吳金松,耿廣威,陳曉培,丁德剛,徐 軍,王建玲

(河南牧業(yè)經濟學院,河南鄭州 450046)

信陽毛尖是中國四大名茶之一,因其茶葉茸毛微微可見、峰尖獨特而譽名為“毛尖”,又因口感絕佳而備受人們的歡迎[1]。信陽毛尖富含蛋白質、多酚類、糖類、有機酸和維生素礦物質等營養(yǎng)成分[2]。信陽毛尖具有降低人體膽固醇、抗菌消炎、抑制細胞癌變或者基因突變等功效[3-4]。

目前在茶葉加工和使用過程還有大量副產品,如枝葉和灰末等未被利用[5],且人們對信陽毛尖這種綠茶的使用只停留在單純的沖泡階段,這使得其中大量的活性成分如氨基酸、糖類和維生素等[6]以及水溶性礦物質得不到有效的利用,造成了資源的浪費。因此,對碎茶葉末中分離純化出信陽毛尖茶多糖并進行抗氧化活性研究不僅可以大大提高廢棄茶葉末資源的利用率,而且具有重要的科研意義。

信陽毛尖茶末多糖的提取方法主要有水提醇沉法、酶提取法、酸堿提取法、超聲提取法、微波輔助萃取法以及多種輔助提取相結合法等[7-12]?；钚远嗵堑姆旨夁^程主要包括乙醇沉淀分級、季銨鹽沉淀分級、金屬鹽沉淀法分級和DEAE-纖維素凝膠色譜分離等方法[13-16]。通常一次分級純化很難達到理想的分離效果,本實驗通過乙醇沉淀分級粗提和DEAE-纖維素以及 Sephadex-100葡聚糖凝膠色譜分離相結合的方法純化出主要洗脫組分,結合紫外掃描和凝膠過濾法進行純度鑒定,紅外光譜掃描法對多糖組分進行定性分析,最后進行DPPH自由基、羥自由基以及還原力的測定等體外抗氧化活性研究,以期為信陽毛尖茶葉末廢棄材料的再利用以及功能食品添加劑的研究開發(fā)提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

信陽毛尖茶葉末(產地為河南信陽浉河區(qū),生產日期2018年9月) 購于鄭州北區(qū)茶葉城;苯酚、硫酸、鹽酸、氫氧化鈉、氯化鈉 以上試劑均為分析純,洛陽市化學試劑廠;葡萄糖 分析純，南京森貝伽生物科技有限公司;無水乙醇、甲醇、水楊酸、硫酸亞鐵、雙氧水、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、抗壞血酸VC均為分析純,天津科密歐化學試劑有限公司;1,1-二苯基-2-苦味基肼(DPPH) 分析純,成都化夏化學試劑有限公司;DEAE-52纖維素、Sephadex-100、Sephadex-150、各種標準葡聚糖和藍色葡聚糖(Dextran T-2000) 北京索萊寶科技有限公司。

玻璃層析柱(Φ2.6 cm×40 cm、Φ2.6 cm×60 cm) 鄭州賽克斯玻璃儀器公司;Kd723型可見光分光光度計 上海美析儀器有限公司;FA2204B型分析天平 上海佑科儀器儀表有限公司;101-1型恒溫鼓風干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司;RE-52C型旋轉蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器有限公司;SHZ-III循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司;UV1902型雙光束紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司;Nicolet iS10型傅立葉變換紅外光譜儀 美國尼高力公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 信陽毛尖茶末多糖提取工藝 首先取信陽毛尖茶葉樣品進行干燥(55 ℃恒溫干燥),研碎后過100目篩),然后進行索氏提取器連續(xù)抽提脫脂處理,再進行烘干;精確稱取5.0 g樣品，以料液比1∶30于85 ℃水浴鍋中浸提,濾液抽濾后濃縮,再低溫靜置(4 ℃,12 h)醇沉(同體積提取液加入不同比例的無水乙醇使之產生不同的乙醇終濃度),再進行減壓過濾、同濃度乙醇抽洗于55 ℃烘箱中干燥至恒重,即得到信陽毛尖茶末粗多糖[14]

1.2.2 不同乙醇終濃度對信陽毛尖茶末粗多糖得率的影響 由于多糖提取液在不同的乙醇終濃度條件下沉淀后得率不同,因此在等體積的提取液中加入不同體積的無水乙醇,使之產生不同的乙醇終濃度(乙醇終濃度分別為50%、60%、70%、80%、90%)提取多糖,考查乙醇終濃度對信陽毛尖多糖得率的影響。

1.2.3 信陽毛尖茶末多糖得率的測定 將不同乙醇終濃度提取到的粗多糖樣品研碎后分別稱取20.0 mg，用蒸餾水定容至250 mL容量瓶中,分別用吸量管量取1.0 mL樣液于試管中,蒸餾水做空白樣,采用苯酚-硫酸法測定其吸光度,代入葡萄糖標準曲線中的線性回歸方程y=0.0093x+0.0149,R2=0.9995,從而計算出不同乙醇終濃度下的信陽毛尖茶末多糖得率[17]。信陽毛尖粗多糖得率的計算公式計算如下:

式中:C:為樣品葡萄糖濃度(μg/mL);V:為信陽毛尖多糖溶液總體積(mL);D:為稀釋倍數;M:為信陽毛尖粉質量(g)。

測定出最佳得率下的乙醇濃度后,用該濃度的乙醇對信陽毛尖茶末多糖進行大量提取備用。

1.2.4 信陽毛尖茶末多糖的分離純化 取乙醇最佳提取終濃度提取到的粗多糖樣品200 mg,用少量蒸餾水溶解后上DEAE-52纖維素柱分級,依次使用蒸餾水、0.05、0.10、0.20、0.50 mol/L的NaCl溶液進行梯度洗脫,根據洗脫峰進行命名。用試管收集洗脫液時4 mL/管,然后從每支試管中用吸量管吸取1.0 mL,采用苯酚-硫酸法于490 nm處測定其吸光度值,記錄數據并繪制洗脫曲線圖,得到的主要洗脫組分再用純水、0.20、0.50 mol/L的NaCl溶液經過Sephadex-G100葡聚糖凝膠進行梯度洗脫二次分級純化[14],純化后各組分得率計算公式如下[17-18]:

式中,M組分是吸光度大于0.1各管數洗脫液收集后濃縮冷凍干燥后的質量(mg);M進樣為進樣量(mg)。

1.2.5 信陽毛尖茶末多糖組分的純度鑒定

1.2.5.1 凝膠過濾法 分別取Sephadex-100葡聚糖凝膠分級純化后的主要組分,溶解后上Sephadex-150葡聚糖凝膠層析柱,以蒸餾水為洗脫液,收集洗脫液4 mL/管,通過苯酚硫酸法跟蹤檢測,每管洗脫液以490 nm波長處吸光度對洗脫液管數,做洗脫曲線圖,根據洗脫曲線是否呈單一對稱峰,判斷其純度大小[14]。

1.2.5.2 紫外光譜掃描法 將分離純化到的信陽毛尖茶末多糖組分配制成1.0 mg/mL的溶液,在紫外可見分光光度計進行全波段掃描(190～400 nm),根據紫外掃描圖譜在260～280 nm波長處是否出現吸收峰,進而確定分離純化出的信陽毛尖茶葉末多糖組分中是否含有蛋白質、核酸等大分子物質[19]。

1.2.6 信陽毛尖多糖分子量Mr的測定 采用葡聚糖凝膠過濾法(GPC)[14],SephadexG-100濕法裝柱,層析柱規(guī)格為60 cm×2.6 cm,純水平衡12 h。洗脫速度0.5 mL/min,洗脫液采用蒸餾水。各標準葡聚糖和藍色葡聚糖(Dextran T-2000)上樣量均為2.0 mg,首先用藍色葡聚糖測得洗脫體積為V0,然后用型號T-110、T-70、T-40、T-10標準葡聚糖相繼上柱。手動分管收集洗脫液,每管3 mL,苯酚-硫酸法跟蹤檢測,根據吸光度測定洗脫體積Ve。以Ve/V0為縱坐標,分子量的自然對數lgMr為橫坐標,繪制標準曲線,該標準曲線的回歸方程是:(Ve/V0)=-1.4384(lgMr)+8.1382,R2=0.9988。在同樣洗脫條件下,取純化后的多糖2.0 mg上柱,測定各自的洗脫體積Ve′,結合標準曲線和Ve′/V0值計算出相應的分子量。

1.2.7 信陽毛尖茶末多糖的紅外光譜掃描 稱取少量經純化干燥后的多糖組分XPS-5B與溴化鉀充分研磨混合后制成壓片,放入紅外光譜儀中進行波譜掃描,根據紅外掃描譜圖出峰位置及峰面積的大小,對該分離純化后組分是否具有多糖結構進行定性分析[20]。

1.2.8 信陽毛尖茶末多糖的抗氧化活性

1.2.8.1 DPPH自由基清除率的測定 配制出0.20～1.20 mg/mL信陽毛尖粗多糖、純化后的多糖組分XPS-5B和VC樣品溶液,同時配制0.125 mmol/L的DPPH甲醇溶液。取一支試管,向其中加入2.0 mL多糖溶液后,再加入2.0 mL 0.125 mmol/L DPPH的甲醇溶液,充分振蕩后,于室溫下暗處反應30 min。在波長517 nm處,使用無水甲醇調零后測定其吸光度(A)。同等條件下,對照組(Ab)為2.0 mL多糖溶液和1.0 mL的無水甲醇,空白組(A0)為2.0 mL的無水甲醇和1.0 mL的DPPH溶液[21-22]。測定完成后,按照式(1)計算不同濃度的多糖溶液對DPPH自由基的清除率:

式(1)

1.2.8.2 羥自由基清除率的測定 將不同濃度的多糖溶液2.0 mL分別放入不同的試管中并做好標記,再逐一加入2.0 mL 6 mmol/L的 FeSO4溶液,2.0 mL 6 mmol/L的H2O2溶液,將其充分搖勻,并于室溫下靜置10 min,之后將2.0 mL新配制的6 mmol/L水楊酸的乙醇溶液加入其中,并混合均勻,在37 ℃下反應30 min后,波長設置為510 nm，測定它們的吸光度(Ax)。與此同時,樣品對照組實驗使用相同體積的乙醇來替代水楊酸溶液(Ay);空白對照組則使用相同體積的蒸餾水替代多糖溶液(Az),在相同的條件下測定其吸光度值[23-24]。測定完成后,按照式(2)計算各濃度多糖溶液對羥自由基的清除率:

式(2)

1.2.8.3 還原力的測定 分別取1.0 mL各濃度的多糖溶液于不同試管中將2.5 mL pH=6.6、0.2 mol/L的磷酸緩沖溶液加入其中,再加入2.5 mL的1 g/100 mL的K3Fe(CN)6溶液,充分混勻,并在50 ℃的條件下水浴20 min,取出后迅速將其放入冷水中冷卻,同時再加入2.5 mL10 g/100 mL的三氯乙酸溶液,混合搖勻。將樣品放入離心機中,在5000 r/min的條件下離心5 min,吸取1.5 mL反應液至試管中,加入0.2 mL新配制的0.1 g/100 mL的FeCl3水溶液,再加入1.0 mL蒸餾水混合均勻,在暗處反應30 min。用蒸餾水校零后,在700 nm波長處測定各試樣的吸光度值[25],記錄數據。

1.3 實驗處理

使用Origin 8.6和Excel進行圖表的繪制和相關數據的處理。

2 結果與分析

2.1 不同乙醇終濃度沉淀信陽毛尖茶末粗多糖的得率

由圖1可知,信陽毛尖茶末粗多糖的得率隨著乙醇終濃度的升高而增大,當乙醇濃度達到最大90% 時信陽毛尖茶末粗多糖分級沉淀的得率最高,為2.47%,因此本實驗選用90%的乙醇終濃度分級沉淀提取的信陽毛尖茶末粗多糖進行后續(xù)的分離純化。

圖1 不同乙醇終濃度對信陽毛尖茶末粗多糖的得率Fig.1 Extraction rate of polysaccharide from Xinyangmaojian tea dust at the end of different ethanol concentrations

2.2 不同濃度的洗脫液對信陽毛尖茶末粗多糖樣品的分級純化

由圖2可知,不同濃度的洗脫液對信陽毛尖茶末粗多糖樣品均有一定的洗脫效果,將洗脫下來的多糖組分按照洗脫液濃度大小分別命名為XPS-1、TPS-2、XPS-3、XPS-4、XPS-5分別收集各吸收峰的洗脫液經過旋轉蒸發(fā)冷凍干燥,計算出各組分的得率分別為7.9%、9.2%、11.8%、16.7%、50.6%。由于XPS-1、XPS-2、XPS-3、XPS-4得率太低,因此選擇洗脫組分XPS-5進行Sephadex-100葡聚糖凝膠純化。

圖2 信陽毛尖茶末多糖DEAE-52纖維素層析柱洗脫曲線Fig.2 Elution curve of DEAE-52 cellulose column of Xinyangmaojiao tea dust polysaccharide

2.3 XPS-5的Sephadex-100葡聚糖凝膠洗脫曲線

由圖3可知,經過DEAE-52纖維素分級純化后的組分XPS-5,洗脫后得到XPS-5A、XPS-5B和XPS-5C三種多糖組分,其得率分別為6.8%、59.2%、6.4%;由于XPS-5A、和XPS-5C得率太低,所以本研究選擇得率最高的XPS-5B進行后續(xù)的定性分析和體外抗氧化活性實驗。

圖3 多糖組分XPS-5 Sephadex-100葡聚糖凝膠洗脫曲線Fig.3 The elution curves of XPS-5 Sephadex-100 chromatographic column

2.4 信陽毛尖茶葉末多糖組分XPS-5B的紫外掃描圖譜

由圖4可知,XPS-5B經純水洗脫后,洗脫曲線呈單一對稱峰,說明經過DEAE-52纖維素和Sephadex-G100分級純化后的主要組分XPS-5B純度較高。由圖5可知,XPS-5B在260～280 nm波長段處,信陽毛尖茶葉末多糖組分XPS-5B無明顯吸收峰,因而純化后的信陽毛尖茶末多糖組分XPS-5B樣品中不含或含有極少量蛋白質或核酸,結合凝膠過濾洗脫曲線和測定多糖含量,測定XPS-5B純度為92.4%,純度較高。

圖4 組分XPS-5B Sephadex-150葡聚糖凝膠洗脫曲線Fig.4 Elution curves of XPS-5B Sephadex-150 chromatographic column

圖5 組分XPS-5B的紫外掃描光譜圖Fig.5 Ultraviolet scanning spectra of component XPS-5B

2.5 信陽毛尖多糖組分分子量Mr結果分析

由圖6可知,分別收集XPS-5B吸光度大于0.1的管數為23～37管,洗脫體積Ve分為45 mL。已測得標準藍色葡聚糖外水體積V0為30 mL,根據Ve′/V0值,計算其分子量為41208 Da。

圖6 XPS-5B SephadexG-100洗脫曲線Fig.6 SephadexG-100 elution curve of XPS-5B

2.6 信陽毛尖茶葉末多糖組分XPS-5B的紅外掃描圖譜

從圖7中可以看出,組分XPS-5B在波數3424 cm-1產生的-OH伸縮振動吸收峰,在2942 cm-1處產生的C-H伸縮振動吸收峰,在1647 cm-1處產生的羰基伸縮振動吸收峰,在1442 cm-1及1019 cm-1處產生的-OH彎曲振動吸收峰,在800 cm-1處產生的β-型糖苷鍵吸收峰[19,26-27]。由紅外吸收圖譜可知,信陽毛尖茶末多糖組分XPS-5B符合活性植物多糖結構特征,為β-型糖多糖。

圖7 組分XPS-5B的紅外掃描圖譜Fig.7 Infrared scanning map of component XPS-5B

2.7 信陽毛尖茶末多糖組分XPS-5B抗氧化活性測定結果

2.7.1 信陽毛尖茶末多糖組分XPS-5B DPPH自由基清除率 由圖8可知,在茶末多糖質量濃度0.20～1.20 mg/mL范圍內,信陽毛尖純化后的組分XPS-5B和粗多糖的DPPH自由基清除率隨著質量濃度的不斷增加而增加,即DPPH自由基的清除率與質量濃度呈正相關。純化得到的毛尖多糖組分XPS-5B在各質量濃度下,DPPH自由基清除率顯著強于未純化的毛尖粗多糖(P<0.05),因而達到了理想的分離純化效果;當其濃度為1.20 mg/mL時DPPH自由基清除率達到89.18%,與VC對照組接近,由此說明純化后的信陽毛尖多糖組分XPS-5B具有較強的DPPH自由基清除效果。

圖8 不同質量濃度茶多糖對DPPH自由基清除率的影響Fig.8 Effects of different concentrations of tea polysaccharides on DPPH radical scavenging rate

2.7.2 信陽毛尖茶末多糖組分XPS-5B 羥自由基清除率 由圖9可知,在茶末多糖質量濃度0.20～1.20 mg/mL范圍內,信陽毛尖純化后的組分XPS-5B和未純化粗多糖的羥自由基清除率隨著質量濃度的不斷增加而增加,即羥自由基的清除率與質量濃度呈正相關。純化后的毛尖多糖組分XPS-5B在各質量濃度下,羥自由基清除率顯著強于未純化的毛尖粗多糖(P<0.05),因而達到了理想的分離純化效果。當其濃度為1.20 mg/mL時 羥自由基清除率達到90.62%,與VC對照組接近,與丁世環(huán)等[28]粗提的茶多糖在3.2 mg/mL對羥自由基的清除率最高可達60.37%相比,純化后的信陽毛尖多糖組分XPS-5B具有較強的羥自由基清除能力。

圖9 不同質量濃度茶多糖對羥自由基清除率的影響Fig.9 Effects of different concentrations of tea polysaccharides on hydroxyl radical clearance

2.7.3 信陽毛尖茶末多糖組分XPS-5B 的還原力 根據總還原力測定法,吸光度值的變化大小反映出樣品總還原力的高低,吸光度越大,則樣品的還原力就越強[29-30]。由圖10可知,在茶末多糖質量濃度0.20～1.20 mg/mL范圍內,信陽毛尖純化后的多糖組分XPS-5B和粗多糖的還原力隨著質量濃度的不斷增加而增加,即還原力與質量濃度呈正相關。純化后的毛尖多糖組分XPS-5B在各質量濃度下,還原力的吸光度顯著高于未純化的毛尖粗多糖(P>0.05),達到了理想的分離純化效果;當其濃度為1.20 mg/mL時 XPS-5B還原力吸光度為0.536,與VC對照組相近。

DPPH自由基、羥自由基清除率以及還原力大小是判斷其抗氧化活性的重要指標。結合圖8～圖10分析可知XPS-5B、毛尖粗多糖的抗氧化活性大小與其濃度大小均呈依賴效應,而同濃度的XPS-5B的DPPH自由基和羥自由基清除率、還原力吸光度均顯著大于毛尖粗多糖(P<0.05);0.80 mg/mL的信陽毛尖茶末多糖羥自由基率為61.82%,與曾橋等[31]0.875 mg/mL的杜仲葉茯磚茶多糖對羥自由基清除率為43.97%相比,說明分離純化后的信陽毛尖茶多糖XPS-5B具有較強的抗氧化性。

圖10 不同質量濃度茶多糖對還原力的影響Fig.10 Effects of different concentrations of tea polysaccharides on reducing power

3 結論

利用不同的乙醇終濃度分級粗提,當乙醇終濃度為90%時,信陽毛尖茶末粗多糖的得率最高,為2.47%。DEAE纖維素陰離子交換柱進行梯度洗脫,分級純化出以0.50 mol/L的NaCl溶液洗脫的主要組分XPS-5,再進行Sephadex-100葡聚糖凝膠分級得到主要洗脫組分XPS-5B。XPS-5B純度鑒定結果表明其基本不含蛋白質和核酸,純度到達了92.4%,分離純化效果較好。分子量測定大小為41208 Da。紅外光譜掃描表明XPS-5B符合活性植物多糖結構特征,為β-型糖苷鍵多糖。XPS-5B體外抗氧化活性測定結果表明,當XPS-5B濃度為1.20 mg/mL時對DPPH自由基和羥自由基的清除率分別為89.18%、90.62%,總還原力吸光值為0.536,與未純化的毛尖粗多糖相比,具有較強的抗氧化活性。本研究為信陽毛尖茶末廢棄資源的再利用以及功能產品的研究開發(fā)提供一定的理論依據。由于本研究僅對分離純化后的信陽毛尖茶末多糖進行了構型分析、分子量大小以及體外抗氧化活性測定,有關信陽毛尖茶末多糖的單糖分子組成、糖苷鍵等結構分析以及降低膽固醇、抑制腫瘤等其他生物活性有待進一步的研究。