劉春玲 鄭海興 孫艷

【摘要】目的 分析阿爾茨海默病（AD）患者血清外泌體的提取鑒定及蛋白質組學狀況。方法 選擇30例AD患者作為研究對象，取空腹靜脈血制備血清標本。以Exo Quick試劑盒提取外泌體，并以鈾鉛雙染色法處理后的組織塊置于電鏡下鑒定;選用TBST、PVDF開展蛋白質組學分析。結果 30例AD患者血清外泌體的直徑為（92.64±23.41）nm;且所有標本的CD63檢測均呈陽性。AD患者伴免疫球蛋白重鏈、維生素D結合蛋白及CD5抗原表達異常。結論 AD患者的血清中含有外泌體，其免疫球蛋白重鏈、維生素D結合蛋白及CD5抗原表達異?？蔀锳D診斷、病情進展評估提供支持。

【關鍵詞】阿爾茨海默病;外泌體;蛋白質組學

作為老年群體的常見病，AD以預后差、病程長為基本特征[1]。目前，AD的發(fā)病機制尚未完全明確，這一狀況限制了其治療體系的擴展。研究指出，外泌體與AD的發(fā)生發(fā)展存在密切關聯(lián)[2]。因此，分析AD患者血清中外泌體的提取鑒定及蛋白質組學分析具有一定的現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑及研究對象

儀器：微量移液器;低溫高速離心機;酶標儀;電泳槽等。試劑：BCA蛋白濃度測定試劑盒;兔抗CD63;ECL底物液;Exo Quick Exosome Precipitation Solution（以下記為Exo Quick試劑盒）等。

選擇我院于2018年10月～2019年7月收治的30例AD患者為研究對象。男19例，女11例;年齡（64.7±11.6）歲。

1.2 方法

1.2.1 血清樣本采集方法

于清晨采集30例AD患者的空腹靜脈血5 ml，置于血清分離膠試管內(nèi)。于室溫條件下持續(xù)靜置0.5 h后，置于4℃溫度下，按照3000 r/min轉速，持續(xù)離心5 min，取上層血清標本保存待檢。

1.2.2 外泌體提取鑒定方法

提取方法：將血清標本置入干凈試管內(nèi)，向其中混入適量Exo Quick，充分混勻后，于4℃條件持續(xù)孵育0.5 h;所得混合物按照1500 r/min轉速持續(xù)離心0.5 h;清除上清液后，再次按照上述轉速離心處理5 min，即可獲得外泌體（沉淀）。向沉淀內(nèi)混入100～500 μl 1x PBS重懸液，獲取外泌體溶液。

鑒定方法：于4℃條件下，以0.1 M磷酸緩沖液及2.5%濃度戊二醛固定2 h外泌體（形態(tài)：組織塊）;采用大量0.1 M磷酸緩沖液漂洗經(jīng)固定后的外泌體組織塊，持續(xù)漂洗3次;于室溫下，經(jīng)0.1 M磷酸緩沖液、1%鋨酸持續(xù)固定2 h;取大量0.1 M磷酸緩沖液漂洗經(jīng)第二次固定處理的外泌體，漂洗次數(shù)與第一次漂洗一致;將外泌體組織塊分別置于濃度為50%、70%、80%、90%、95%及100%的酒精上進行脫水處理;以812包埋劑、純812包埋劑進行滲透處理;于60℃條件下，持續(xù)聚合48 h;按照60～80 nm標準，針對外泌體組織塊進行切片;以鈾鉛雙染色法進行染色處理，最后將其置于電鏡下進行鑒定。

1.2.3 蛋白質組學分析方法

經(jīng)封閉處理后，以封閉液稀釋一抗，于一抗孵育液內(nèi)浸入PVDF膜，置于4℃條件下持續(xù)孵育（過夜）;采用TBST洗去多余一抗;以封閉液稀釋二抗（HRP標記），確認PVDF膜充分浸潤于二抗孵育液內(nèi)后，于37℃條件下孵育2 h;以TBST洗去多余二抗;按照1：1比例，混合過氧化物酶及增強液，于PVDF膜表面滴加適量工作液，待充分反應后，以X光膠片進行壓片處理，分別以顯影液、定影液顯影、定影，最終獲得膠片。將掃描出的膠片采用BandScan進行分析（灰度值參數(shù)）。以電泳儀完成蛋白質組學檢測。

2 結 果

本研究中AD患者的外泌體鑒定結果為：平均直徑（92.64±23.41）nm;30份標本的CD63抗體檢測結果均呈陽性。蛋白質組學分析結果提示：外泌體組塊中，免疫球蛋白重鏈、維生素D結合蛋白及CD5抗原表達異常。

3 討 論

近年來，AD發(fā)病率逐漸升高[3]。明確AD的發(fā)病機制、早期診斷AD，已經(jīng)成為改善AD患者預后的關鍵所在。

外泌體作為一種常見小膜泡，其可由多類細胞分泌。這種膜泡天然存在于乳汁、尿液等體液中。這種膜泡被證實參與腫瘤細胞的侵襲機制、免疫應答及細胞遷移等多種機制中[4]。近年來，隨著臨床關于這種膜泡研究的不斷深入，其與AD之間的關聯(lián)逐漸引起了人們的重視。外泌體可參與海馬神經(jīng)元突觸、神經(jīng)發(fā)育及再生機制。當機體星形膠質細胞、神經(jīng)元分泌外泌體后，處于游離狀態(tài)的外泌體可與受體細胞發(fā)生結合反應，進入細胞內(nèi)，與胞內(nèi)體包膜發(fā)生融合反應，對疾病相關蛋白形成一定的調(diào)控作用?；谏鲜鲎饔?，可初步判斷：外泌體與AD的形成及發(fā)展存在一定關聯(lián)。

對于患者血清中的外泌體，可用的檢測方法較多，如色譜法及超速離心法等。上述方法雖然可證實血清標本中外泌體的存在，但所提取的外泌體標本，難以保持良好的生物活性及純度水平。相比之下，Exo Quick試劑盒所采用的免疫沉淀法，則可借助沉淀反應，將存在于患者血清中的外泌體以沉淀形式提取出來，且這種方法可保障提取物具有生物活性。本研究以Exo Quick試劑盒提取并經(jīng)電鏡鑒定，30例AD患者的外泌體直徑參數(shù)與既往研究一致。這一結果表明：這種提取方法，可為AD患者的診斷及病情評估提供一定支持。

而從AD患者外泌體組塊的蛋白質組學分析結果來看，其在多種蛋白質方面存在異常表達現(xiàn)象。根據(jù)上述結果，可考慮將免疫球蛋白重鏈、維生素D結合蛋白及CD5抗原這三種蛋白納入AD的初篩診斷、預后評估中，通過對患者上述三種蛋白表達狀況的監(jiān)測，判斷其合并AD的風險，并以此為依據(jù)，調(diào)整AD患者的治療方案。

綜上所述，Exo Quick試劑盒可為AD血清外泌體的提取鑒定提供支持，而蛋白質組學分析則有助于更新AD的診斷方法。

參考文獻

[1] 張 銳，王永祥，杜怡峰.外泌體在阿爾茨海默病發(fā)病機制和診療中的作用[J].醫(yī)學綜述，2019，25（18）：3547-3551.

[2] 王周凡.阿爾茨海默病患者血清中外泌體的提取鑒定及蛋白質組學研究[D].南華大學，2018.

[3] 陳建交，趙 斌，趙 杰，等.外泌體microRNAs在阿爾茨海默病中的潛在診斷價值[J].生理科學進展，2017，48（06）：401-408.

[4] 張麗玲.血漿神經(jīng)來源的外泌體表達蛋白作為阿爾茨海默病早期診斷生物標志物的研究[D].天津醫(yī)科大學，2017.