李 曉,李靜雯,陳 曄,賈利蓉,2,高 鴻,2,*,段飛霞,2,*

(1.四川大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院,四川成都 610065; 2.食品科學(xué)與技術(shù)四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川成都 610065)

果膠具有凝膠性、穩(wěn)定性、起泡性和乳化性等,是一種廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)的天然食品添加劑[1]。果膠的功能性質(zhì)通常與果膠來源和化學(xué)結(jié)構(gòu)等有關(guān)。根據(jù)果膠的酯化度(DE)可分為高甲氧基果膠(DE>50%)和低甲氧基果膠(DE<50%)。目前商業(yè)使用的果膠主要由柑橘皮和蘋果渣生產(chǎn),少量來源于甜菜[2]。酸提取的柑橘、蘋果和甜菜果膠均為高甲氧基果膠;而低甲氧基果膠主要由高甲氧基果膠的進(jìn)一步脫脂化獲得。盡管目前已發(fā)現(xiàn)向日葵頭和西番蓮果皮中含有較高的低甲氧基果膠[3],但資源少、原料價格高,直接提取制備天然的低甲氧基果膠的途徑和方法仍待研究和拓展。

豆腐柴(PremnamicrophyllaTurcz)又名觀音草、涼粉葉和臭黃荊,是馬鞭草科豆腐柴屬的一種多年生落葉灌木,廣泛分布于我國華東、中南和西南地區(qū),易生長,富含果膠多糖、蛋白質(zhì)、粗纖維和礦物質(zhì)元素,是果膠的良好來源[4]。豆腐柴的莖、葉和根民間用于清熱解毒、消腫止血[5]。我國華中、西南等地也有采集豆腐柴嫩葉,利用其汁液凝膠后制作“神仙豆腐”的傳統(tǒng)習(xí)俗。關(guān)于豆腐柴葉的現(xiàn)有研究主要集中在“神仙豆腐”制作工藝、豆腐柴葉的化學(xué)組成以及豆腐柴果膠凝膠條件等方面[6-8]。果膠提取過程中,提取溫度、時間、pH、料液比等對果膠的化學(xué)結(jié)構(gòu)和基本性質(zhì)存在明顯影響[9],但目前尚未見關(guān)于提取方法、提取工藝參數(shù)等對豆腐柴果膠酯化度、微觀結(jié)構(gòu)、加工特性等影響的相關(guān)報道。

本研究采用響應(yīng)面法(Response Surface Methodology,RSM),通過多元二次回歸方程擬合實(shí)驗(yàn)因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系,考察提取工藝參數(shù)對豆腐柴果膠得率、酯化度的影響,研究了直接提取法制備天然豆腐柴低酯果膠的方法,并考察了酯化度、化學(xué)組成、微觀形態(tài)及持油性、持水性和起泡性等理化、加工特性,為豆腐柴果膠的制備和應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ),并提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豆腐柴葉 采摘于安徽金寨桃?guī)X豆腐柴種植基地,60 ℃烘干后粉碎過60目篩,取曬上物備用;D-(+)-半乳糖醛酸 阿拉丁公司;3-苯基苯酚 上海源葉生物科技公司;鹽酸、無水乙醇和氫氧化鈉 均為分析純。

TG22-WS臺式高速離心機(jī) 長沙湘銳公司;UV3600紫外分光光度計 日本島津公司;Nicolet 6700傅里葉紅外光譜儀 美國熱電公司;JSM-7500F場發(fā)射掃描電子顯微鏡 日本電子公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 豆腐柴果膠的提取 干燥的豆腐柴葉粉碎后過60目篩,稱取50 g粉末按照一定的液料比加入蒸餾水,通過加入適量的0.5 mol/L的HCl溶液調(diào)整溶液至合適的pH。置于500 W的超聲和一定的溫度下浸提,一定提取時間后將混合物過濾,取濾液以5000×g離心15 min,收集上清液,加入3倍體積的乙醇,4 ℃下放置過夜,取沉淀。沉淀用乙醇洗滌2次,真空冷凍干燥后備用。

1.2.2 豆腐柴果膠的提取的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計 在單因素預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,設(shè)計響應(yīng)面試驗(yàn),考察提取溫度(50、60、70、80和90 ℃),pH(2、3、4、5和6),提取時間(30、60、90、120和150 min)和液料比(10∶1、20∶1、30∶1、40∶1和50∶1 mL/g)對果膠得率和酯化度的影響(如表1所示)。

表1 Box-Behnken 設(shè)計實(shí)驗(yàn)因素水平及編碼Table 1 Independent variables and levels in Box-Behnken Design

1.2.3 果膠得率的測定 將提取得到并干燥至恒重的豆腐柴果膠稱重,按照式(1)計算得率:

果膠得率(%)=果膠質(zhì)量(g)/豆腐柴葉粉末質(zhì)量(g)×100 式(1)

1.2.4 果膠酯化度的測定 采用滴定法測定果膠酯化度[10]。制備20 mL濃度為1 mg/mL的果膠溶液,加入5滴酚酞-乙醇試劑混勻。用0.02 mol/L的氫氧化鈉溶液滴定混合物直至出現(xiàn)粉紅色,記錄消耗的氫氧化鈉溶液體積(V1)。繼續(xù)向混合物中加入10 mL、0.02 mol/L的氫氧化鈉溶液(粉紅色變深)并劇烈攪拌后靜置20 min。然后,加入10 mL、0.02 mol/L的鹽酸溶液(粉紅色消失)。用0.02 mol/L的氫氧化鈉溶液再次滴定混合試樣,記錄消耗的氫氧化鈉體積(V2)。通過式(2)計算酯化度:

式(2)

1.2.5 最佳提取條件下的果膠性質(zhì)研究

1.2.5.1 果膠物理化學(xué)成分測定 采用苯酚-硫酸法在490 nm處測定樣品吸光度值,計算總碳水化合物含量,以D-葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品[11];采用考馬斯亮藍(lán)法,在595 nm處測定樣品吸光度值,計算蛋白質(zhì)含量,以牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品[12]。采用間羥基聯(lián)苯法測定樣品在520 nm處的吸光度值,計算果膠半乳糖醛酸含量,以D-半乳糖醛酸作標(biāo)準(zhǔn)品[13]。

1.2.5.2 掃描電鏡觀察 取適量樣品粉末噴金后觀察果膠微觀形態(tài)。放大倍數(shù)為100倍和500倍。

1.2.5.3 紫外吸收光譜 制備1 mg/mL的果膠溶液,使用紫外分光光度計在200～400 nm范圍內(nèi)測定樣品的吸光度值。

1.2.5.4 傅里葉紅外光譜 取5 mg樣品與適量KBr混合研磨、壓片,置于傅里葉紅外光譜儀上掃描,在400～4000 cm-1范圍內(nèi)測定樣品的紅外吸收光譜圖。

1.2.5.5 持水性和持油性 參考Gao等[14]的方法并加以修改。將1 g豆腐柴果膠與10 mL蒸餾水混合,渦旋30 min后以3000×g離心30 min,去除上清液后稱重殘留物。持水量(WHC)表示為每克樣品保持的水克數(shù)。持油量(OHC)測量與持水量類似,不同之處在于,使用大豆油代替蒸餾水,表示為每克樣品保持的油克數(shù)。

1.2.5.6 起泡性能 根據(jù)NadiaBayar等[15]的方法測定起泡性和泡沫穩(wěn)定性。分別配制20 mL的2%和4%的果膠溶液,使用高速勻漿機(jī)攪拌90 s后迅速轉(zhuǎn)入量筒中,測定溶液(V0)和泡沫層(V1)的體積。靜置10、30、60和120 min后測定泡沫層體積(V2)。根據(jù)式(3)計算起泡性,根據(jù)式(4)計算泡沫穩(wěn)定性:

起泡性(%)=V1/V0×100

式(3)

泡沫穩(wěn)定性(%)=V2/V0×100

式(4)

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)測定3次,取平均值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,標(biāo)準(zhǔn)差在各圖中用誤差線表示。采用Origin 8.0軟件進(jìn)行繪圖;Design Expert 8.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計與方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

通過響應(yīng)面法評價提取溫度(A)、pH(B)、提取時間(C)和液料比(D)對豆腐柴果膠的得率和酯化度的影響。測試結(jié)果如表2所示。運(yùn)用Design Expert 8.0對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,得到擬合方程如下:

表2 Box-Behnken設(shè)計中的自變量和響應(yīng)值Table 2 Box-Behnken design for the independent variables and the responses

果膠得率(%)=9.87+1.71A+0.29B-0.74C-0.53D+0.015AB-0.27AC-0.36AD-0.034BC-0.42BD+0.22CD-0.32A2+0.78B2-0.59C2-0.47D2

酯化度(%)=42.27-2.51A+2.82B-4.03C-0.40D+0.19AB+0.46 AC+0.69AD+0.44BC-0.29BD-0.81CD-0.082A2-0.87B2+0.093C2+0.78D2

表4 果膠酯化度的回歸模型的方差分析結(jié)果Table 4 ANOVA for the fitted models for pectin DE

表3 果膠得率的回歸模型的方差分析結(jié)果Table 3 ANOVA for the fitted models for pectin yield

各因素的顯著性檢驗(yàn)表明:除了AB和BC(P>0.05),其他的一次項(xiàng)、二次項(xiàng)和相互項(xiàng)均對果膠得率具有極顯著的影響(P<0.01)。一次項(xiàng)A、B、C、D,交互項(xiàng)AC、BC、AD、CD,二次項(xiàng)B2、D2對果膠酯化度有極顯著的影響(P<0.01),而BD對酯化度有顯著的影響(P<0.05),其他因素均不顯著(P>0.05)。

2.2 果膠得率的響應(yīng)曲面圖

通過響應(yīng)曲面圖可以觀察到不同條件之間的交互作用。如圖1(a～c)所示,提取溫度是影響果膠得率的重要參數(shù),果膠得率隨溫度升高而增加。溫度的升高可加速溶劑在植物組織中的溶解度和擴(kuò)散性,從而提高果膠的得率。由圖1(b、c)得到提取溫度與提取時間、液料比的交互作用極顯著(P<0.01),在提取溫度較高時,通過調(diào)節(jié)提取時間和液料比可以得到更高的果膠得率。pH變化對得率的影響相對較小,在pH3～6的范圍內(nèi),提高pH可提高豆腐柴果膠的得率。如圖1(e)所示,pH與液料比之間有較顯著的交互作用(P<0.01),在pH6時,液料比的變化對果膠得率有很大的影響。圖1(f)橢圓形的曲線輪廓顯示出提取時間和液料比之間的強(qiáng)交互作用(P<0.01),過高或過低的液料比及提取時間均不利于果膠的提取。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明,通過提高提取溫度和pH,調(diào)節(jié)適當(dāng)?shù)囊毫媳群吞崛r間可以獲得更多的豆腐柴果膠。

圖1 豆腐柴果膠得率的響應(yīng)曲面圖Fig.1 Response surface diagram of the extraction yield of the Premna microphylla Turcz pectin

2.3 果膠酯化度的響應(yīng)曲面圖

由圖2可知,低pH下,較高溫度提取較長時間可獲得更低酯化度的豆腐柴果膠。Pasandide等[16]報道了類似的結(jié)果,這可能是由于苛刻的條件,如低pH長時間處理,促進(jìn)了聚半乳糖醛酸鏈更高程度地脫脂化,從而降低了果膠的酯化度[9]。

如圖2(b、c)可知,提取溫度與提取時間、液料比對果膠酯化度存在極顯著交互作用(P<0.01),在提取時間短、液料比較低時,升高溫度可顯著降低果膠酯化度,而提取時間長、液料比高時,溫度的升高僅緩慢降低酯化度。如圖2(d、f)所示,同時,提取時間與pH、液料比對果膠酯化度的影響也存在極顯著的交互作用(P<0.01),在低pH、高液料比時,增加提取時間可顯著降低果膠酯化度,而在高pH、低液料比時,增大提取時間僅能緩慢降低酯化度。如圖2(e)所示,pH和液料比存在顯著交互作用(P<0.05),在液料比較低時,pH對果膠酯化度的影響更大。

圖2 豆腐柴果膠酯化度的響應(yīng)曲面圖Fig.2 Response surface diagram of DE of the Premna microphylla Turcz pectin

2.4 最高得率提取條件

采用期望函數(shù)方法優(yōu)化提取條件,使豆腐柴果膠的得率最大化,得到最佳條件為:提取溫度89.6 ℃,pH5.9,提取時間67.3 min,液料比24.4∶1 mL/g,此時模型預(yù)測得率為17.41%。考慮到實(shí)際操作,調(diào)整條件為提取溫度90 ℃,pH6.0,提取時間67 min,液料比24∶1 mL/g,進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn),實(shí)際得率為17.8%±0.3%?？梢钥闯?實(shí)際得率接近預(yù)測值,表明實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測值具有高度相容性,模型準(zhǔn)確可靠。

2.5 理化表征

對最大得率條件下提取的豆腐柴果膠進(jìn)行理化性質(zhì)測定,其結(jié)果如表5所示。豆腐柴果膠含有少量蛋白質(zhì)(3.9%)和大量半乳糖醛酸(65.8%),酯化度為43.1%。與蘋果果渣的果膠相比[17],該法提取的豆腐柴果膠具有更高的半乳糖醛酸含量和更低的酯化度。由豆腐柴果膠提取過往研究可知,豆腐柴葉是低甲氧基果膠的良好來源,但其酯化度的確受到豆腐柴品種和提取工藝的影響。張攀等[6]和蔣立科等[18]通過鹽酸和硫酸提取法提取得到的是高甲氧基果膠;廖文娟[19]通過在pH2的鹽酸中加入0.3%六偏磷酸鈉浸提2.5 h,得到酯化度為40.7%的低甲氧基果膠,得率為19.25%,但其工藝較復(fù)雜,提取時間長,提取液為高酸性溶液;Chen等[20]通過熱水和鹽酸提取法分別得到了酯化度為25.1%和5.6%的豆腐柴低甲氧基果膠,但提取率較低,分別為1.86%和4.22%。

表5 豆腐柴果膠的理化性質(zhì)Table 5 Physicochemical properties of Premna microphylla Turcz pectin

由此可見,與文獻(xiàn)報道的豆腐柴果膠提取方法及其理化特性相比,本法具有工藝簡單、條件溫和、提取時間短、提取率高等特點(diǎn),通過本提取方法可直接制備大量低甲氧基果膠。

2.6 掃描電鏡觀察

最大得率條件下提取的豆腐柴果膠掃描電鏡圖像如圖3所示。豆腐柴果膠呈現(xiàn)出不規(guī)則的聚集團(tuán)狀,其表面緊密而粗糙,具有較多的褶皺,在果膠表面上觀察到一些小顆粒的粘附。

圖3 豆腐柴果膠的掃描電鏡圖像Fig.3 Scanning electron microscope images of Premna microphylla Turcz pectin

2.7 紫外吸收光譜

豆腐柴果膠在200～400 nm的紫外吸收光譜如圖4所示。豆腐柴果膠與其它多糖圖譜相似[21],在260 nm和280 nm處無顯著吸收峰,表明其蛋白質(zhì)和核酸含量極低。

圖4 豆腐柴果膠的紫外吸收光譜Fig.4 UV spectrum of Premna microphylla Turcz pectin

2.8 紅外吸收光譜

豆腐柴果膠的傅里葉-紅外光譜如圖5所示。譜圖中3430 cm-1處的寬峰由O-H伸縮振動產(chǎn)生,2930 cm-1處的吸收峰由C-H伸縮振動產(chǎn)生,均為多糖的特征吸收峰[22]。1630和1740 cm-1處的吸收峰分別為非酯化羧基和酯化羧基的C=O伸縮振動,表明豆腐柴果膠同時含有酯化和非酯化羧基[23]。1150和1010 cm-1的吸收峰為吡喃糖糖苷鍵的特征吸收峰[24]。1445 cm-1為果膠C-H的變角振動峰。

圖5 豆腐柴果膠的紅外吸收光譜Fig.5 FT-IR spectrum of Premna microphylla Turcz pectin

2.9 豆腐柴果膠的持水力和持油力

果膠的持水力和持油力對其作為乳化劑、穩(wěn)定劑等在食品中的應(yīng)用范圍和應(yīng)用效果有重要影響[25]。果膠的持水、持油力與其來源、化學(xué)結(jié)構(gòu)、粒徑、孔隙率等有關(guān)[14]。如圖6(a)所示,豆腐柴果膠具有較強(qiáng)的持水力和持油力,分別為6.52和6.03 g/g,其值高于馬鈴薯多糖(WHC=4.097,OHC=4.398)[26]。其高持水力說明豆腐柴果膠可用于食品體系中水分的保持并有助于改善食品系統(tǒng)中的感官特性;其高持油力說明豆腐柴果膠具有作為高脂肪食品系統(tǒng)中良好的穩(wěn)定劑和乳化劑的潛力。

2.10 豆腐柴果膠的起泡性和泡沫穩(wěn)定性

起泡能力和泡沫穩(wěn)定能力是植物多糖的功能特性之一,在食品加工中對泡沫穩(wěn)定起著重要作用。多糖的起泡性和泡沫穩(wěn)定性取決于碳水化合物含量、分子量、化學(xué)結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)含量和含有的其他化合物[27]。如圖6(b、c)中所示,豆腐柴果膠在開始時2%和4%時的起泡能力分別為52.7%和72.4%,30 min后的泡沫穩(wěn)定性為18.5%和44.6%,說明豆腐柴果膠具有良好的起泡性和泡沫穩(wěn)定性。

圖6 豆腐柴果膠的功能性質(zhì)Fig.6 Functional properties of Premna microphylla Turcz pectin

3 結(jié)論

豆腐柴低酯果膠最大得率提取條件為:90 ℃,pH6,提取67 min,液料比24∶1 mL/g,最大得率為17.8%,DE值43.1%。在最優(yōu)條件下提取得到的豆腐柴低酯果膠具有典型的果膠多糖紫外和紅外光譜圖,蛋白質(zhì)、核酸含量極低,掃描電鏡下呈多褶皺的聚集團(tuán)狀,持水力和持油力強(qiáng),分別為6.52和6.03 g/g;起泡能力和泡沫穩(wěn)定性強(qiáng),4%時起泡能力達(dá)72.4%,30 min后的泡沫穩(wěn)定性為44.6%,具有良好的持水力、持油力、起泡能力和泡沫穩(wěn)定性。綜上所述,豆腐柴葉可作為天然低甲氧基果膠的生產(chǎn)來源,豆腐柴低酯果膠的理化及加工特性研究表明其具有作為乳化劑、穩(wěn)定劑、起泡劑用于高脂食品體系感官品質(zhì)改善的潛在應(yīng)用價值。