劉 瑩,解軍波,張彥青,*

(1.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院,天津 300134; 2.天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,天津 301617)

多糖是10個(gè)以上的單糖分子由糖苷鍵聚合而形成的大分子化合物,其廣泛存在于動(dòng)物、植物細(xì)菌和真菌中[1]。多糖與人們的飲食息息相關(guān)。大量研究表明多糖具有多種生物活性,例如抗腫瘤[2]、調(diào)節(jié)免疫[3]、降血糖[4]、降血脂[5]等,多糖具有來(lái)源廣泛、無(wú)毒副作用等優(yōu)點(diǎn),已經(jīng)成為新藥研發(fā)和保健食品研發(fā)的熱點(diǎn)。

多糖到底通過(guò)什么樣的途徑發(fā)揮其生物作用還沒(méi)有明確定論。近年來(lái),腸道菌群越來(lái)越引起人們的關(guān)注,腸道菌群是位于腸道的微生物群,與人體的消化吸收等一系列生命活動(dòng)密切相關(guān)[6]。人體自身含有的酶很難消化植物多糖,需要依靠腸道菌將其降解,并且腸道菌對(duì)植物多糖的選擇性消化也同樣影響著腸道微生物中不同菌種的豐富度,改變了腸道菌群的多樣性[7-8]。有研究認(rèn)為腸道菌群是多糖發(fā)揮其藥理作用的重要媒介。目前有研究表明,多糖可以改變其他物質(zhì)的吸收[9]、調(diào)節(jié)體內(nèi)的外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[10]、增強(qiáng)腸的機(jī)械屏障[11]等。酸棗仁是鼠李科植物酸棗的種子[12],其具有抗焦慮、抗抑郁、神經(jīng)保護(hù)、強(qiáng)心、治療失眠等多種藥理作用[13-15]。研究發(fā)現(xiàn)酸棗仁湯能夠調(diào)節(jié)C57BL/6小鼠的腸道菌群,緩解慢性睡眠剝奪導(dǎo)致的肝損傷[16]。酸棗仁多糖(ZSSP)是從酸棗仁中提取出來(lái)的一種多糖,前期研究表明酸棗仁多糖具有明顯的抗炎和調(diào)節(jié)免疫的生物活性,能促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞中NO的釋放,調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)IκB-α和ERK蛋白的磷酸化水平[17]。

本研究旨在探究食用酸棗仁多糖的小鼠腸道菌群培養(yǎng)上清液能否調(diào)節(jié)Caco-2細(xì)胞中外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、緊密連接蛋白和Ⅱ相代謝酶的表達(dá)水平。通過(guò)噻唑藍(lán)法(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)檢測(cè)腸道菌群培養(yǎng)上清液對(duì)細(xì)胞活力的影響,采用免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)Caco-2細(xì)胞中外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和緊密連接蛋白的表達(dá)水平,并用酶聯(lián)免疫檢測(cè)(ELISA)試劑盒測(cè)定Caco-2細(xì)胞中Ⅱ相代謝酶的含量,為探究酸棗仁多糖發(fā)揮藥理作用的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酸棗仁多糖(ZSSP) 本實(shí)驗(yàn)室制備,并采用紫外、紅外和質(zhì)譜等手段對(duì)其進(jìn)行表征[18],其純度大于98%;6～7周齡的雄性健康C57BL/6小鼠(清潔級(jí))20只,體重約為(20±2) g 天津藥物研究院有限公司(許可證號(hào):SYXK津2016-00013)提供,動(dòng)物由標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng),全程自由飲水,環(huán)境溫度為22～24 ℃,適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后開(kāi)始試驗(yàn);標(biāo)準(zhǔn)飼料 南通特洛菲飼料科技有限公司(產(chǎn)品代碼:LAD3001M);全蛋白提取試劑盒 上海生工生物工程股份有限公司;BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒 北京索萊寶科技有限公司;胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、青鏈霉素 美國(guó)Giboc公司;支原體去除劑 Biomedicals公司;3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT) 美國(guó)Sigma公司;P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)、多藥耐藥相關(guān)蛋白2(Multidrug resistance-associated protein2,MRP2)、咬合蛋白(Occludin)、閉合蛋白1(Claudin-1)和β-肌動(dòng)蛋白(β-action)的抗體 美國(guó)Abcam公司;磺酸基轉(zhuǎn)移酶(Sulfotransferase,SULT)和尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶(UDP-glucuronosyltransferase,UGT)的酶聯(lián)免疫檢測(cè)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒 上海泛柯實(shí)業(yè)有限公司;實(shí)驗(yàn)中所用水 均為超純水;化學(xué)試劑 均為分析純。

ZH-2型渦流混合器 北京博鎂基業(yè)科學(xué)儀器技術(shù)有限公司;BP211D型電子分析天平 德國(guó)Sartorius公司;HERAcell240i型二氧化碳培養(yǎng)箱、ECO0.9型超凈工作臺(tái)、902-ULTS型超低溫冰箱 美國(guó)Thermo公司;SpectraMax? M3多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)Molecular Devices公司;MLS-3750型高壓滅菌鍋 日本Sanyo公司;Milli-Q Reference超純水系統(tǒng) 美國(guó)MILLIPORE公司;L8-70M型超速離心機(jī) 美國(guó)Beckman Corporation公司;Tanon-5200全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng) 上海天能科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法 將C57BL/6小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和ZSSP組(n=10),對(duì)照組灌胃超純水,ZSSP組灌胃酸棗仁多糖100 mg/(kg·d-1),每日給藥一次,連續(xù)給藥14 d,在給藥的最后一天,分別取不同組小鼠的糞便,儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱。

1.2.2 腸道菌群培養(yǎng)上清液的制備 用PBS將糞便樣品配制成濃度為20%(w/V)的懸液。在厭氧工作站中用紗布過(guò)濾,將濾液與BCM培養(yǎng)基以1∶7的比例完成接種,在厭氧工作站中37 ℃培養(yǎng)2 h。收集腸道菌群培養(yǎng)液以3000 g離心10 min,然后將上清液通過(guò)0.22 μm的微孔過(guò)濾器過(guò)濾除菌。所得樣品可用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)[19]。

1.2.3 Caco-2細(xì)胞的培養(yǎng) 將Caco-2細(xì)胞接種于含10%FBS(100 U/mL青霉素)的DMEM培養(yǎng)基中并置于恒溫培養(yǎng)箱(37 ℃,5%CO2,相對(duì)濕度90%)中培養(yǎng)。每?jī)商旄鼡Q一次培養(yǎng)液,當(dāng)Caco-2細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底部70%～80%時(shí)(大約4～5 d),處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,用含質(zhì)量體積濃度0.25%的胰蛋白酶消化后,進(jìn)行傳代。

1.2.4 Caco-2細(xì)胞活力值的測(cè)定 用MTT法[20]評(píng)估腸道菌群培養(yǎng)上清液對(duì)Caco-2細(xì)胞活力的影響。將對(duì)數(shù)期細(xì)胞,接種于96孔板(其他孔用PBS填充)。在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后,加入腸道菌群培養(yǎng)上清液(0、1、5、10、20、50、100 μL/mL)孵育24 h;每孔加入20 μL的MTT溶液(5 mg/mL),繼續(xù)培養(yǎng)3.5 h后棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液,隨后加入150 μL DMSO,37 ℃孵育10 min。用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔吸光度(OD)值,計(jì)算細(xì)胞活力值。

細(xì)胞活力值(%)=(實(shí)驗(yàn)組OD值-調(diào)零組OD值)/(對(duì)照組OD值-調(diào)零組OD值)×100

1.2.5 Caco-2細(xì)胞中外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和緊密連接蛋白表達(dá)水平的測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Caco-2細(xì)胞,接種于6孔板,置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱,待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)孔底部80%～90%,用濃度為50 μL/mL的腸道菌群培養(yǎng)上清液孵育24 h。用全蛋白提取試劑盒提取蛋白,BCA試劑盒測(cè)定蛋白含量,使用15%或8%的凝膠通過(guò)SDS-PAGE分離出具有等量總蛋白的樣品,并將其轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。在室溫下用5%的脫脂奶封閉PVDF膜2 h,并在4 ℃下一抗孵育過(guò)夜。一抗分別為P-gp、MRP2、Occludin、Claudin-1和β-action的抗體。然后,將PVDF膜分別與抗鼠IgG-HRP抗體和抗兔IgG-HRP抗體在室溫下孵育2 h。使用Tanon 5200全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)對(duì)蛋白條帶進(jìn)行可視化處理,再使用Quantity-One軟件進(jìn)行分析。

1.2.6 Caco-2細(xì)胞中SULT和UGT含量的測(cè)定 用濃度為50 μL/mL的腸道菌群培養(yǎng)上清液孵育Caco-2細(xì)胞24 h。用全蛋白提取試劑盒提取蛋白,Caco-2細(xì)胞中SULT和UGT的含量測(cè)定均按照ELISA試劑盒中的說(shuō)明操作,之后用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔吸光度(OD)值,計(jì)算Caco-2細(xì)胞中SULT和UGT的含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)5次,數(shù)據(jù)以“Mean±SD”的形式表示,用GraphPad Prism 5.01和SPSS 16.0處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 食用酸棗仁多糖的小鼠腸道菌群培養(yǎng)上清液對(duì)Caco-2細(xì)胞活力值的影響

小鼠灌胃給藥后,其腸道菌群培養(yǎng)上清液對(duì)Caco-2細(xì)胞的活力值的影響如圖1所示。

圖1 腸道菌群培養(yǎng)上清液對(duì)Caco-2細(xì)胞活力值的影響Fig.1 Effect of intestinal flora culture supernatant on the viability of Caco-2 cells注:*:表示與0 μL/mL時(shí)相比差異顯著,P<0.05,**:表示與0 μL/mL時(shí)相比差異極顯著,P<0.01。

由圖1可知,當(dāng)對(duì)照組和ZSSP組的腸道菌群培養(yǎng)上清液的濃度為1～50 μL/mL時(shí),與各組0 μL/mL時(shí)相比,其細(xì)胞活力值沒(méi)有顯著性差異(P>0.05),表明在1～50 μL/mL的濃度范圍內(nèi),菌液對(duì)Caco-2細(xì)胞沒(méi)有毒副作用。但當(dāng)濃度達(dá)到100 μL/mL時(shí),對(duì)照組和ZSSP組的細(xì)胞活力值與各組0 μL/mL時(shí)相比顯著下降(P<0.05或P<0.01),說(shuō)明劑量過(guò)高,會(huì)抑制Caco-2細(xì)胞的生長(zhǎng),產(chǎn)生毒性作用。在安全范圍內(nèi),選擇所考察的最大劑量對(duì)Caco-2細(xì)胞進(jìn)行處理,故選擇50 μL/mL的濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 食用酸棗仁多糖的小鼠腸道菌群培養(yǎng)上清液對(duì)Caco-2細(xì)胞中外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的影響

P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)和多藥耐藥相關(guān)蛋白2(multidrug resistance-associated protein 2,MRP2)都是ATP結(jié)合盒式外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,它們可以利用ATP分解產(chǎn)生的能量進(jìn)行藥物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)[21]。益生菌乳桿菌中的可溶性因子上調(diào)了Caco-2細(xì)胞中的外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)水平[22]。這為本實(shí)驗(yàn)提供了腸道菌調(diào)節(jié)外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)的新思路。

為了探究酸棗仁多糖是否能通過(guò)腸道菌群參與細(xì)胞中外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的調(diào)節(jié),用腸道菌群培養(yǎng)上清液處理Caco-2細(xì)胞。由圖2可知,ZSSP組的腸道菌群培養(yǎng)上清液處理Caco-2細(xì)胞24 h后,細(xì)胞中P-gp、MRP2的表達(dá)水平與對(duì)照組相比顯著降低(P<0.05)。這表明,食用酸棗仁多糖的小鼠腸道菌群培養(yǎng)上清液可以下調(diào)外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在Caco-2細(xì)胞中的表達(dá),酸棗仁多糖可能是通過(guò)腸道菌群介導(dǎo)機(jī)制發(fā)揮其藥理作用。

圖2 50 μL/mL的腸道菌群培養(yǎng)上清液對(duì)Caco-2細(xì)胞中P-gp和MRP2蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effect of 50 μL/mL intestinal flora culture supernatant on P-gp and MRP2 protein expression in Caco-2 cells注:*:表示與對(duì)照組相比差異顯著,P<0.05;圖4同。

2.3 食用酸棗仁多糖的小鼠腸道菌群培養(yǎng)上清液對(duì)Caco-2細(xì)胞中緊密連接蛋白的影響

藥物可以通過(guò)細(xì)胞旁途徑進(jìn)入細(xì)胞,而細(xì)胞旁途徑就是指特定藥物通過(guò)細(xì)胞之間的緊密連接進(jìn)入細(xì)胞間隙而被吸收的過(guò)程,緊密連接是由Occludin、Claudin-1等組成[23]。緊密連接阻止大分子物質(zhì),允許小分子物質(zhì)和離子通過(guò)[24-25]。

由圖3可知,食用酸棗仁多糖的小鼠腸道菌群培養(yǎng)上清液可以微弱的升高Occludin的蛋白表達(dá)水平,但不具備顯著性差異(P>0.05)。而對(duì)于Claudin-1蛋白的表達(dá)來(lái)說(shuō),ZSSP組與對(duì)照組相比有微弱的減少,但同樣不具有顯著性差異(P>0.05)。緊密連接是腸道黏膜屏障的重要組成部分,目前有研究表明益生菌對(duì)腸黏膜屏障中的緊密連接蛋白起到保護(hù)作用[26],這可能是酸棗仁多糖不能通過(guò)腸道菌群介導(dǎo)機(jī)制調(diào)節(jié)緊密連接蛋白表達(dá)的原因。

圖3 50 μL/mL的腸道菌群培養(yǎng)上清液對(duì)Caco-2細(xì)胞中Occludin和Claudin-1蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effect of 50 μL/mL intestinal flora culture supernatant on occludin and claudin-1 protein expression in Caco-2 cells

2.4 食用酸棗仁多糖的小鼠腸道菌群培養(yǎng)上清液對(duì)Caco-2細(xì)胞中SULT和UGT含量的影響

磺酸基轉(zhuǎn)移酶(sulfotransferase,SULT)和尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶(UDP-glucuronosyltransferase,UGT)是人體重要的II相代謝酶,可以進(jìn)行藥物代謝,同時(shí)也可以代謝許多重要的內(nèi)源性物質(zhì)[27-28]。藥物進(jìn)入細(xì)胞后由II相代謝酶轉(zhuǎn)化為相關(guān)的II相代謝產(chǎn)物,然后由外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至腸道內(nèi)腔,從而導(dǎo)致藥物的生物利用度下降[29]。為了探究酸棗仁多糖是否能通過(guò)腸道菌群參與細(xì)胞中SULT和UGT的調(diào)節(jié),用腸道菌群培養(yǎng)上清液處理Caco-2細(xì)胞,結(jié)果如圖4所示。

圖4 50 μL/mL的腸道菌群培養(yǎng)上清液 對(duì)Caco-2細(xì)胞中SULT和UGT的影響Fig.4 Effect of 50 μL/mL intestinal flora culture supernatant on SULT and UGT in Caco-2 cells

圖4A和圖4B分別為尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶(UGT)和磺酸基轉(zhuǎn)移酶(SULT)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。由圖4A可知,ZSSP組的腸道菌群培養(yǎng)上清液與對(duì)照組相比可以顯著升高UGT在Caco-2細(xì)胞中的含量(P<0.05)。由圖4B可知,食用酸棗仁多糖的小鼠腸道菌群培養(yǎng)上清液對(duì)SULT在Caco-2細(xì)胞中的含量沒(méi)有顯著影響(P>0.05)。這表明食用酸棗仁多糖的小鼠腸道菌群培養(yǎng)上清液能增加Caco-2細(xì)胞中尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶的含量,但對(duì)磺酸基轉(zhuǎn)移酶沒(méi)用影響。

3 結(jié)論

由于人類(lèi)自身所產(chǎn)生的酶難以消化大分子的植物多糖,需要腸道中的微生物將其降解,同時(shí)腸道微生物對(duì)植物多糖的選擇性消化也影響著腸道菌群的多樣性。大量研究表明植物多糖通過(guò)腸道菌群介導(dǎo)機(jī)制發(fā)揮藥理作用,如Fan等[30]發(fā)現(xiàn),冬蟲(chóng)夏草多糖能夠通過(guò)調(diào)節(jié)腸道微生物,發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。Zhang等[8]發(fā)現(xiàn),甘草多糖能夠通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群的組成,發(fā)揮抗腫瘤的作用,抑制BALB/c小鼠體內(nèi)的腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。

本研究以Caco-2細(xì)胞為研究對(duì)象,探究了食用酸棗仁多糖的小鼠腸道菌群培養(yǎng)上清液能否影響Caco-2細(xì)胞中外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、緊密連接蛋白的表達(dá)水平和Caco-2細(xì)胞中Ⅱ相代謝酶的含量。通過(guò)MTT法表明,1～50 μL/mL的腸道菌群培養(yǎng)上清液對(duì)Caco-2細(xì)胞無(wú)明顯的毒性作用,選最大濃度50 μL/mL進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。運(yùn)用免疫印跡法探究了Caco-2細(xì)胞中外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和緊密連接蛋白的表達(dá)水平。發(fā)現(xiàn)食用酸棗仁多糖的小鼠腸道菌群培養(yǎng)上清液能顯著下調(diào)Caco-2細(xì)胞中外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P-gp和MRP2的表達(dá)水平(P<0.05),但對(duì)緊密連接蛋白沒(méi)有顯著影響(P>0.05)。運(yùn)用ELISA的方法,探究Caco-2細(xì)胞中Ⅱ相代謝酶的含量,發(fā)現(xiàn)其能顯著上調(diào)UGT的含量(P<0.05),但對(duì)SULT沒(méi)有顯著影響(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,食用酸棗仁多糖的小鼠腸道菌群培養(yǎng)上清液能調(diào)節(jié)Caco-2細(xì)胞中的蛋白表達(dá)。酸棗仁多糖可能通過(guò)腸道菌群的介導(dǎo)機(jī)制發(fā)揮調(diào)節(jié)作用,有可能是酸棗仁多糖經(jīng)腸道菌群降解后,其本身和代謝產(chǎn)物對(duì)Caco-2細(xì)胞進(jìn)行了調(diào)節(jié);也有可能是腸道菌群對(duì)酸棗仁多糖的選擇性消化,改變了腸道菌群的組成,從而影響了Caco-2細(xì)胞中吸收相關(guān)蛋白的表達(dá)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將探究酸棗仁多糖及其代謝產(chǎn)物對(duì)Caco-2細(xì)胞的影響,并探究酸棗仁多糖對(duì)小鼠腸道菌群的組成和短鏈脂肪酸的調(diào)節(jié)作用。對(duì)食用了酸棗仁多糖的C57BL/6小鼠結(jié)腸組織進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)酸棗仁多糖同樣可以影響小鼠結(jié)腸組織中的吸收相關(guān)蛋白的表達(dá),具體結(jié)果將與后續(xù)研究一起,另外撰寫(xiě)一篇文章。

Caco-2細(xì)胞被廣泛地應(yīng)用于藥物吸收的研究,其具有與人小腸上皮細(xì)胞形態(tài)上的相似,具有相同的細(xì)胞極性、緊密連接、Ⅰ相代謝酶和Ⅱ相代謝酶等[31]。大量研究表明,包括II相代謝和外排轉(zhuǎn)運(yùn)在內(nèi)的首過(guò)代謝是導(dǎo)致黃酮類(lèi)化合物生物利用度降低的重要原因。Lu等[32]的研究發(fā)現(xiàn)大豆可溶性多糖可以顯著改善大豆染料木黃酮在小鼠體內(nèi)的吸收,其機(jī)制與大豆可溶性多糖能夠下調(diào)P-gp、MRP1和MRP2的蛋白表達(dá)水平有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)喂食酸棗仁多糖小鼠的腸道菌群培養(yǎng)上清液,能夠下調(diào)P-gp和MRP2的蛋白表達(dá)水平,這為研究酸棗仁多糖提高黃酮類(lèi)化合物在體內(nèi)的吸收和生物利用度,提供了理論基礎(chǔ)。