吳曉娟，魯俊倩，常英英，鐘姍辰，蘇曉華，張冰玉

(林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家林業(yè)和草原局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，北京 100091)

DNA 甲基化修飾是一種重要的表觀遺傳修飾，它通過影響DNA 的構(gòu)象、穩(wěn)定性及其與蛋白質(zhì)的相互作用方式以及染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)等調(diào)控基因的表達(dá)[1]，在植物生長發(fā)育以及環(huán)境響應(yīng)等過程中具有重要的調(diào)節(jié)作用，并能夠引起可遺傳的表觀變異[2-3]。植物體中DNA 甲基化的建立和維持受多個基因的協(xié)同調(diào)控，這些甲基化相關(guān)基因的功能缺失和超表達(dá)均能引起基因組DNA 甲基化水平的變化，從而影響基因表達(dá)；植物DNA 甲基化相關(guān)基因主要有甲基轉(zhuǎn)移酶（MET）基因、域重排甲基轉(zhuǎn)移酶（DRM）基因、染色質(zhì)重塑酶（CMT）基因和DNA 甲基化轉(zhuǎn)移酶2（DNMT2）基因[4]。在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中，MET1 基因主要維持CG 對稱位置的胞嘧啶甲基化[5-6]。擬南芥的DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶MET1 在配子體形成過程中通過維持精細(xì)胞中印跡基因FIS2、MPC 和FWA 的甲基化來實(shí)現(xiàn)基因的沉默[7-9]。擬南芥MET1 弱突變體的表型變化不大，但其自交后代出現(xiàn)頂端優(yōu)勢減弱、植株矮小、葉形改變、營養(yǎng)狀態(tài)差以及開花時間延遲等性狀[10]。此外，MET1還在植物逆境脅迫中發(fā)揮重要的作用[6,11-12]。Brocklehurst 等[13]研究表明，在擬南芥中，超表達(dá)MET1會在編碼轉(zhuǎn)座因子、非編碼RNA 和蛋白質(zhì)的基因座上隨機(jī)產(chǎn)生新的表觀等位基因，這些表觀變異可傳遞給下一代；MET1 以及其他編碼表觀遺傳因子基因的超表達(dá)及抑制表達(dá)，提供了另一種鑒定表觀遺傳靶基因和創(chuàng)建新的表觀等位基因的策略。

Zuo 等[14]利用細(xì)菌阻遏物L(fēng)exA 的DNA 結(jié)合域（DBD）和VP16 的反式激活結(jié)構(gòu)域開發(fā)的基于人類雌激素受體（ ER）調(diào)節(jié)區(qū)域的誘導(dǎo)系統(tǒng)，稱為XVE 系統(tǒng)，它是一種高效的嚴(yán)格依賴于動物17-β-雌二醇誘導(dǎo)的嵌合式轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)，能夠根據(jù)雌激素的使用劑量來嚴(yán)格控制下游基因的表達(dá)水平。目前，XVE誘導(dǎo)系統(tǒng)能夠有效控制目的基因在擬南芥[14-17]、煙草[6,18-19]、長春花[20]、水稻[21-22]和柑橘[23]等植物中的表達(dá)，并且在擬南芥中已經(jīng)通過XVE 系統(tǒng)的應(yīng)用得到了一系列的突變體[24]。目前，XVE 系統(tǒng)已經(jīng)應(yīng)用于植物基因功能研究等多個方面，是比較理想的操縱基因表達(dá)和研究基因功能的化學(xué)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)[19]。pER8-MET1 載體是依據(jù)XVE 系統(tǒng)構(gòu)建，研究證明17-β-雌二醇能夠有效調(diào)控?zé)煵葜型庠椿虻谋磉_(dá)[6]。

本研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將化學(xué)誘導(dǎo)啟動子與擬南芥甲基化轉(zhuǎn)移酶基因AtMET1 導(dǎo)入銀腺楊84K（Populus alba×P.glandulosa ‘84K’）的核基因組，利用化學(xué)誘導(dǎo)劑17-β-雌二醇調(diào)控目的基因AtMET1 的表達(dá)，研究其在楊樹中的誘導(dǎo)表達(dá)特性，為建立楊樹甲基化誘導(dǎo)變異體系、實(shí)現(xiàn)楊樹品種改良和基因功能分析等奠定良好的基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

植物材料為84K 無菌苗。農(nóng)桿菌菌株GV3101、植物表達(dá)載體pER8-AtMET1 均由本實(shí)驗(yàn)室保存。Premix TaqTM購自TaKaRa 公司（日本），引物由上海生工有限公司合成，DNA 測序由Invitrogen 公司（上海）完成。

1.2 方法

1.2.1 AtMET1 基因的遺傳轉(zhuǎn)化 采用電擊轉(zhuǎn)化法將植物表達(dá)載體pER8-AtMET1 轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，經(jīng)PCR 鑒定后保菌。挑取單菌落接種于2 mL LB 液體培養(yǎng)基（含有50 mg·L-1壯觀霉素和17 mg·L-1利福平）中，28℃過夜振蕩培養(yǎng)。取2 mL 菌液接種于100 mL 與以上相同的LB 培養(yǎng)液中再次振蕩培養(yǎng)至OD 值為0.6～0.8。

取繼代培養(yǎng)4 周的84K 楊無菌苗頂部第3～5 片葉，切成1.5 cm×1.5 cm 的葉盤，垂直主脈切2～3 刀。將處理好的葉片放入搖好的菌液中浸染12～15 min，將葉片置于無菌濾紙上吸凈表面菌液，接種于共培養(yǎng)培養(yǎng)基（MS+0.5 mg·L-1BA+0.05 mg·L-1NAA）上暗培養(yǎng) 3 d 后，轉(zhuǎn)至篩選培養(yǎng)基（MS+0.5 mg·L-1BA+0.05 mg·L-1NAA+Timentin 200 mg·L-1+Hygromycin 3 mg·L-1）上，在溫度為28℃、16 h/8 h 光周期、光照強(qiáng)度1 500～2 000 lax下培養(yǎng)。當(dāng)分化的芽長到1～2 cm 時，將其轉(zhuǎn)入生根篩選培養(yǎng)基(1/2MS+0.02 mg·L-1NAA+0.05 mg·L-1IBA+Timentin 200 mg·L-1+Hygromycin 3 mg·L-1)中進(jìn)行生根篩選。

1.2.2 轉(zhuǎn)化植株的分子檢測 用植物基因組DNA 提取試劑盒（TIANGEN，北京）提取轉(zhuǎn)基因植株及對照葉片基因組DNA。根據(jù)已知pER8-AtMET1 載體特異序列設(shè)計擴(kuò)增Hygromycin 基因(HPT)的引物HP，同時擴(kuò)增部分HPT 基因和AtMET1 基因的引物HM（表1），用ABI Veriti 96 孔梯度PCR 儀（ABI，美國）進(jìn)行PCR 檢測，總 的 反 應(yīng) 體 系 為20 μL：Premix TaqTM10 μL，Primer-F(10 μmol·L-1) 0.5 μL，Primer-R(10 μmol · L-1)0.5 μL，DNA 模板5 μL，加 ddH2O 至終體積20 μL。PCR 反應(yīng)參數(shù)為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性10 s，56℃退火10 s，72℃延伸1 min 15 s，共35 個循環(huán)；72℃終延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用Axygen 公司（美國）瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收純化HM 擴(kuò)增片段，連接到克隆載體pMD?19-T Vector Cloning Kit（TaKaRa，日本），轉(zhuǎn)化E.coli DH5α（TIANGEN，北京），經(jīng)過藍(lán)白斑篩選，挑取陽性克隆進(jìn)行DNA序列測定。用DNAMAN 9.0 軟件將測序得到的基因序列與目的基因序列進(jìn)行比對。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因植株目的基因的誘導(dǎo)表達(dá) 隨機(jī)取1 個轉(zhuǎn)基因株系及未轉(zhuǎn)化的84K 對照無菌苗葉片（第3～5 片葉子），切成1.0 cm×1.0 cm 的葉盤，垂直主脈切2～3 個傷口，平鋪于加有100 μmol·L-117-β-雌二醇的不定芽分化培養(yǎng)基上，每個平板約放10 個葉盤（葉正面朝下、保證葉盤完全接觸培養(yǎng)基），2 次重復(fù)，野生型對照處理0、12 h，轉(zhuǎn)基因株系處理0、3、6、12、24、48、96、144 h。處理后隨機(jī)各取5 個葉盤，液氮冷凍后保存于-80℃冰箱，用于RNA 提取。

表1 常規(guī)PCR 檢測相關(guān)引物序列Table 1 The primer sequences of PCR

1.2.4 實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測AtMET1 基因的表達(dá)量 用EASY spin Plus 植物RNA 快速提取試劑盒（Aidlab，北京）分別提取經(jīng)雌激素誘導(dǎo)處理不同時間轉(zhuǎn)基因株系葉片的總RNA，1 μg 總RNA 用于cDNA 合成。首先去除殘留DNA，反應(yīng)體系如下：5×gDNA Eraser Buffer 2.0 μL，gDNA Eraser 1.0 μL，Total RNA 1 μg，RNase Free H2O 補(bǔ)足至10 μL，42℃ 2 min。向上述離心管中加入體系RNase Free H2O 4 μL，5×PrimeScript Buffer 2(for Real Time) 4 μL，RT Primer Mix 1 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 μL，混勻后37℃下反應(yīng)15 min，85℃ 5 s 終止反應(yīng)，-20℃保存?zhèn)溆?。將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA 稀釋5 倍作為反應(yīng)模板，參照TaKaRa 公司的TB GreenTMPremix Ex TaqTMII（Tli RNase HPlus）試劑盒說明配制反應(yīng)體系，總反應(yīng)體系為20 μL，其中，TB Green Premix TaqII（Tli RNase HPlus）10 μL，Primer-F (10 μmol·L-1) 0.8 μL，Primer-R(10 μmol·L-1)0.8 μL，cDNA 模板2 μL，用去離子水補(bǔ)足至20 μL。用Roche Light Cycle 480Ⅱ型熒光定量PCR 儀（Roche，瑞士）進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60℃ 30 s，40 個循環(huán)；95℃ 5 s，60℃ 1 min，95℃；50℃ 30 s。引物見表2。以Actin 為內(nèi)參基因，每個樣品6 次重復(fù)，用2-ΔΔCT算法進(jìn)行分析[16]。

表2 qRT-PCR 反應(yīng)相關(guān)引物序列Table 2 The primer sequences of qRT-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 84K 楊潮霉素抗性植株的獲得

取4 周大的野生型84K 楊無菌苗葉片切成葉盤后進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。經(jīng)過3～4 d 的共培養(yǎng)后將葉片放入含有3 mg·L-1潮霉素的MS 分化培養(yǎng)基上進(jìn)行抗性篩選，約10 d 后葉盤切口處產(chǎn)生小的突起，35 d 后抗性芽長至0.5 cm 左右，將抗性芽連同下面的著生葉盤切下，轉(zhuǎn)移到新鮮的潮霉素分化培養(yǎng)基上進(jìn)行二次篩選分化。經(jīng)過多次篩選(圖1A)后，將伸長至1 cm 左右的抗性芽切下，并轉(zhuǎn)移到含有3 mg·L-1潮霉素的生根篩選培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，約10 d 后開始生根(圖1B)?？傆嬣D(zhuǎn)化葉盤數(shù)約2 700 個，在分化初篩培養(yǎng)基上產(chǎn)生的抗性芽數(shù)約648 個，最終獲得18 株潮霉素抗性植株。

圖1 抗性芽及抗性植株的獲得Fig.1 The hygromycin resistant buds and resistant plants of AtMET1 transgenic P.alba×P.glandulosa ‘84K’

2.2 轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測

提取野生型植株和18 株抗性植株的植物總DNA，以質(zhì)粒為陽性對照，以野生型84K 楊為陰性對照，進(jìn)行PCR 檢測。HP 引物擴(kuò)增結(jié)果顯示：獲得的18 株潮霉素抗性植株的DNA 均可擴(kuò)增出843 bp 的目的條帶，與預(yù)期目的條帶大小相符(圖2)；為區(qū)別導(dǎo)入的AtMET1 基因與楊樹基因組內(nèi)的同源基因，設(shè)計HM 引物擴(kuò)增從HPT 基因下游的119 bp到AtMET1 基因上游的233 bp 的序列，包含兩基因間688 bp 的間隔。PCR 結(jié)果顯示：上述18 株HP 基因陽性均能擴(kuò)出1 條1 040 bp 大小的條帶，與預(yù)測目的條帶大小相符(圖3)。以上結(jié)果證明：誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)及目的基因已成功導(dǎo)入84K 楊，外源基因的遺傳轉(zhuǎn)化效率為2.78 %。這18 株陽性植株分別編號為AM-1～18#。

切取圖3 中目的條帶，經(jīng)過膠回收純化后連入pMD?19-T Vector 載體（TaKaRa），挑取白色克隆進(jìn)行DNA 測序。測序結(jié)果表明：PCR 產(chǎn)物序列與質(zhì)粒序列比對結(jié)果相似度為100%，其中，潮霉素抗性基因的測序長度為119 bp（圖4A），AtMET1 基因的測序長度為102 bp（圖4B）。

圖2 抗性植株潮霉素抗性基因PCR 檢測Fig.2 PCR detection of HPT gene in AtMET1 transgenic P.alba×P.glandulosa‘84K’ plants

圖3 抗性植株HM 引物擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 PCR detection of HPT and AtMET1 gene in AtMET1 transgenic P.alba×P.glandulosa ‘84K’ plants

圖4 陽性植株DNA 測序比對結(jié)果Fig.4 Alignment results of HPT gene andAtMET1 gene by DNA sequencing of the transgenic P.alba×P.glandulosa‘84K’ plants.

2.3 轉(zhuǎn)基因植株誘導(dǎo)表達(dá)

為了研究轉(zhuǎn)基因楊樹中XVE 系統(tǒng)能否有效啟動目的基因表達(dá)以及其表達(dá)水平隨17-β-雌二醇處理時間變化的趨勢，分別提取用雌激素誘導(dǎo)處理不同時間的AM-1#離體葉片總RNA，利用qRTPCR 檢測AtMET1 基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示：用100 μmol·L-1的17-β-雌二醇處理后，野生型植株處理12 h 與處理前一樣，都沒有目的基因的表達(dá)；轉(zhuǎn)基因植株未經(jīng)誘導(dǎo)時目的基因沒有表達(dá)，誘導(dǎo)3 h 時目的基因的表達(dá)量即達(dá)到最大值，處理6 h 后表達(dá)下降，處理12 h 有所回升，處理24 h 以后表達(dá)量降低至不足處理12 h 時的一半（圖5）。以上結(jié)果說明，雌激素能夠有效誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因楊樹中XVE 系統(tǒng)誘導(dǎo)啟動子的啟動，使下游基因表達(dá)，且處理3 h時表達(dá)量最高，但隨著處理時間的延長，誘導(dǎo)表達(dá)效果減弱。

圖5 轉(zhuǎn)基因植株中AtMET1 的誘導(dǎo)表達(dá)檢測Fig.5 Expression of AtMET1in leaf of transgenic P.alba×P.glandulosa‘84K’induced by 17-β-estradiol treatment

3 討論

本研究將受17-β-雌二醇誘導(dǎo)的化學(xué)誘導(dǎo)啟動子及AtMET1 基因用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入84K 楊基因組，并利用qRT-PCR 檢測其中AtMET1 基因的表達(dá)量隨17-β-雌二醇誘導(dǎo)時間變化的趨勢。結(jié)果表明，處理3 h 目的基因的表達(dá)量即達(dá)到最大值，隨后在處理6 h 時表達(dá)量下降，處理12 h 時有所回升，處理24 h以后表達(dá)量降低至不足處理12 h 時的一半，說明化學(xué)誘導(dǎo)劑17-β-雌二醇能迅速有效地調(diào)控AtMET1 基因在楊樹中的表達(dá)。

Zuo 等[14]研究顯示，用2 μmol·L-1的17-β-雌二醇處理擬南芥幼苗，目的基因的表達(dá)量隨著處理時間的增加而逐漸上升，在24 h 時達(dá)到最高后逐漸下降；代麗娟等[19]研究顯示，用2 μmol·L-1的17-β-雌二醇處理煙草幼苗，在48 h 時目的基因表達(dá)量最高；梁立雄等[6]研究顯示，用50 μmol·L-1的17-β-雌二醇涂抹AtMET1 基因瞬時轉(zhuǎn)化的煙草葉片進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)時，外源在12 h 時表達(dá)量最高。本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)AtMET1 基因楊樹葉片在放置于100 μmol·L-1雌二醇培養(yǎng)基上時，外源基因的表達(dá)量在3 h 時達(dá)到最高，這可能是三方面的原因：一是誘導(dǎo)劑濃度不同，本研究依據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果[6]，采用100 μmol·L-1的17-β-雌二醇對轉(zhuǎn)基因楊樹葉片進(jìn)行處理，所用的雌激素濃度是上述研究的2～50 倍，可能導(dǎo)致誘導(dǎo)啟動子響應(yīng)時間提前；二是處理方式不同，本研究對轉(zhuǎn)基因植株的離體葉片進(jìn)行誘導(dǎo)處理，而上述研究是將雌激素加入幼苗培養(yǎng)基中或進(jìn)行葉片涂抹的瞬時表達(dá)；三是處理對象不同，本研究首次在楊樹中采用化學(xué)誘導(dǎo)表達(dá)的方式，不同于擬南芥、煙草等草本植物，可能由于物種的差異導(dǎo)致響應(yīng)時間的不同。后續(xù)研究將在0～3 h 之間進(jìn)行時間細(xì)化處理，看其是否在3 h前就已達(dá)到平臺期。在處理6 h 時，目的基因的表達(dá)降低，其原因可能是AtMET1 基因在楊樹中表達(dá)量達(dá)到一定程度時，與RdDM（RNA-directed DNA methylation）相互作用發(fā)生了轉(zhuǎn)錄基因沉默（TGS，transcriptional gene silencing）[25]，即siRNA（Small interfering RNA）對靶mRNA 產(chǎn)生了降解[26]。隨著誘導(dǎo)時間的延長，目的基因的表達(dá)量逐漸降低，這可能與17-β-雌二醇的降解有關(guān)，Snyder 等[27]研究表明，當(dāng)暴露于290～720 nm 之間的模擬太陽光時，光降解17-β-雌二醇可達(dá)26%。

本研究發(fā)現(xiàn)，XVE 系統(tǒng)在楊樹中對目的基因AtMET1 的調(diào)控強(qiáng)度低于其在煙草中對目的基因的調(diào)控強(qiáng)度[6]，其原因可能是其表達(dá)方式上的差異導(dǎo)致的，在煙草中所采用的是瞬時表達(dá)方式，而本實(shí)驗(yàn)中所采用的是穩(wěn)定表達(dá)方式[28]。此外，本研究通過遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了潮霉素抗性芽648 個，經(jīng)生根篩選及分子檢測最后獲得了18 株轉(zhuǎn)基因植株，遺傳轉(zhuǎn)化效率僅為2.78%，低于以往84K 楊的遺傳轉(zhuǎn)化效率7%[29]。因?yàn)榍捌趯?shí)驗(yàn)已經(jīng)確定了最佳的潮霉素分化選擇壓[4]，假陽性較高不可能是由于分化培養(yǎng)基中潮霉素選擇壓偏低導(dǎo)致的。其原因主要是由于葉盤篩選培養(yǎng)時邊緣上翹導(dǎo)致部分非抗性再生芽的產(chǎn)生，以及轉(zhuǎn)化過程中出現(xiàn)了嵌合體[30]。

本研究將受17-β-雌二醇調(diào)控的XVE 系統(tǒng)及AtMET1 基因成功導(dǎo)入白楊派優(yōu)良品種84K 楊的基因組，通過qRT-PCR 證實(shí)AtMET1 基因能夠在化學(xué)誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)下表達(dá)，并且隨誘導(dǎo)時間的不同而表達(dá)量有很大差異。由于植物不具有類似的激素系統(tǒng)[31]，植物生長環(huán)境下外源基因并不表達(dá)，不會影響植物的正常生長發(fā)育。通過人為17-β-雌二醇處理，能夠嚴(yán)格控制外源基因AtMET1 的表達(dá)，進(jìn)而能夠通過對轉(zhuǎn)基因植株誘導(dǎo)前后基因組甲基化狀況以及表型性狀的對比，排除轉(zhuǎn)基因過程中其他因素干擾所導(dǎo)致的突變[19]，為進(jìn)一步研究MET1 基因在楊樹基因組甲基化調(diào)控方面的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究在前期研究[6]的基礎(chǔ)上，將含有AtMET1基因的載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，通過葉盤法侵染、潮霉素篩選，獲得陽性植株；通過 PCR 擴(kuò)增及DNA 測序，結(jié)果表明，化學(xué)誘導(dǎo)啟動子及目的基因已成功導(dǎo)入84K 楊基因組中，獲得了84K 楊的轉(zhuǎn)AtMET1 基因植株18 株；同時，通過化學(xué)誘導(dǎo)表達(dá)實(shí)驗(yàn)，證明了化學(xué)誘導(dǎo)啟動子在楊樹中能夠有效發(fā)揮作用，并且目的基因的表達(dá)受到17-β-雌二醇的嚴(yán)格控制，最適雌激素處理時間是3 h，但隨著時間的延長效果減弱。為楊樹品種改良以及基因功能分析等奠定了良好的基礎(chǔ)。