袁 聽，覃金蘭，何 珊，熊 翔，孫 健，楊志強(qiáng)，何 勇，田志宏

（1. 長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025；2. 湖北龍旗生物科技有限公司，湖北 江陵 434108）

0 引言

【研究意義】水稻是我國最主要的糧食作物之一，2018年其產(chǎn)量約占我國糧食總產(chǎn)量的三分之一，是保障我國糧食安全的重要作物。然而水稻的生長過程中常使用植物生長調(diào)節(jié)劑。植物生長調(diào)節(jié)劑是模擬植物自身激素的外源化合物，能對植物的生長起調(diào)節(jié)作用。如利用豐產(chǎn)素、三十烷醇、細(xì)胞分裂素促進(jìn)水稻種子發(fā)芽[1-3]；利用多效唑（PP333）、乙烯利防止秧苗陡長、控制旺長[4-5]；利用赤霉素提高水稻結(jié)實率等[6]。植物生長調(diào)節(jié)劑需要嚴(yán)格按照劑量使用，使用量不足起不到應(yīng)有的效果，使用過量又會對植物的生長造成不利影響，嚴(yán)重情況下甚至抑制植物生長。實際生產(chǎn)中存在的種種因素，如氣候條件、施用殘留、人為疏忽等常造成植物生長調(diào)節(jié)劑的過量施用。如何避免植物生長調(diào)節(jié)劑過量使用造成的影響是當(dāng)前亟待解決的問題?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】印度科學(xué)家Verma等[7]首先在沙漠中發(fā)現(xiàn)了印度梨形孢。與叢枝真菌類似，印度梨形孢能廣泛定殖于多種植物的根系，幫助植物從土壤中吸收營養(yǎng)物質(zhì)，抵御不良環(huán)境，提高對病害的抗性，促進(jìn)生長[8-9]。據(jù)統(tǒng)計，200多種植物能與印度梨形孢共生，印度梨形孢對寄主植物具有促進(jìn)生長的作用，如小麥、番茄、小白菜、煙草等[10-14]。印度梨形孢還可以改善宿主的形態(tài)，增強(qiáng)部分植物的次生代謝產(chǎn)物，促進(jìn)植物對氮、磷等礦物質(zhì)的吸收利用[15-18]。同時，有研究表明印度梨形孢對水稻的生長具有促生作用，能提高水稻苗期耐鹽性、抗旱性[19-21]。【本研究切入點】目前，關(guān)于如何解決植物生長調(diào)節(jié)劑過量使用對水稻的影響的研究還比較少，過量使用植物生長調(diào)節(jié)劑，對植物來說形成了逆境，印度梨形孢是否能緩解植物生長調(diào)節(jié)劑過量使用對水稻的影響值得探究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過研究印度梨形孢與水稻共生情況下，植物生長調(diào)節(jié)劑過量使用對水稻的影響，為解決植物生長調(diào)節(jié)劑過量使用的問題提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2,4-D購置于北京索萊寶生物科技有限公司；PP333購置于上海源葉生物科技有限公司；印度梨形孢菌株及供試水稻品種9311，均由長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 水稻種子萌發(fā) 選擇顆粒飽滿的水稻種子，先用70%乙醇浸泡1 min，再用無菌水沖洗3次，最后用0.01%氯化汞溶液消毒10 min，無菌水洗滌5次后，將水稻種子分2份，轉(zhuǎn)入2個已滅菌的培養(yǎng)皿中，加入等量的無菌水，放置于植物生長室萌發(fā)。植物生長室溫度為（26±1）℃，光周期為16 h光照/8 h黑暗。待水稻種子萌發(fā)長出根后，其中一個培養(yǎng)皿中加入10 mL PDB培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d的印度梨形孢菌懸液，另一個培養(yǎng)皿中加入等體積無菌水作對照（表1）。

表1 水稻種子萌發(fā)處理Table1 Treatment of rice seeds germination

1.2.2 印度梨形孢定殖檢測 印度梨形孢與水稻共培養(yǎng)14 d后，隨機(jī)選取10株水稻幼苗，用無菌水沖洗根系，再將根系剪成長度為1 cm的小段，置于10% KOH溶液中過夜，然后用無菌水沖洗3次，1%HCl溶液中浸泡5 min，0.05%臺盼藍(lán)染色5～8 min，無菌水沖冼6～8次，最后在顯微鏡下觀察是否有印度梨形孢定殖。

1.2.3 水稻幼苗的培養(yǎng) 將水稻按照是否接種過P.indica以及施用過量植物生長調(diào)節(jié)劑的條件，設(shè)置成8個處理（表2），每個處理50顆水稻苗。2,4-D施用方式為營養(yǎng)液添加，質(zhì)量濃度為0.5 mg·L-1；多效唑（PP333）施用方式為1 000 mg·L-1溶液，水培第1 d在水稻苗葉面均勻噴施1次。參考文獻(xiàn)[22] 配制國際水稻營養(yǎng)液。用250 mL塑料杯裝滿營養(yǎng)液，利用海綿固定住水稻幼苗，使其浮于液面之上，放置于植物生長室生長，設(shè)置植物生長室溫度為（28±1）℃，光周期為16 h光照/8 h黑暗，培養(yǎng)15 d。

表2 水稻幼苗處理Table2 Rice seedling culture

1.2.4 活性氧（ROS）染色觀察 DAB組織染色檢測過氧化氫，NBT染色檢測超氧陰離子。現(xiàn)配1 mg·mL-1的DAB染色液和0.5 mg·mL-1的NBT染色液；將水培15 d的水稻葉片剪成長1 cm左右，分別置于DAB和NBT染色液中，利用注射器抽真空，待葉片沉降至管底部，于28℃避光染色，DAB染色8 h，NBT染色3 h。然后吸走管中的染色液，再加入80%乙醇，水浴煮沸處理10 min，脫去葉片葉綠素。再次吸出管中的液體，然后加入無水乙醇，置于4℃冰箱，保存4 h以上觀察染色情況。

1.2.5 水稻生物性狀的測定 水培15 d后，分別取10株各組水稻幼苗，測量株高、根長、根數(shù)、根系活力及葉綠素含量，根系活力及葉綠素含量測定方法參照文獻(xiàn)[23]。

1.2.6 幾種抗氧化酶（SOD、POD、CAT）的測定 將0.2 g水培15 d的水稻葉片置于預(yù)冷的研缽中，取2 mL 含 1% PVP 和 0.2 mmol·L-1EDTA 的 50 mmol·L-1PBS（pH=7.8），研磨成漿糊狀，在4℃，1 200 r·min-1條件下離心30 min，取上清液用于酶活性分析。紫外分光光度計測量560、470 、240 nm吸光度，參考文獻(xiàn)[23]計算SOD、POD、CAT酶活性。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法

利用SPSS 19.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，利用Excel 2010作圖，t檢驗檢測各組數(shù)據(jù)的差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 印度梨形孢定殖檢測

用0.05%臺盼藍(lán)染色觀察，檢測印度梨形孢在水稻根部定殖情況。可以在水稻根部成熟細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間看到孢子（圖1），表明印度梨形孢已經(jīng)成功定殖水稻根部。

圖1 印度梨形孢定殖檢測Fig.1 Colonization of P. indica

2.2 水稻生長狀況觀察及相關(guān)生物性狀的測定

2.2.1 印度梨形孢與2,4-D對水稻生長及相關(guān)生物性狀的影響 從圖2可看出，過量使用2,4-D對9311幼苗的生長有顯著影響。未使用2,4-D的情況下，9311幼苗生長狀況良好，根系發(fā)達(dá)，根毛多（處理2、4）；過量的2,4-D抑制了9311幼苗根的發(fā)育，從而使植株發(fā)育不良，生長狀況不佳（處理3）。同樣使用2,4-D的情況下，接種印度梨形孢的水稻與不接種印度梨形孢的水稻相比，株高更高，根系更發(fā)達(dá)（處理1）。

圖2 印度梨形孢與2,4-D處理水稻的生長狀況Fig.2 Growth of rice seedlings treated with P. indica and 2,4-D

據(jù)表3可見，在施用過量2,4-D不接種印度梨形孢的情況下，-Pi、+2,4-D組9311水稻植株較-Pi、-2,4-D組，株高降低39.92%，主根長降低21.69%，根數(shù)降低30.77%，葉綠素含量降低80.89%，根系活力降低40%，二者各性狀值均差異顯著（P＜0.05）；在施用過量2,4-D的情況下，接種印度梨形孢能改善水稻生物性狀，+Pi、+2,4-D組的9311水稻植株與-Pi、+2,4-D組相比，株高增長26.02%（P＜0.05），根長增長17.27%（P＜0.05），根數(shù)增加30.77%（P＜0.05），葉綠素含量增加64.71%（P＜0.05），根系活力提高 43.72%（P＞0.05）；不施加 2,4-D的情況下，+Pi、-2,4-D組同-Pi、-2,4-D組相比，株高、根長、根數(shù)、葉綠素含量等無明顯差異，根系活力+Pi、-2,4-D組比-Pi、-2,4-D組高 1倍（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，在過量施用2,4-D的情況下，印度梨形孢能一定程度上使水稻所受到的抑制作用減少，從而使植株株高、根長、根數(shù)、葉綠素含量和根系活力得到恢復(fù)。

表3 印度梨形孢與2,4-D作用下的水稻相關(guān)生物性狀Table3 Biological traits related to rice under Pi and 2,4-D

2.2.2 印度梨形孢與PP333對水稻生長及相關(guān)生物性狀的影響 從圖3可以看出，施用過量PP333與未施加PP333的9311幼苗相比較，未使用PP333的水稻（處理b、d）具有更高的株高，更好的生長狀況，更發(fā)達(dá)的根系，整體長勢優(yōu)于施用過量PP333的水稻，說明過量的PP333抑制了9311幼苗的生長。施用PP333的情況下，接種了印度梨形孢的水稻（處理a）與未接種印度梨形孢的水稻相比株高更高，生長狀況更好（處理c）。

圖3 印度梨形孢與PP333處理水稻的生長狀況Fig.3 Growth of rice seedlings treated with Pi and PP333

由表4可見，在施用過量PP333不接種印度梨形孢的情況下，-Pi、+PP333組9311水稻植株比-Pi、-PP333組株高降低56.46%，主根長降低13.46%，根數(shù)降低25.02%，葉綠素含量降低38.35%，根系活力提高55.22%，二者的株高、根數(shù)、葉綠素含量差異顯著（P＜0.05）；在施用過量PP333的情況下接種印度梨形孢，+Pi、+PP333組比-Pi、+PP333組9311水稻植株平均株高增加36.79%，根長降低8.89%，根數(shù)降低12%，葉綠素含量降低20.24%，根系活力提高23.64%，是否接種印度梨形孢的兩組水稻僅株高存在顯著差異；不施加PP333的情況下，+Pi、-PP333組同-Pi、-PP333相比，水稻株高增加6.31%，根長增加48.08%，根數(shù)減少21.93%，葉綠素含量提高12.14%，根系活力提高1.69倍。說明在過量施用PP333的情況下，印度梨形孢僅能一定程度上使水稻株高得到恢復(fù)，而PP333與印度梨形孢均對水稻根系活力具有增強(qiáng)作用。

2.3 活性氧（ROS）染色觀察（NBT/DBA）

2.3.1 印度梨形孢與2,4-D處理水稻葉片染色觀察利用NBT染色及DBA染色檢測了水稻葉片ROS的情況，結(jié)果（圖4）顯示相較于-Pi、-2,4-D組（處理4）的情況，接種印度梨形孢以及2,4-D處理的水稻（處理1、2、3）都產(chǎn)生了更多的ROS。

表4 印度梨形孢與PP333作用下的水稻相關(guān)生物性狀Table4 Biological traits related to rice plants treated with Pi+PP333

圖4 印度梨形孢與2,4-D處理水稻葉片（NBT/DBA）染色觀察Fig.4 Stained leaves（NBT/DBA）from rice plants treated with Pi and 2,4-D

2.3.2 印度梨形孢與PP333處理水稻葉片染色觀察利用NBT染色及DBA染色檢測了水稻葉片ROS的情況（圖5），結(jié)果顯示相較于-Pi、-PP333組（處理d）的情況，接種印度梨形孢以及PP333處理的水稻（處理 a、b、c）都產(chǎn)生了更多的 ROS。其中NBT染色檢測超氧陰離子，-Pi、+PP333組顏色最深，含有最多的超氧自由基。

2.4 抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性

2.4.1 印度梨形孢與2,4-D處理的抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性 水稻在不接種印度梨形孢的情況下，施用過量的2,4-D后，-Pi、+2,4-D組SOD活性大幅增加，與-Pi、-2,4-D組相比差異顯著，且POD活性有所上升，CAT活性顯著下降；在施用過量2,4-D的情況下，+Pi、+2,4-D組與-Pi、+2,4-D組相比，SOD、POD活性降低且差異顯著，CAT活性上升；不施加2,4-D的情況下，+Pi、-2,4-D組與-Pi、-2,4-D組相比，SOD、POD、CAT活性均上升，CAT活性差異顯著。2,4-D的過量使用促使水稻葉片中SOD、POD活性升高，CAT活性降低，植物在逆境下可導(dǎo)致活性氧的產(chǎn)生，使得抗氧化酶活性產(chǎn)生變化。印度梨形孢定殖根系后能一定程度上使水稻葉片中SOD、POD、CAT活性恢復(fù)正常，表明印度梨形孢能在一定程度上緩解水稻植株受2,4-D過量使用的影響（圖6）。

圖5 印度梨形孢與PP333處理水稻葉片（NBT/DBA）染色觀察Fig.5 Stained leaves（NBT/DBA）from rice plants treated with Pi and PP333

2.4.2 印度梨形孢與PP333處理的抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性 在不接種印度梨形孢的情況下，使用過量的 PP333后，-Pi、+PP333組 SOD活性升高7倍，與-Pi、-PP333組相比差異顯著，POD、CAT活性也顯著升高；在使用過量PP333的情況下，植株接種定殖印度梨形孢后SOD活性顯著降低，CAT活性有所下降，但是POD活性反而顯著升高；在不使用PP333的情況下，+Pi、-PP333組與-Pi、-PP333組相比，水稻葉片中SOD、CAT活性上升，POD活性下降，差異均不顯著。使用過量PP333的情況下，超氧化物歧化酶SOD活性升高，表明水稻植株產(chǎn)生了大量的活性氧（ROS）；對比在接種印度梨形孢的情況下，SOD活性恢復(fù)正常水平，說明印度梨形孢降低了水稻中超氧自由基的含量（圖7）。

3 討論與結(jié)論

圖6 印度梨形孢與2,4-D作用下水稻葉片中SOD、POD、CAT活性的影響Fig.6 Effect on SOD, POD and CAT activities in leaves of rice plants treated with Pi and 2,4-D

植物需要應(yīng)對持續(xù)變化的環(huán)境，包括經(jīng)常性的不利于植物生長和發(fā)育的脅迫環(huán)境，這些不良脅迫環(huán)境包括生物脅迫和非生物脅迫。水稻生產(chǎn)過程中會因為各種原因需要使用生長調(diào)節(jié)劑，使用過量會對水稻形成脅迫。植物如何感受和響應(yīng)環(huán)境脅迫是一個根本性的生物學(xué)問題，提高植物抗逆性對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和環(huán)境的可持續(xù)性至關(guān)重要[24]。

圖7 印度梨形孢與PP333作用下水稻葉片中SOD、POD、CAT活性的影響Fig.7 Effect on SOD, POD and CAT activities in leaves of rice plants treated with Pi and PP333

質(zhì)量濃度為10～100 mg·L-1的2,4-D溶液短時間浸泡水稻種子，對秧苗生長有一定的促進(jìn)作用，可以增加產(chǎn)量，質(zhì)量濃度為500 mg·L-1以上的2,4-D溶液能控制稻田中雙子葉雜草生長；PP333的適宜施用質(zhì)量濃度為300～500 mg·L-1，可用于防止秧苗陡長、控制旺長[25]。由于2,4-D噴施擴(kuò)散到環(huán)境中不易降解[26]，本研究采用含2,4-D濃度為0.5 mg·L-1的水培液模擬2,4-D持續(xù)殘留；采用1 000 mg·L-1的PP333溶液液面噴施模擬施用過量。多效唑會明顯減緩麻瘋樹幼苗長勢，提高抗氧化酶系酶活[27]。楊梅經(jīng)高質(zhì)量濃度多效唑（900 mg·L-1）處理，后期有一定損傷，在一定時間不同程度提高SOD、POD、CAT和APX酶活性，增加抗壞血酸含量[28]。Islam F等研究了2, 4-D和鹽害等復(fù)合脅迫對作物生理生化與分子信號等的影響，認(rèn)為2,4-D施用可引起氧化損傷，其表現(xiàn)為根系生長減少，ROS產(chǎn)生增加[29-30]。未來抗2, 4-D作物的研發(fā)應(yīng)用將會進(jìn)一步提高2, 4-D在農(nóng)業(yè)中的使用，從而增加2, 4-D的積累和環(huán)境中的殘留[31]。本研究表明，植物生長調(diào)節(jié)劑使用過量會對水稻幼苗的生長造成抑制作用，在過量使用2,4-D或PP333且不接種印度梨形孢的情況下，9311水稻植株受到的抑制現(xiàn)象明顯，植株整體矮化、發(fā)育遲緩、葉綠素含量降低。對比過量使用2,4-D或PP333且接種印度梨形孢的情況下，印度梨形孢能一定程度上使水稻株高、根長、根數(shù)、葉綠素含量、根系活力在過量使用2,4-D的情況下得到恢復(fù)，一定程度上使水稻株高在過量使用PP333的情況下恢復(fù)。對水稻葉片進(jìn)行活性氧檢測，發(fā)現(xiàn)接種印度梨形孢以及2,4-D或PP333處理都會使水稻產(chǎn)生更多的ROS，ROS可以對細(xì)胞中的生物膜造成過氧化損傷，對葉綠體和線粒體等細(xì)胞器造成功能性損傷，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[32]。2,4-D或PP333處理使水稻抗氧化酶活性升高，接種印度梨形孢使水稻抗氧化酶活性恢復(fù)正常水平?？寡趸溉缈箟难?谷胱甘肽循環(huán)酶是植物應(yīng)對氧化損傷的重要機(jī)制，印度梨形孢與植物有益互作對這一機(jī)制產(chǎn)生影響[33]。這些結(jié)果表明，印度梨形孢對植物生長調(diào)節(jié)劑在水稻上過量使用，具有緩解作用，可能通過恢復(fù)活性氧系統(tǒng)平衡，一定程度上減少水稻受植物生長調(diào)節(jié)劑過量使用的抑制作用。

作物在生產(chǎn)過程中會受到各種生物和非生物脅迫，極大限制了作物的產(chǎn)量。通過研究過量使用2,4-D或PP333情況下印度梨形孢對水稻植株生長的影響，初步明確印度梨形孢對植物生長調(diào)節(jié)劑在水稻上過量使用具有緩解作用。但是印度梨形孢對于其他作物或其他種類植物生長調(diào)節(jié)劑是否具有類似效果，以及接種印度梨形孢在植物生長調(diào)節(jié)劑正確使用的情況下是否會出現(xiàn)拮抗或協(xié)同作用，這些都有待進(jìn)一步的研究。