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

1.2.4 生化試驗(yàn) 取疑是沙門氏菌的菌落接種到腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定管中，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h后觀察反應(yīng)現(xiàn)象，根據(jù)沙門氏菌生化反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判定[6]。

1.2.5 藥敏試驗(yàn) 采用紙片瓊脂擴(kuò)散法（disc agar diffusion），即Kirby-Bauer法，選用28種抗菌藥進(jìn)行藥物敏感性測(cè)定[7]，藥物敏感性判斷標(biāo)準(zhǔn)分為：敏感（S）、中介（I）和耐藥（R）3個(gè)等級(jí)。判定標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌在培養(yǎng)基中的形態(tài)學(xué)觀察

營(yíng)養(yǎng)肉湯（NB）中為均勻渾濁，底部有少量沉淀的菌液。營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA）上菌落顏色為淡黃色，表面光滑、濕潤(rùn)、邊緣整齊、凸起、圓形、中等大小。在麥康凱瓊脂（MAC）和伊紅美藍(lán)瓊脂（EMB）培養(yǎng)基中生長(zhǎng)為圓形、光滑、邊緣整齊無色透明的小菌落。亞硫酸鉍（BS）瓊脂為灰黑色或灰綠色圓形、光滑小菌落。SS培養(yǎng)基生長(zhǎng)出無色半透明、光滑、凸起、多數(shù)中心黑色的圓形菌落，符合沙門氏菌菌落生長(zhǎng)形態(tài)特征[9-10]。沙門氏菌在BS和SS培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)特征見圖1、圖2。

2.2 革蘭氏染色結(jié)果

在油鏡（10×100倍）下可見淡粉色、細(xì)長(zhǎng)、無莢膜、無芽孢的革蘭氏陰性（G-）直桿狀細(xì)菌，符合沙門氏菌特性[10]。

2.3 生化鑒定結(jié)果

細(xì)菌對(duì)靛基質(zhì)、乳糖、苯丙氨酸、尿素、氨對(duì)的反應(yīng)為陰性;對(duì)賴氨酸、硫化氫、衛(wèi)矛醇、鳥氨酸、枸緣酸鹽反應(yīng)為陽性;對(duì)葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣。生化反應(yīng)特性與沙門氏桿菌特征相符[9-10]。

經(jīng)過細(xì)菌培養(yǎng)、分離、菌落形態(tài)觀察、鑒別培養(yǎng)基培養(yǎng)、涂片革蘭氏染色、顯微鏡觀察、生化試驗(yàn)等現(xiàn)象進(jìn)行判斷，共分離出25株細(xì)菌，其中9頭腹瀉犢牛樣品分離的9株細(xì)菌符合沙門氏菌的特征，分離率為36%，初步確定為沙門氏菌。

2.4 藥物敏感性測(cè)定結(jié)果

分離的9株沙門氏菌對(duì)所用28種藥物中的丁胺卡那和頭孢他啶敏感，敏感率為7.14%;對(duì)慶大霉素和頭孢曲松中介，中介率7.14%;對(duì)諾氟沙星、紅霉素、氧氟沙星等24種藥物產(chǎn)生耐藥，耐藥率為85.71%（表1）。

3 討論與小結(jié)

對(duì)湘西北奶牛場(chǎng)犢牛腹瀉細(xì)菌的分離結(jié)果表明，共分離25株細(xì)菌，其中在9頭腹瀉犢牛的樣本中均分離到沙門氏菌，檢出率為100%。結(jié)合犢牛腹瀉流行病學(xué)特點(diǎn)及臨床表現(xiàn)，初步確定沙門氏菌是造成該奶牛場(chǎng)犢牛腹瀉的主要原因之一。

經(jīng)調(diào)查奶牛場(chǎng)在犢牛發(fā)生腹瀉病時(shí)，使用了瀉立停、諾氯沙星等藥物進(jìn)行治療，但效果不明顯。藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果表明，沙門氏菌對(duì)諾氯沙星、紅霉素等24種藥產(chǎn)生耐藥性;對(duì)丁胺卡那和頭孢他啶2種藥敏感，對(duì)慶大霉素和頭孢曲松2種藥中介，與2006年喻華英等分離的沙門氏菌對(duì)慶大霉素中介[11]相同，對(duì)諾氟沙星極敏感、對(duì)紅霉素中度敏感存在較大差異，主要原因是臨床廣泛使用抗菌藥物防治沙門氏菌病，加之用藥不科學(xué)不規(guī)范，使沙門氏菌的耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)重，隨著時(shí)間的推移，其耐藥率大幅上升，耐藥譜不斷增寬，給我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)和人類健康帶來嚴(yán)重威脅[12]。此次試驗(yàn)選用的28種藥物中沙門氏菌已對(duì)24種抗菌藥產(chǎn)生了耐藥性，耐藥率高達(dá)85.71%，10多年前沙門氏菌對(duì)諾氟沙星、氧氟沙星等藥物現(xiàn)已產(chǎn)生了較強(qiáng)的耐藥性，應(yīng)引起畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)的高度重視，因此在臨床上對(duì)沙門氏菌引起的疾病治療中應(yīng)科學(xué)合理使用抗菌藥，并深入開展沙門氏菌耐藥機(jī)理的研究，盡可能降低細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。

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