何鴻舉,蔣圣啟,馬漢軍,2,王 慧,陳復(fù)生,康壯麗,潘潤淑,朱明明,趙圣明,王正榮

(1.河南科技學(xué)院食品學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453003; 2.河南科技學(xué)院博士后研發(fā)基地,河南新鄉(xiāng) 453003; 3.河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院,河南鄭州450001)

我國眾多肉類食品中,雞肉占據(jù)重要地位,現(xiàn)已成為百姓餐桌上的主要食品之一[1]。因含有多種營養(yǎng)素、肉質(zhì)細(xì)嫩且更易被人體消化吸收,雞肉逐漸成為我國居民的主要選擇之一[2-3]。據(jù)統(tǒng)計(jì),目前我國雞肉消費(fèi)量占到總禽肉消費(fèi)量的90%以上,且在未來幾年雞肉的消費(fèi)量還有逐年增加的趨勢[4]。目前市場上流通的雞肉主要有熱鮮肉、冷鮮肉和冷凍肉[5]。隨著我國居民生活水平的不斷提高,消費(fèi)者的雞肉消費(fèi)理念也在逐漸改變,冷鮮雞肉因能夠最大限度地保持其質(zhì)地柔軟、彈性好、口感鮮美和營養(yǎng)價(jià)值,在我國大中城市已成為生鮮肉消費(fèi)的主流。然而,冷鮮雞肉在冷藏過程中由于水分含量多、營養(yǎng)物質(zhì)豐富,容易受到一些嗜冷菌如熱死環(huán)絲菌、假單胞菌、腸桿菌、乳酸菌、莫拉氏菌和不動(dòng)桿菌等的污染而引發(fā)肉品腐敗變質(zhì),從而導(dǎo)致其品質(zhì)下降,是新鮮度降低的最主要原因。熱殺索絲菌屬于兼性厭氧的革蘭氏陽性桿菌,它在低氧和4 ℃的條件下能較快的生長繁殖,因此是引起冷卻肉腐敗的主要微生物[6-7]。熱殺索絲菌占冷卻雞肉初始菌相的13.3%,在0～4 ℃冷藏溫度下導(dǎo)致冷藏雞肉和雞肉制品腐敗變質(zhì)的主要腐敗菌之一[8-9]。Li等[10]研究發(fā)現(xiàn),熱殺索絲菌還是冷卻豬肉托盤包裝后導(dǎo)致其腐敗變質(zhì)的主要微生物。國外學(xué)者Leroi等[11]和Russo等[12]已經(jīng)將熱殺索絲菌的某一特定菌株建立了生長預(yù)測模型。國內(nèi)學(xué)者高磊等[13]對冷卻雞肉中熱殺索絲菌進(jìn)行了分離、鑒定并對致腐能力進(jìn)行了評價(jià)。劉超群等[14]建立并且驗(yàn)證了冷鮮豬肉中熱殺索絲菌生長動(dòng)力預(yù)測模型,判定系數(shù)R2的值達(dá)到了0.99 以上。及時(shí)準(zhǔn)確檢測熱殺索絲菌,有針對性地對其加以控制,可促進(jìn)肉品新鮮度,對延長貨架期具有直接意義。目前,熱殺索絲菌檢測常用的方法有平板計(jì)數(shù)法,分子生物學(xué)法,免疫學(xué)法等,盡管這些方法結(jié)果可靠,但都存在操作繁瑣、需要破壞原材料、檢測時(shí)間長、效率低下、難實(shí)現(xiàn)批量檢測等缺點(diǎn)。隨著冷鮮肉消費(fèi)量的不斷增加,以及消費(fèi)者對新鮮肉品的強(qiáng)烈需求,迫切需要研發(fā)新技術(shù)以實(shí)現(xiàn)對冷鮮雞肉熱殺索絲菌的快速無損檢測。

高光譜成像技術(shù)(Hyperspectral imaging,HSI)作為一種新興的無損檢測技術(shù),近年來在食品品質(zhì)方面的研究備受關(guān)注。與傳統(tǒng)的光譜技術(shù)相比,HSI技術(shù)具有高分辨率,其光譜精度可達(dá)2～3 nm,不僅能反應(yīng)樣品光譜信息的細(xì)微變化,還可提供更多與試驗(yàn)樣品相關(guān)的信息[15]。目前,HSI技術(shù)在雞肉微生物方面的研究已有報(bào)道,如Feng和Ye等[16-17]分別采用HSI快速預(yù)測新鮮雞肉的總細(xì)菌含量(TVC),經(jīng)光譜數(shù)據(jù)分析,可得雞肉TVC的預(yù)測相關(guān)系數(shù)分別為0.96和0.83;Feng等[18]采用近紅外HSI對雞肉中的腸桿菌科進(jìn)行了研究,其所得雞肉腸桿菌科預(yù)測模型的相關(guān)系數(shù)為0.93,其結(jié)果較好。然而,作為冷鮮雞肉儲(chǔ)藏過程中的主要腐敗菌之一的熱殺索絲菌[19-20],目前采用近紅外高光譜技術(shù)對其在雞肉中檢測的相關(guān)報(bào)道較少,故本實(shí)驗(yàn)以冷鮮雞肉為研究對象并基于高光譜成像技術(shù)的快速優(yōu)勢,通過挖掘光譜數(shù)據(jù)和冷鮮雞肉中熱殺索絲菌之間的內(nèi)在相關(guān)性,構(gòu)建一種快速定量檢測熱殺索絲菌的方法,為改善甚至將來代替常規(guī)檢測手段提供數(shù)據(jù)支撐和方法借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冷鮮雞胸肉 河南眾品食業(yè)股份有限公司;CM881熱殺索絲菌培養(yǎng)基 英國Oxoid公司;CM0509緩沖蛋白胨水 英國Oxoid公司;80% NaCl溶液 實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)配;無菌蒸餾水 實(shí)驗(yàn)室自制;超純水 實(shí)驗(yàn)室自制。

HSI-eNIR-XC130型推掃式高光譜成像系統(tǒng) 臺(tái)灣五鈴光電科技有限公司;The Unscrambler 9.7建模軟件 挪威CAMO公司;Matlab程序開發(fā)軟件包 美國Mathworks公司;20040081型Haier冰箱 中國海爾公司;SW-CJ-1D雙人單面凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司;DHP-9902恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;KQ-100DB型數(shù)控超聲波清洗器 江蘇昆山市超聲儀器有限公司;VORTEX-6振蕩器 江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司;WT5003CH型玻璃罩精密天平 常州萬泰天平儀器有限公司;Ultra class UV plus超純水儀 德國SG公司;HV-85全自動(dòng)高壓滅菌鍋 日本Hirayama公司;BF240微生物培養(yǎng)箱 德國Binder公司;Scientz-04拍打式均質(zhì)機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的預(yù)處理 由河南眾品食業(yè)股份有限公司提供的新鮮的雞胸肉(長度(16±1.5) cm,寬度(11±1.5) cm)置于冷藏箱內(nèi)運(yùn)至食品學(xué)院肉品實(shí)驗(yàn)室,剔除表面肌膜并將整塊雞胸肉分割成3.0 cm×3.0 cm×1.0 cm(長×寬×高)的小塊(約10 g),共獲得127塊樣品;將樣品分裝7份至一次性帶蓋的塑料盒內(nèi)并貼上標(biāo)簽,置于4 ℃的冰箱內(nèi),分別儲(chǔ)藏1、2、3、4、5、6、7 d,每天取出若干樣本,進(jìn)行光譜數(shù)據(jù)的采集及樣品中熱殺索絲菌含量的測定。

1.2.2 高光譜數(shù)據(jù)采集 光譜數(shù)據(jù)采集之前,需從4 ℃冰箱內(nèi)取若干待測樣品,并將其置于室溫下待其恢復(fù)至室溫,同時(shí)將高光譜成像系統(tǒng)的光源提前打開進(jìn)行預(yù)熱,待其穩(wěn)定后方可對參數(shù)進(jìn)行設(shè)置,即曝光時(shí)間為4.65 ms,掃描速度為6.54 mm/s時(shí)儀器狀態(tài)最佳。具體高光譜設(shè)置參數(shù)方法參考王慧等[21]研究。為降低相機(jī)暗電流和室內(nèi)照明對樣品圖像采集過程中所帶來的影響,需對原始圖像進(jìn)行黑白校正,故先采集黑白板的圖像后,方可對樣品進(jìn)行掃描試驗(yàn),其檢測波長范圍為900～1699 nm。按如下公式進(jìn)行校正[21]:

式(1)

式中,R-校正后的圖像;R0-原始高光譜圖像;RB-黑板圖像,其反射率為0%;RW-白板圖像,其反射率為99.9%。

1.2.3 熱殺索絲菌的檢測 高光譜圖像采集完畢后,立即測定肉樣中的熱殺索絲菌菌落總數(shù)。利用平板培養(yǎng)法測定[22],具體操作為:將每個(gè)10 g樣品置于無菌袋中,加入90 mL蛋白胨緩沖液(0.1%蛋白胨+0.85% NaCl),使用拍打式均質(zhì)機(jī)將樣品與緩沖液混合均勻,獲得熱殺索絲菌懸液,然后梯度稀釋,依次取1 mL菌懸液加入9 mL蛋白胨緩沖液。最后取0.1 mL菌懸液涂在熱殺索絲菌培養(yǎng)基平板上,然后將平板倒置,于25 ℃下培養(yǎng)48 h后,取出,選擇菌落數(shù)在30～300個(gè)之間的平板,取其對數(shù)值(lg CFU/g)計(jì)數(shù)。本研究中記錄的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)為每g冷鮮雞胸肉中所含的熱殺索絲菌。

1.2.4 光譜提取及預(yù)處理 高光譜成像系統(tǒng)在光譜信息采集的過程中會(huì)受到儀器自身噪聲以及外界環(huán)境的影響,因此獲取的光譜數(shù)據(jù)信息中既含有樣本本身的信息,同時(shí)還包含一些無關(guān)樣本的噪聲信息等。這些無關(guān)信息的存在會(huì)對模型構(gòu)建產(chǎn)生很大的影響。因此,需要對原始光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理,以減少外界環(huán)境以及系統(tǒng)噪聲的影響,從而獲取高性價(jià)比的光譜數(shù)據(jù),以提高預(yù)測模型的精度和穩(wěn)健性。本試驗(yàn)主要使用多元散射校正(Multiplicative Scatter Correction,MSC)、基線校正(Baseline Correction,BC)和標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量校正(Standard Normal Variable Correction,SNV)三種方法對原始光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理。其中,MSC法是對每一條光譜的散射進(jìn)行校正,以獲取較理想的光譜信息[23-24];BC法可以明顯抑制基線漂移的現(xiàn)象,并改善信號質(zhì)量[25];SNV法的基本原理是將每條光譜的波長點(diǎn)反射吸光度值看作正態(tài)分布,并將原始光譜吸光度值減去該光譜平均吸光度值,最后除去該光譜吸光度值的標(biāo)準(zhǔn)偏差[26-27]。

1.2.5 模型的構(gòu)建及評價(jià) 偏最小二乘(Partial Least Squares,PLS)算法是由伍德和阿巴諾等在1983年首次提出的一種新型多元數(shù)據(jù)分析方法,它是通過最小化誤差的平方和找到一組數(shù)據(jù)的最佳函數(shù)匹配,用最簡的方法求得一些絕對不可知的真值,而令誤差平方之和為最小。本試驗(yàn)中將熱殺索絲菌參考值作為因變量,將全波段的波長作為自變量,通過PLS回歸算法來構(gòu)建預(yù)測冷鮮雞肉中熱殺索絲菌含量的PLS預(yù)測模型。

PLS模型效果評價(jià)使用相關(guān)系數(shù)(R)、校正誤差(Root Mean Square Error of Calibration,RMSEC)、內(nèi)部交叉驗(yàn)證均方根誤差(Root Mean Square Error of Cross Validation,RMSECV)和外部預(yù)測均方根誤差(Root Mean Square Error of Prediction,RMSEP)等指標(biāo)[28]。其中用R與1的接近程度來表示模型的精度,用RMSEC、RMSECV、RMSEP與0的接近程度來反映模型的穩(wěn)定性[29]。

1.2.6 最優(yōu)波長的選擇與模型優(yōu)化 本試驗(yàn)中獲得的全波段光譜在900～1699 nm波長范圍內(nèi),其中包含485個(gè)波長,若采用這485個(gè)波長作為建模的輸入變量,則存在大量的冗余信息,需采用合適方法選取最優(yōu)波長,剔除無用信息以減少數(shù)據(jù)計(jì)算量,從而提高模型的構(gòu)建效率和精度。本試驗(yàn)采用PLS-β系數(shù)法和逐步回歸法(Stepwise)篩選最優(yōu)波長。PLS-β法是在高光譜領(lǐng)域應(yīng)用最為廣泛的一種特征波長提取方法,來源于PLS建模過程[30]。Stepwise是多元線性回歸法中選擇特征波長的一種常用數(shù)學(xué)方法,即利用逐步回歸法按一定顯著水平篩選出統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)顯著的波長。續(xù)投影算法(Successive Projections Algorithm,SPA)是一種逐步循環(huán)的變量選擇方法,可以將有效的信息從大量的光譜數(shù)據(jù)中篩選出來,找到光譜變量之間共線性最小的特征波長,優(yōu)化建模條件[31]。將獲取的特征波長作為輸入變量,進(jìn)行全波段PLS回歸模型(F-PLS)優(yōu)化,建立最優(yōu)波長PLS模型。此外,當(dāng)輸入變量個(gè)數(shù)小于樣本個(gè)數(shù)時(shí),還可使用多元線性回歸(Multiple Linear Regression,MLR)法建立預(yù)測建模[32]。將經(jīng)PLS-β、Stepwise和SPA三種方法所提取的特征波長優(yōu)化F-PLS模型,并比較所建預(yù)測模型的精度和性能。

1.3 數(shù)據(jù)處理

PLS-β法在軟件Unscrambler 9.7中進(jìn)行,Stepwise和SPA操作在MATLAB2016a中進(jìn)行,而模型構(gòu)建使用化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件Unscrambler 9.7完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱殺索絲菌含量

實(shí)驗(yàn)樣品的熱殺索絲菌的測量結(jié)果如表1所示。將所有樣品的測量值依照從小到大排序,按每四個(gè)樣品中隨機(jī)取一個(gè)樣品(1/4)選入預(yù)測集,剩余樣品(3/4)選入校正集。

表1 雞肉熱殺索絲菌測量值的統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 1 Statistical results of Brochothrix thermosphacta values in chicken

2.2 雞肉樣品光譜特征

使用HSI-eNIR-XC130型推掃式高光譜成像系統(tǒng)自帶軟件HSI Analyzer軟件進(jìn)行高光譜圖像校正和光譜信息提取。利用HSI Analyzer軟件選取感興趣區(qū)(Region of interest,ROI),感興趣區(qū)域的大小為3 cm×3 cm,像素為640×417。然后求得感興趣區(qū)域內(nèi)所有像素點(diǎn)的平均光譜數(shù)據(jù)。為了綜合反映每塊樣品整體信息從而減小誤差,將樣本的平均光譜曲線作為光譜曲線。最終得到127 樣品×485波長的原始平均光譜數(shù)據(jù)集合。然后進(jìn)行三種預(yù)處理,127個(gè)樣品原始光譜特征及三種預(yù)處理平均光譜特征如圖1所示。

圖1 冷鮮雞肉的近紅外光譜特征Fig.1 NIR spectroscopic characteristics of the fresh chicken samples注:a:原始光譜,b:MSC光譜,c:BC光譜,d:SNV光譜。

從圖1可得,不管是原始光譜還是預(yù)處理光譜,不同樣品的光譜曲線總體趨勢一致,但每個(gè)樣本的光譜曲線有高低之分,這是由于雞肉品樣本的化學(xué)成分含量不同導(dǎo)致的,近紅外光譜出現(xiàn)吸收峰是源于雞肉中化學(xué)組分中的各種含氫基團(tuán)(包括O-H、N-H、C-H等)發(fā)生伸縮、彎曲等運(yùn)動(dòng)的合頻吸收[33]。雖然光譜上沒有明顯的熱殺索絲菌吸收峰,但是熱殺索絲菌的生長離不開雞肉中的各種化學(xué)組分,可以通過化學(xué)計(jì)量學(xué)手段挖掘光譜信息,尋找到特征光譜信息與熱殺索絲菌之間的定量關(guān)系。

2.3 基于全波段光譜的F-PLS模型預(yù)測熱殺索絲菌

本實(shí)驗(yàn)基于三種不同預(yù)處理全波段485個(gè)波長,采用PLS回歸算法來挖掘雞肉熱殺索絲菌的含量與光譜信息之間的相關(guān)性。結(jié)果如表2所示。

表2 雞肉熱殺索絲菌F-PLS回歸預(yù)測結(jié)果Table 2 F-PLS performance for predicting Brochothrix thermosphacta values in chicken

由表2得知,用預(yù)處理光譜構(gòu)建的3種F-PLS回歸模型預(yù)測冷鮮雞肉熱殺索絲菌的效果良好,相關(guān)系數(shù)相近(RC、RCV和RP),均接近于1.0,誤差也較小(RMSEC、RMSECV和RMSEP)。其中,經(jīng)BC預(yù)處理的F-PLS模型相關(guān)系數(shù)(RC=0.984、RCV=0.960、RP=0.973)均高于其他兩種預(yù)處理,且誤差(RMSEC=0.208 lg CFU/g、RMSECV=0.330 lg CFU/g、RMSEP=0.295 lg CFU/g)均低于其他兩種預(yù)處理,故BC預(yù)處理的光譜所構(gòu)建的熱殺索絲菌的F-PLS回歸模型的性能和穩(wěn)定性最優(yōu)。此外,對比三種不同預(yù)處理F-PLS模型的校正集RMSEC與驗(yàn)證集RMSEP絕對值差ΔE可知,BC預(yù)處理的光譜所構(gòu)建的熱殺索絲菌的F-PLS回歸模型的ΔE最小,為0.087 lg CFU/g,這說明了在三種預(yù)處理的光譜所構(gòu)建的PLS回歸模型中,BC預(yù)處理的光譜所構(gòu)建的F-PLS模型具有最好的魯棒性。故以下數(shù)據(jù)的進(jìn)一步處理均采用BC預(yù)處理的光譜進(jìn)行操作。

2.4 最優(yōu)波長提取

采用PLS-β法、Stepwise和SPA算法從BC預(yù)處理全波段光譜中篩選出最優(yōu)波長,以減少數(shù)據(jù)運(yùn)算量、提高建模效率,本試驗(yàn)使用The Unscrambler 9.7和MATLAB 2016a兩個(gè)軟件對最優(yōu)波長進(jìn)行提取,其提取結(jié)果如表3所示:

表3 特征波長提取結(jié)果Table 3 Results of optimal wavelengths selected from BC spectra

由表3得知,通過PLS-β、Stepwise和SPA三種方法篩選出特征波長的個(gè)數(shù)均不同,且都在40個(gè)以下。波長減少量都達(dá)到了90%以上。PLS-β、Stepwise和SPA三種方法篩選出最優(yōu)波長的個(gè)數(shù)分別為25、32個(gè)和27個(gè)。其中PLS-β法所提取的波長數(shù)最少,相比較于全波段485個(gè)波長,波長減少量最高,達(dá)到了94.8%。PLS-β篩選出 25個(gè)特征波長分別為900.6、905.5、908.8、930.2、933.5、951.6、1017.4、1025.7、1086.5、1124.4、1167.1、1183.6、1213.2、1265.9、1336.6、1364.6、1376.2、1389.4、1405.8、1428.9、1499.9、1523.0、1673.5、1688.5和1695.1 nm,具體位置如圖2 所示。

圖2 BC預(yù)處理光譜中系數(shù)法篩選出的最優(yōu)波長具體位置Fig.2 Specific location of the optimal wavelengths selected by PLS-β from the BC pretreatment spectra

2.5 基于最優(yōu)波長的F-PLS模型優(yōu)化

基于PLS-β、Stepwise和SPA分別篩選出的特征波長作為輸入變量,熱殺索絲菌參考值為因變量重新運(yùn)算,優(yōu)化F-PLS回歸模型和建立MLR預(yù)測模型,結(jié)果如表4所示。

由表4可得,表4中所建立的6種雞肉熱殺索絲菌的預(yù)測模型的相關(guān)系數(shù)R值均高于0.8,且均方根誤差均較小。其中通過PLS-β和Stepwise篩選出的最優(yōu)波長所構(gòu)建的PLS-β-PLS、PLS-β-MLR、S-PLS和S-MLR四種預(yù)測模型相關(guān)系數(shù)R值均高于0.89。而基于SPA法篩選的最優(yōu)波長所建的SPA-PLS 和SPA-MLR預(yù)測模型的相關(guān)系數(shù)均小于0.9。綜合考慮最優(yōu)波長個(gè)數(shù)和模型相關(guān)系數(shù)以及魯棒性。其中基于PLS-β法篩選的最優(yōu)波長所建PLS-β-PLS模型的波長數(shù)量最少(25個(gè)),RP最高且RMSEP最低,RMSEC與RMSEP 絕對值差次最小,此模型的運(yùn)算效率、預(yù)測性能和穩(wěn)定性均優(yōu)于其他5種模型。最優(yōu)模型預(yù)測結(jié)果如圖3所示。

3 結(jié)論

采用近紅外(900～1699) nm高光譜成像技術(shù)對不同冷藏時(shí)期雞胸?zé)釟⑺鹘z菌含量進(jìn)行快速無損檢測研究。基于三種不同預(yù)處理光譜信息(MSC、SNV、BC),構(gòu)建全波段F-PLS模型來預(yù)測雞肉熱殺索絲菌含量,均取得了較好的效果。其中采用PLS-β法和Stepwise算法來篩選特征波長分別建立優(yōu)化的PLS和MLR模型,結(jié)果顯示基于PLS-β法中篩選的25個(gè)特征波長構(gòu)建的PLS-β-PLS模型預(yù)測效果較好。故近紅外高光譜成像技術(shù)結(jié)合PLS-β法建立預(yù)測模型可潛在實(shí)現(xiàn)對雞肉熱殺索絲菌含量的快速預(yù)測。此外,本研究仍有不足之處,下一步工作將增加建模樣本數(shù)量,擴(kuò)大檢測范圍,進(jìn)一步提高模型的精度和穩(wěn)定性。同時(shí),也將在雞肉中熱殺索絲菌的可視化分布方面進(jìn)行深入研究。