張瓊瓊,魏 佳,張 健,張 磊,吳 斌,*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學食品科學與藥學學院,新疆烏魯木齊 830052; 2.新疆農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所,新疆烏魯木齊 830091; 3.贛州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所,江西贛州 341000)

無核白葡萄(VitisviniferaL. cvThompsonSeedless)是新疆吐魯番地區(qū)的主栽品種。果實呈橢圓形,黃綠色。因其含大量的糖、有機酸、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)及維生素等多種營養(yǎng)物質(zhì),具有很高的營養(yǎng)和食療價值,深受消費者喜愛。但無核白葡萄皮薄汁多,在采后貯藏中易受到機械損傷和病原菌侵染,貯運不當,會引起果實大量腐爛,造成巨大的經(jīng)濟損失[1]。無核白葡萄果實采后貯藏中出現(xiàn)的問題,可能是由于果實細胞壁在外界環(huán)境的刺激下引起的。

細胞壁反映了細胞形態(tài)的變化,細胞壁物質(zhì)降解及其結(jié)構(gòu)破壞都會導致果實軟化[2]。果蔬采后的貯藏壽命及食用品質(zhì)與其細胞壁組成的變化密切相關(guān)。在貯藏前期,葡萄果實中水分含量較高,原果膠與細胞壁緊密結(jié)合,細胞膨壓較高,果實組織較堅硬。到了后期,果膠酶將原果膠分解成可溶性果膠并在滲透壓作用下進入細胞液,而水分不斷流失,細胞膨壓下降,導致果實軟化[3]。果實細胞壁結(jié)構(gòu)和組分的變化是多種水解酶共同作用的結(jié)果[4-5]。軟化后的果實易受到機械損傷和病原菌侵染,大大縮短貯運時間[6]。因此,分析果實細胞壁在貯藏期間的變化十分必要。

硫化氫(Hydrogen sulfide,H2S)是近年來備受關(guān)注的一種與一氧化氮(Nitric oxide,NO)和一氧化碳(Carbon monoxide,CO)相似的新型氣體信號分子[7]。H2S能夠參與調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育、增強植物生物和非生物抗逆性、延緩植物衰老等多種生理功能[8]。汪偉等[9]發(fā)現(xiàn)H2S處理延長了桃果實的貯藏品質(zhì),延緩了相對電導率的上升和硬度的下降,抑制了果膠酯酶(Pectin esterase,PE)、多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase,PG)活性,從而延緩果實成熟衰老和軟化。H2S還能延緩獼猴桃營養(yǎng)物質(zhì)的降解,保持較低的PG活性,從而延緩果實的成熟衰老進程[10]。H2S處理多采用液體或化學反應方式進行保鮮處理,操作過程比較復雜,不易規(guī)模應用。采用H2S氣體熏蒸方式可以精準控制熏蒸濃度、易規(guī)?；瘧谩Ｈ欢鳫2S氣體熏蒸對采后細胞壁相關(guān)酶活性及其基因在葡萄組織中表達的研究鮮有報道。

因此,本實驗研究了H2S熏蒸對無核白葡萄采后抗病過程中細胞壁代謝及其基因的影響,以期為H2S在果蔬貯藏保鮮中的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

無核白葡萄 2018年7月25日采摘于吐魯番,挑選大小均一、無機械損傷、無病蟲害的葡萄果實,采后立即運往(0±1) ℃實驗室冷庫,預冷24 h；丙酮、乙醇 天津市北聯(lián)精細化學品開發(fā)有限公司;昆布多糖、羧甲基纖維素鈉、3,5-二硝基水楊酸、蝸牛酶、甲殼素 上海源葉生物科技有限公司;羥胺鹽酸 天津市致遠化學試劑有限公司;H2S(氣體純度99.99%) 廣州視源氣體有限公司。

DELTA320分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;SIM-F140ADL制冰機 日本松下電器;UV-2600型分光光度計 日本島津;DW-86L626 80 ℃超低溫冰箱 青島海爾特種電器有限公司;Centrifge 5810 R型高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司;UVITEC Firereadear凝膠成像系統(tǒng) 英國UVITEC Firereadear公司;DYY-6D核酸電泳儀 北京市六一儀器廠;Biometra PCR儀 德國耶拿分析儀器公司;LightcyCler? 96熒光定量儀 羅氏公司;LDZX-50KBS壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理 參考張磊等[11]的方法。將葡萄隨機分成6份,每份約重0.5 kg,置于30 L的熏蒸裝置中。在課題組前期實驗的基礎上,選擇適宜的H2S熏蒸濃度500 μL/L。在常溫下采用500 μL/L H2S熏蒸3 h后取出,每隔24 h熏蒸一次,共熏蒸5次。同時以熏蒸裝置中不充入H2S氣體為對照。每次熏蒸結(jié)束后,將處理后的葡萄果實置于25 ℃、相對濕度(RH)95%條件下貯藏。放置24 h后,每盒隨機選取15顆葡萄進行黑曲霉損傷接種。接種后將葡萄果粒分裝到有6個孔(直徑1 cm)的PE包裝盒中,盒內(nèi)上下襯吸水紙,密閉后套上保鮮袋置于25 ℃下貯藏6 d(果實在第6 d腐爛嚴重,故取樣至第5 d),每24 h觀測果粒的病情指數(shù)和病斑直徑。同時避開果實病斑,取健康果肉樣品,切碎混勻呈塊狀,用液氮速凍并置于-80 ℃保存待測,每處理重復3次,取平均值。

1.2.2 病情指數(shù)和病斑直徑的測定 果粒的病情指數(shù)參照吳斌[12]的方法。果粒的病斑直徑使用游標卡尺進行十字交叉法測定。

1.2.3 可溶性果膠、原果膠含量的測定 果肉中可溶性果膠含量、原果膠含量的測定參照硫酸咔唑比色法[13]?？扇苄怨z的提取:取0.5 g樣品置于研缽中,向其加入乙醇(25 mL 95%),研磨成勻漿,轉(zhuǎn)入離心管。再用沸水浴加熱30 min,取出冷卻至室溫,離心(8000 r/min 15 min),倒去上清液,保留沉淀物。向其加入20 mL蒸餾水,在50 ℃水浴中放置30 min,溶解果膠。待其取出冷卻至室溫后,8000 r/min離心15 min,將上清液移入100 mL容量瓶中,用少量蒸餾水洗滌沉淀,離心后,轉(zhuǎn)入到容量瓶中,加蒸餾水至刻度,為可溶性果膠。原果膠的提取:向提取可溶性果膠后,保留在離心管的沉淀物中,加入25 mL 0.5 mol/L硫酸溶液,在沸水浴中加熱1 h,水解原果膠。加熱到時間,取出冷卻至室溫后,在8000 r/min條件下離心15 min,將上清液移入100 mL容量瓶中,并用蒸餾水定容至刻度。反應體系包括:1.0 mL提取液、6.0 mL濃硫酸、0.2 mL 0.15%咔唑-乙醇溶液。根據(jù)溶液吸光度值,在標準曲線上查出相應的半乳糖醛酸微克數(shù),按以下公式計算果蔬組織中果膠含量:

式中:C:從標準曲線查得半乳糖醛酸量,μg;V:樣品提取液總體積,mL;Vs:測定時所取樣品提取液體積,mL;W:樣品重量,g。

1.2.4 果膠酶、纖維素酶活性的測定 參照曹建康等[13]的方法。果膠酶的測定:隨機稱取5 g樣品,加入20 mL經(jīng)預冷的95%乙醇,在冰浴條件下研磨勻漿。轉(zhuǎn)移到離心管中,低溫放置10 min,在4 ℃、12000×g離心20 min。保留沉淀物,向其再加入10 mL預冷的80%乙醇,振蕩,低溫放置10 min,然后在相同條件下離心。再倒去上清液,向沉淀物中加入5 mL 經(jīng)預冷的提取緩沖液,于4 ℃放置提取20 min,再經(jīng)過離心后收集上清液即為酶提取液。反應體系包括:1.0 mL 50 mmol/L、醋酸鈉緩沖液(pH5.5),0.5 mL 1%多聚半乳糖醛酸溶液,0.5 mL酶提取液和1.5 mL 3,5-二硝基水楊酸試劑。然后測定反應混合液在540 nm處的OD值。

表2 無核白葡萄抗病酶相關(guān)基因引物序列Table 2 Primer sequences of disease-free enzyme-related genes in grape

纖維素酶的提取方法同果膠酶,反應體系包括:1.5 mL 1% CMC溶液,0.5 mL酶提取液,1.5 mL 3,5-二硝基水楊酸試劑。然后測定反應混合液在540 nm處的OD值。纖維素酶活性以每小時每克鮮重(FW)果蔬組織樣品在37 ℃催化羧甲基纖維素水解形成還原糖的微克數(shù)表示,即μg·h-1·g-1FW。

1.2.5β-1,3葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶活性的測定β-1,3葡聚糖酶參照Mauch等[14]的方法,略有改動。β-1,3葡聚糖酶的測定:總反應液體積為250 μL:酶溶液、0.5 mg昆布多糖、5 μmol醋酸鈉緩沖液(pH5.5)和50 μg牛血清白蛋白。在37 ℃保溫20 min后,測定已釋放的還原糖量。

幾丁質(zhì)酶的測定:參照曹建康等[13]的方法。結(jié)果以每秒鐘每克鮮重樣品中酶分解膠狀幾丁質(zhì)產(chǎn)生1×10-9mol N-乙酰葡萄糖胺為一個幾丁質(zhì)酶活性單位(U),U=1×10-9mol·s-1·g-1FW表示。

1.2.6 相對電導率的測定 參照許靜等[15]的方法并修改。選取大小一致的果粒60 g(±0.5 g),放在500 mL燒杯中,往其中加200 mL蒸餾水,在常溫下浸泡12 h,用電導儀測定電導率值P0;然后沸水浴加熱30 min,冷卻至室溫后,測定總電導率值P1。相對電導率(%)=(P0/P1)×100。

1.2.7 相關(guān)基因的表達分析

1.2.7.1 葡萄總RNA的提取 無核白葡萄組織部位中總RNA的提取參考Zhang等[16]和Zou等[17]的方法,略有改動。

1.2.7.2 瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 取8 μL RNA溶液加入2 μL 6×loading buffer,混勻。點入1.0%瓊脂糖凝膠中,在120 V,25 min條件下鑒定RNA的完整性。

1.2.7.3 總RNA的完整性檢測 取1 μL RNA溶液稀釋50倍,置于核酸蛋白測定儀中,分別測定RNA在230、260和280 nm處的吸光值。

1.2.7.4 第一鏈cDNA的合成 a.將提取的葡萄果肉RNA作為模板,使用天根公司的“TIANScript RT Kit”試劑盒合成第一鏈cDNA。方法如表1:

表1 反轉(zhuǎn)錄體系Table 1 Reverse transcription system

b.42 ℃反應50 min,轉(zhuǎn)入95 ℃水浴5 min終止反應。將合成的第一鏈cDNA于-80 ℃保存。

1.2.7.5 葡萄抗病酶相關(guān)基因cDNA片段擴增 采用DNAman 6.0根據(jù)GeneBank中上傳的VvGLU、VvCHT、VvPR-4、氨基酸保守序列設計引物,送往生物公司合成。所用引物均用DEPC-H2O溶解,稀釋至10 mmol/L。

PCR擴增體系如表3:

表3 PCR擴增反應體系Table 3 PCR amplification reaction system

1.2.7.6 葡萄抗病酶相關(guān)基因熒光定量表達 以適當稀釋后的各貯藏天數(shù)葡萄組織cDNA為模板,具體反應體系如表4:

表4 qPCR反應體系Table 4 qPCR reaction system

點樣時,每組3個平行、3個對照。每個體系反應完成后得到一個Ct值,目的基因相對于參照基因Actin的轉(zhuǎn)錄表達量,計算公式為X=2-ΔΔCt[18]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Sigma Plot 12.0軟件作圖,SPSS 19.5進行數(shù)據(jù)方差分析并利用Duncan法進行均值比較。P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 H2S處理對葡萄果實病斑直徑和病情指數(shù)的影響

如圖1A所示,在貯藏過程中,H2S處理組果實的病斑直徑始終低于對照果實。在25 ℃條件下貯藏至第3 d,H2S處理組和對照組葡萄果實的病斑直徑分別為11.0和13.4 mm(P<0.05)。說明H2S處理可顯著抑制果實病斑的擴大。如圖1B所示,在貯藏期間,葡萄果實的病情指數(shù)呈不斷上升趨勢。H2S處理的病情指數(shù)始終低于對照組。在25 ℃條件下貯藏6 d后,H2S處理組果實病情指數(shù)為0.79,顯著低于對照組的0.83(P<0.05)。說明H2S處理能夠有效抑制病情指數(shù)的上升?？赡苁怯捎贖2S維持了細胞壁的完整性,從而增強其抗性。

圖1 H2S處理對葡萄病斑直徑(A)和病情指數(shù)(B)的影響Fig.1 Effect of H2S treatment on grape lesion diameter(A)and disease index(B)注:*表示相同貯藏時間下差異顯著(P<0.05),**表示極顯著(P<0.01)。圖2～圖6同。

2.2 H2S處理對葡萄果實可溶性果膠和原果膠含量的影響

在貯藏過程中,細胞壁酶可以水解果膠和細胞壁物質(zhì),生成水溶性果膠,導致果實硬度下降[19]。果實軟化過程中,會出現(xiàn)原果膠降解的現(xiàn)象,從而引起果實軟化[20]。由圖2A可知,整個貯藏過程中,H2S處理組可溶性果膠含量始終低于對照組,H2S處理組第一次高峰出現(xiàn)在貯藏第1 d,隨后可溶性果膠含量快速下降。在貯藏3 d時,對照組和H2S處理組可溶性果膠含量都達到峰值。同時,對照組果實中的可溶性果膠含量比H2S處理組高23.53%(P<0.05)。因此,H2S處理可以加速可溶性果膠的水解。由圖2B可知,隨著貯藏時間的延長,葡萄果實中原果膠含量總體呈先上升后下降趨勢。對照組在整個貯藏期間,葡萄果實原果膠含量基本保持穩(wěn)定,而H2S處理組在貯藏初期,葡萄果實中原果膠含量迅速增加,隨后呈下降趨勢。在整個貯藏期間,H2S處理組原果膠的含量始終高于對照組,在貯藏至1～2 d時,H2S處理組的原果膠含量分別是對照果實的1.41和1.52倍。說明H2S處理可以延緩葡萄果實貯藏過程中原果膠含量的下降,并使其維持較高狀態(tài)。與張群等[21]對葡萄的研究結(jié)果一致。

圖2 H2S處理對葡萄可溶性果膠(A)和原果膠含量(B)的影響Fig.2 Effect of H2S treatment on the content of soluble pectin(A)and raw pectin(B)in grape

2.3 H2S處理對葡萄果實果膠酶、纖維素酶活性的影響

由圖3A可知,在貯藏期間,對照組果膠酶活性呈先上升后下降的趨勢,而H2S處理組果膠酶活性基本保持穩(wěn)定。與朱丹實等[22]在巨峰葡萄上的研究結(jié)果相同。在第2 d時,對照組果膠酶活性快速上升,而H2S處理組酶活性略微下降。此時對照組酶活性為H2S處理組的3.21倍(P<0.01)。在整個貯藏期間,H2S處理組果膠酶活性始終低于對照組,表明H2S處理可以抑制葡萄果實果膠酶活性的上升。

圖3 H2S處理對葡萄果膠酶(A)和纖維素酶活性(B)的影響Fig.3 Effect of H2S treatment on grape pectinase(A)and cellulase activities(B)

纖維素酶(Cx)在不同種類果實的軟化過程中起著不同的作用。研究發(fā)現(xiàn)在青梅[23]等果實軟化中起主要作用。王秀[24]在對藍莓采后細胞壁代謝酶活性變化與軟化關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn),Cx是引起藍莓果實軟化的關(guān)鍵酶,對其貯藏后期軟化有促進作用。如圖3B所示:貯藏前2 d,H2S處理組纖維素酶活性極顯著高于對照組(P<0.01),隨后,對照組纖維素酶活性開始上升,而H2S處理組酶活性迅速下降。貯藏至第3 d時,對照組和H2S處理組纖維素酶活性分別為2339.96和1095.02 μg·h-1·g-1,對照組酶活性是H2S處理組的2.14倍(P<0.01)。第5 d時,H2S處理組纖維素酶活性仍高于對照組,表明H2S處理對葡萄纖維素酶活性的抑制作用不明顯。可能是由于病原菌能大量產(chǎn)細胞壁降解酶,一經(jīng)侵染葡萄就能快速降解葡萄細胞壁,破環(huán)葡萄防御能力,造成葡萄腐爛。

2.4 H2S處理對葡萄果實β-1,3-葡聚糖和幾丁質(zhì)酶活性的影響

β-1,3-葡聚糖酶(GLU)和幾丁質(zhì)酶(CHT)能水解病原菌細胞壁中的β-1,3-葡聚糖和幾丁質(zhì),從而破壞病原菌細胞壁,殺死病原菌,防止對植物體的侵染能力[25]。如圖4A所示,在貯藏期間,對照組β-1,3-葡聚糖酶(GLU)活性變化較為平穩(wěn)。H2S處理組GLU活性在接菌后第1 d達到最高峰55.89 mol·s-1·g-1,是對照組的4.12倍(P<0.01),隨后H2S處理組GLU活性迅速下降,至病害觀察后期,H2S處理組GLU活性依然遠遠高出對照。整體趨勢與黃銳[26]在熱處理對葡萄的研究結(jié)果相似。如圖4B所示,各處理幾丁質(zhì)酶(CHT)活性均呈先升高后降低的趨勢,2 d達到最大值,其中H2S處理組的最大值為15.31 mol·s-1·g-1,是對照的1.68倍(P<0.01)。說明H2S處理可提高葡萄果實CHT的活性。整體趨勢與張暢[27]對桃、王鳳超[28]對無核白葡萄的研究結(jié)果相同。

圖4 H2S處理對葡萄GLU(A)和CHT(B)活性的影響Fig.4 Effect of H2S treatment on grape GLU(A)activity and CHT(B)activity

2.5 H2S處理對葡萄果實相對電導率的影響

相對電導率的高低表示果肉組織膜透性的大小[29]。隨著果實的軟化,細胞膜透性擴大。由圖5可知,在整個貯藏過程中,H2S處理組的相對電導率始終低于對照組,在第4～5 d時,對照組相對電導率分別是H2S處理組的1.16和1.26倍。試驗結(jié)果與汪偉[9]對桃,許靜等[15]用氧化亞氮(N2O)在木納格葡萄中的研究結(jié)果相同。說明H2S可能在一定程度上抑制了果實的自身氧化,避免細胞的自我損傷,減少了細胞膜的離子滲透,從而保護了細胞膜的完整性。

圖5 H2S處理對葡萄相對電導率的影響Fig.5 Effect of H2S treatment on relative conductivity of grapes

2.6 H2S處理對葡萄果實VvGLU、VvCHT、VvPR-4基因熒光表達量的影響

如圖6A所示,果實熏蒸處理后,VvGLU基因相對表達量開始下降。貯藏至1 d時,H2S處理組VvGLU基因的相對表達量極顯著高于對照組(P<0.01)。貯藏至2～3 d時,對照組VvGLU基因的相對表達量與H2S處理組無明顯差異。貯藏至4 d時,對照組VvGLU基因的相對表達量高于H2S處理組?？梢娫?～4 d,H2S對葡萄GLU基因調(diào)控效果并不明顯。但在貯藏至第5 d時,H2S處理組GLU基因相對表達量是對照組的1.6倍(P<0.01)。如圖6B所示,經(jīng)H2S處理后的葡萄果實中VvCHT基因上調(diào)表達。貯藏1～3 d時,H2S處理組VvCHT基因的相對表達量顯著高于對照組(P<0.05)。但貯藏至第4、5 d時,對照組VvCHT基因的相對表達量顯著高于H2S處理組(P<0.05)。說明后期H2S對葡萄VvCHT基因調(diào)控效果并不明顯。如圖6C所示,整個貯藏期間,H2S處理組VvPR-4基因的表達量始終高于對照組。貯藏至第1、3、5 d時,H2S處理組VvPR-4基因的表達量極顯著高于對照組(P<0.01)。說明H2S處理誘導了VvPR-4基因的上調(diào)表達。以上試驗結(jié)果與韋瑩瑩[20]發(fā)現(xiàn)綠熟期櫻桃番茄中PR蛋白基因LeCHT和LeGLU的上調(diào)表達,提高了果實抗病防御酶活性,從而增強果實的抗病性研究結(jié)果相類似。

圖6 H2S處理對葡萄VvGLU(A)、VvCHT(B)、VvPR-4(C) 基因熒光表達量的影響Fig.6 Effect of H2S treatment on the fluorescence expression of VvGLU(A),VvCHT(B)and VvPR-4(C)genes in grape

3 結(jié)論

在25 ℃的溫度條件下,采用500 μL/L H2S對無核白葡萄間歇熏蒸,可以加速可溶性果膠的水解、抑制原果膠含量、β-1,3葡聚糖酶活性、幾丁質(zhì)酶活性的下降,抑制病斑直徑的擴大、病情指數(shù)、果膠酶活性、相對電導率的上升,誘導VvPR-4、VvGLU基因的上調(diào)表達;同時誘導前期VvCHT基因的上調(diào)表達。通過以上研究表明,500 μL/L H2S熏蒸處理有利于保持無核白葡萄的細胞壁的完整性,提高其抗病性,從而延長了采后的貯藏期,為H2S在果蔬貯藏保鮮中的應用提供了一定的理論依據(jù)。然而H2S處理對無核白葡萄采后抗病的分子機制需進一步研究。