曹 旭，商 亮，李 晶，胡基華*

(1.黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，哈爾濱150010； 2.黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院，哈爾濱150010)

0 引言

油棕(ElaeisguineensisJacq.)原產(chǎn)于西非和南非，是一種四季開花結(jié)果雌雄同株多年生油料作物。棕櫚油是從非洲油棕(ElaeisguineensisJacq.)的棕果中榨取的，除了可食用之外，還是肥皂、蠟燭、化妝品和橡膠加工等非食用特性的原材料，因此油棕成為世界上最高效的產(chǎn)油植物，享有“世界油王”的美譽(yù)[1]。

亞洲種植油棕(ElaeisguineensisJacq.)的主要障礙之一是由狹長(zhǎng)孢靈芝(Ganodermaboninense)引起的莖腐病，俗稱油棕莖基腐病(BSR)[2]。當(dāng)莖的底部腐爛時(shí)，會(huì)在高處形成上部莖腐爛。在種植周期結(jié)束時(shí)，通常有30%～70%的油棕因莖腐爛而死亡[3]。病害發(fā)生得越來(lái)越早且造成的損害變得越來(lái)越嚴(yán)重，這些腐爛已成為制約油棕經(jīng)濟(jì)的重要因素[4]，而且目前沒有任何補(bǔ)救措施。狹長(zhǎng)孢靈芝(Ganodermaboninense)是一種生長(zhǎng)在木材上的多孔真菌，屬于靈芝科、擔(dān)子菌綱[5]。它是一種降解木質(zhì)素的白腐真菌[6]，以降解木材木質(zhì)素成分而使白色纖維素暴露在外的能力而聞名[7]。

歷史上，BSR的控制包括文化技術(shù)(清潔、堆肥、堆砌、手術(shù)、挖溝、衛(wèi)生)、機(jī)械和化學(xué)控制，這種疾病的流行主要是由于真菌在土壤中傳播，殺菌劑在到達(dá)目標(biāo)之前可能就由于土壤的降解而無(wú)效[8]。而生物防治因具有對(duì)環(huán)境安全、低成本、保護(hù)植物免受病原體侵害的優(yōu)勢(shì)而成為唯一選擇[9]。Suryanto研究顯示[10]，芽孢桿菌屬能夠與抗真菌化合物結(jié)合，通過(guò)真菌病原體觀察發(fā)現(xiàn)了協(xié)同作用、競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)、細(xì)胞壁裂解酶的產(chǎn)生和誘導(dǎo)的系統(tǒng)抗性等多種作用方式[10-11]，并證明了芽孢桿菌屬對(duì)狹長(zhǎng)孢靈芝(Ganodermaboninense)的拮抗作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

LS：Brevibacilluslaterosporu側(cè)孢芽孢桿菌。JKL：Bacilluslicheniformis地衣芽孢桿菌。CZL：Bacilluslicheniformis地衣芽孢桿菌。CZS：Bacillussubtilis枯草芽孢桿菌。CZS2：Bacillussubtilis枯草芽孢桿菌。TF28：Bacillusamyloliquefaciens解淀粉芽孢桿菌。BA：Bacillusamyloliquefaciens解淀粉芽孢桿菌。HW2：Bacillussubtilis枯草芽孢桿菌。PB12：Bacillussubtilis枯草芽孢桿菌。DDFS：Bacillussubtilis枯草芽孢桿菌。

以上菌株均為黑龍江省科學(xué)院微生物研究所自行分離獲得，保存于該所菌種保藏中心。

1.1.2 供試病樣

2015年10月-2017年1月，從馬來(lái)西亞沙巴州亞庇市沙巴大學(xué)(地處北緯1°～7°、東經(jīng)97°～120°之間)的棕櫚科植物上采集狹長(zhǎng)孢靈芝(Ganodermaboninense)樣本，編號(hào)后帶回室內(nèi)進(jìn)行保藏。

1.1.3 供試培養(yǎng)基

馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA)：馬鈴薯200 g，瓊脂15 g，水1 L，pH 7.0。馬鈴薯培養(yǎng)基(PD)：馬鈴薯200 g，水1 L，pH 7.0。細(xì)菌培養(yǎng)基(NYD)：牛肉膏8 g，酵母膏5 g，葡萄糖10 g，水1 L，pH 7.2～7.5。

1.2 方法

1.2.1 固體培養(yǎng)條件下的拮抗作用測(cè)定

對(duì)實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有保藏的生防菌株(CZL、CZS、CZS2、PB12、JKL、LS、TF28、BA、HW2、DDFS) 挑取單菌落，分別接于5 mL NYD試管中，于35℃、170 r/min 振蕩培養(yǎng)18 h，測(cè)定菌數(shù)后用無(wú)菌水稀釋至2×108cfu/mL備用。將保存在斜面上的狹長(zhǎng)孢靈芝(Ganodermaboninense)接PDA平板，置于29℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)至菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿。在PDA培養(yǎng)基平板一側(cè)接入直徑為8 mm的靶標(biāo)病原菌菌餅后，在對(duì)側(cè)等距離位置上分別劃線待測(cè)生防菌液。設(shè)無(wú)生防菌液為對(duì)照，3次重復(fù)，于29℃下培養(yǎng)，當(dāng)對(duì)照真菌長(zhǎng)至劃線位置時(shí)觀察處理組的抑菌效果。抑菌率= (對(duì)照菌絲直徑-處理菌絲直徑)/對(duì)照菌絲直徑×100%。

1.2.2 液體培養(yǎng)條件下的拮抗作用測(cè)定

在50 mL NYD液體培養(yǎng)瓶中以2%的接種量分別加入同樣稀釋倍數(shù)的7株生防菌液，再于每瓶中分別接入直徑為8 mm的靶標(biāo)病原菌狹長(zhǎng)孢靈芝(Ganodermaboninense)菌餅，同時(shí)設(shè)未接種生防菌液為對(duì)照，3次重復(fù)，置于29℃、150 r/min恒溫?fù)u床上震蕩培養(yǎng)。每天對(duì)真菌生長(zhǎng)情況進(jìn)行觀察，到第5 d停止培養(yǎng)，將菌絲過(guò)濾，置于陰涼干燥處晾干后稱其干重并計(jì)算抑菌率。抑菌率=(對(duì)照菌絲重量-處理菌絲重量)/對(duì)照菌絲重量×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 固體培養(yǎng)條件下狹長(zhǎng)孢靈芝(Ganoderma boninense)的拮抗作用測(cè)定

通過(guò)平板抑菌對(duì)峙試驗(yàn)對(duì)10株生防菌株的抑菌能力進(jìn)行測(cè)定(如圖1所示)。篩選出8 株有抑菌能力的菌株(如圖2A所示)，其中，菌株P(guān)B12和HW2的抑菌效果較明顯。通過(guò)對(duì)抑菌帶寬度進(jìn)行測(cè)量可知，菌株P(guān)B12的抑菌率為68.57%，菌株CZS的抑菌率為64.08%(如圖2B所示)。將抑菌效果大于50%的7株生防菌進(jìn)行純化保藏。

圖1 各生防菌株活菌計(jì)數(shù)值Fig.1 Values of viable bacteria of each biocontrol strain

圖2 固體培養(yǎng)時(shí)生防菌株對(duì)狹長(zhǎng)孢靈芝(Ganoderma boninense)的拮抗作用Fig.2 Antagonistic effect of biocontrol strains on Ganoderma boninense

2.2 液體培養(yǎng)條件下狹長(zhǎng)孢靈芝(Ganoderma boninense)的拮抗作用

通過(guò)共培養(yǎng)的方法對(duì)7株生防菌的拮抗作用進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，在液體培養(yǎng)條件下，對(duì)照組中狹長(zhǎng)孢靈芝(Ganodermaboninense)菌絲迅速生長(zhǎng)成團(tuán)塊，而加有生防菌株的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)菌絲生長(zhǎng)緩慢，直到第5 d時(shí)停止培養(yǎng)，將各組菌絲進(jìn)行過(guò)濾、晾干、稱重。對(duì)照組菌絲團(tuán)塊明顯大于各試驗(yàn)組菌絲團(tuán)塊(如圖3AB所示)。通過(guò)計(jì)算各組菌絲團(tuán)塊的重量表明，7株菌株均能夠抑制狹長(zhǎng)孢靈芝(Ganodermaboninense)菌絲的生長(zhǎng)，其中菌株CZS的抑菌效果最好，抑菌率達(dá)到96.47%(如圖3所示)。

圖3 液體培養(yǎng)時(shí)狹長(zhǎng)孢靈芝(Ganoderma boninense)拮抗菌株的拮抗作用Fig.3 Antagonistic strains of Ganoderma lucidum in liquid culture

3 結(jié)論與討論

生防菌的拮抗能力是影響其生防效果的重要因素。受自身特性與所處環(huán)境等因素影響，研究生防菌的生防效果是評(píng)價(jià)其是否具有應(yīng)用前景的重要指標(biāo)之一[2]。本試驗(yàn)利用已知生防菌株研究馬來(lái)西亞油棕致病菌狹長(zhǎng)孢靈芝(Ganodermaboninense)離體條件下相互拮抗的作用(今后尚需進(jìn)行田間試驗(yàn)研究)，以揭示油棕、狹長(zhǎng)孢靈芝(Ganodermaboninense)、生防菌三者之間的互作關(guān)系，進(jìn)而為馬來(lái)西亞油棕園的生態(tài)健康提供理論和技術(shù)支撐。

生防菌株所處環(huán)境是影響生防菌拮抗能力的主要因素。研究發(fā)現(xiàn)，生防菌在PD液體培養(yǎng)條件下對(duì)狹長(zhǎng)孢靈芝(Ganodermaboninense)的抑制作用遠(yuǎn)高于其在PDA固體的培養(yǎng)條件下，說(shuō)明生防菌株在PD液體培養(yǎng)時(shí)，生防細(xì)菌可以充分同病原菌菌絲體接觸并作用，使其達(dá)到最優(yōu)的拮抗效果。但馬來(lái)西亞位于赤道附近，屬于熱帶地區(qū)，常年氣溫較高且雨季時(shí)濕度較大，所篩生防菌在高溫環(huán)境下的活體植株上能否正常發(fā)揮抑制病原菌的作用都是未知數(shù)，還需要后續(xù)試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證其功效，以早日解決東南亞地區(qū)的油棕病害，為帶動(dòng)當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)發(fā)展作出貢獻(xiàn)。