程倩，梁瑞鵬，鄭佳誼，馮砅錦，劉維薇，林清,4

0 引言

乳腺癌是全球女性最常見(jiàn)惡性腫瘤，其死亡率位居女性惡性腫瘤首位[1]。我國(guó)2014年統(tǒng)計(jì)乳腺癌新發(fā)病例27.89萬(wàn)例，占女性惡性腫瘤發(fā)病的16.51%[2]。人表皮生長(zhǎng)因子受體HER2陽(yáng)性乳腺癌約占乳腺癌的15%～20%，臨床數(shù)據(jù)表明HER2陽(yáng)性乳腺癌多數(shù)為浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌，組織學(xué)分級(jí)Ⅱ～Ⅲ級(jí)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生率高、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高等特點(diǎn)[3-4]。目前單藥靶向治療HER2陽(yáng)性乳腺癌仍有50%患者天然性耐藥，聯(lián)合治療療效提高有限且費(fèi)用昂貴[5]。因而有關(guān)HER2陽(yáng)性乳腺癌診療的靶點(diǎn)有待進(jìn)一步研究。A激酶錨定蛋白12（A kinase anchoring protein 12,AKAP12）是一種激酶支架蛋白，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、組織侵襲及轉(zhuǎn)移[6]。文獻(xiàn)報(bào)道其在多種類型腫瘤中均有表達(dá)下調(diào)，如肝癌[7]、直腸癌[8]、前列腺癌[9]等。本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)檢測(cè)AKAP12在HER2陽(yáng)性乳腺癌中的表達(dá)，探討AKAP12表達(dá)與HER2陽(yáng)性乳腺癌臨床病理因素及臨床預(yù)后關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 UALCAN分析

UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)（ualcan.path.uab.edu/）是一個(gè)TCGA在線分析網(wǎng)站，主要用于分析乳腺癌組織和正常組織中AKAP12基因表達(dá)水平。

1.2 臨床資料

選取2013年1月—2018年12月期間手術(shù)經(jīng)病理確診的120例HER2陽(yáng)性乳腺癌組織、距腫瘤>5 cm的正常乳腺組織及8例乳腺癌轉(zhuǎn)移灶組織。所有患者術(shù)前未接受放療、化療及內(nèi)分泌治療且病歷資料完整。120例HER2陽(yáng)性乳腺癌患者年齡26～87歲，平均年齡57±11.1歲。其中≤51歲有31例（25.8%），>51歲有89例（74.2%）；未絕經(jīng)32例（26.7%），已絕經(jīng)88例（73.3%）；腫瘤直徑≤2 cm 49例（40.8%），腫瘤直徑>2 cm 71例（59.2%）；有腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移55例（45.8%），無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移65例（54.2%）；AJCC（第八版）TNM分期為Ⅰ期33例（27.5%），Ⅱ+Ⅲ期87例（72.5%）；組織學(xué)分級(jí)為Ⅰ+Ⅱ級(jí)44例（36.7%），Ⅲ級(jí)76例（63.3%）；伴脈管浸潤(rùn)24例（20.0%），未見(jiàn)脈管浸潤(rùn)96例（80.0%）；術(shù)后輔助化療治療94例（78.3%），未行化療治療26例（21.7%）；行術(shù)后輔助放射治療15例（12.5%），未行放射治療105例（87.5%）。所有患者術(shù)前簽署手術(shù)知情同意書(shū)，切除標(biāo)本由本院保存，并可能用于科學(xué)研究。

1.3 主要試劑來(lái)源

兔抗人AKAP12多克隆抗體購(gòu)自Abcam公司，工作濃度為1:50。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗購(gòu)自上海生工生物科技有限公司，工作濃度為1:200、檸檬酸-EDTA抗原修復(fù)液（40×）、PBS緩沖液、DAB顯色試劑盒均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.4 免疫組織化學(xué)

采用免疫組織化學(xué)SP法，所有組織標(biāo)本常規(guī)用10%甲醛固定、石蠟包埋，制成3 μm組織切片。選定一抗工作濃度為1:50，二甲苯脫蠟兩次，水化（依次經(jīng)過(guò)100%、90%、80%、70%各5 min），改進(jìn)型檸檬酸抗原修復(fù)液煮沸2 h，過(guò)氧化氫滅活過(guò)氧化氫酶處理10 min，3%BSA封閉1 h，一抗4℃孵育過(guò)夜，二抗孵育1 h，DAB顯色10 min，蘇木精對(duì)比染色2 min，0.5%鹽酸酒精分化數(shù)秒，依次經(jīng)過(guò)梯度酒精脫水（70%、80%、90%、100%各10 s）。以PBS緩沖液替代一抗作空白對(duì)照，已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.5 陽(yáng)性結(jié)果判定

采用半定量積分法判斷結(jié)果：高倍鏡下隨機(jī)選取3個(gè)腫瘤區(qū)域，分別計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分率及染色強(qiáng)度，最終取平均值。陽(yáng)性細(xì)胞百分率：0分：無(wú)陽(yáng)性著色；1分>0～25%；2分>25%～50%；3分>50%～75%；4分>75%。染色強(qiáng)度：0分無(wú)陽(yáng)性著色；1分淺黃色；2分深黃色；3分棕黃色。染色指數(shù)=陽(yáng)性細(xì)胞百分比×著色強(qiáng)度，最小值0分，最大值12分。≥6分為高表達(dá)；<6分為低表達(dá)。

1.6 Bc-GenExMiner v4.4數(shù)據(jù)庫(kù)分析

Bc-GenExMiner v4.4（breast cancer geneexpression miner v4.4）用于分析AKAP12 mRNA表達(dá)與HER2陽(yáng)性乳腺癌預(yù)后關(guān)系，以中位數(shù)為界，>中位數(shù)為高表達(dá)，≤中位數(shù)為低表達(dá)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS23.0和GraphPad Grism7.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有資料采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用雙尾檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AKAP12 mRNA在乳腺癌組織及癌旁組織中的表達(dá)

UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果顯示：與正常組織相比，HER2陽(yáng)性乳腺癌組織中AKAP12 mRNA低表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=1.624E-12），見(jiàn)圖1。

2.2 AKAP12在HER2陽(yáng)性乳腺癌組織及癌旁組織中的表達(dá)

AKAP12主要分布于細(xì)胞質(zhì)中，部分間質(zhì)可見(jiàn)，見(jiàn)圖2。排除部分有組織缺失、折疊及含有<15%的乳腺上皮細(xì)胞，最終用于評(píng)分的癌組織和癌旁組織各有120例和84例，其中癌組織和癌旁組織AKAP12高表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.123,P=0.042），見(jiàn)表1。

圖1 AKAP12 mRNA在乳腺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)Figure 1 Expression of AKAP12 mRNA in breast cancer and para-carcinoma tissues

表1 AKAP12在HER2陽(yáng)性乳腺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)Table 1 AKAP12 expression in HER2-positive breast cancer and para-cancerous tissues

2.3 AKAP12在HER2陽(yáng)性乳腺癌轉(zhuǎn)移灶組織中的表達(dá)

HER2陽(yáng)性乳腺癌轉(zhuǎn)移灶中，AKAP12高表達(dá)與其相對(duì)應(yīng)癌組織比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.041），見(jiàn)表2。

2.4 AKAP12表達(dá)與HER2陽(yáng)性乳腺癌患者臨床病理因素關(guān)系

HER2陽(yáng)性乳腺癌中，AKAP12表達(dá)與患者年齡、月經(jīng)狀況、組織學(xué)分級(jí)、脈管浸潤(rùn)、有無(wú)腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、術(shù)后輔助放化療與否均無(wú)相關(guān)性（均P>0.05），而與腫瘤大小和TNM分期相關(guān)，腫瘤體積越大陽(yáng)性率越低；TNM分期高者，其陽(yáng)性率越低（均P<0.05），見(jiàn)表3。

表2 8例HER2陽(yáng)性乳腺癌組織和轉(zhuǎn)移灶中AKAP12表達(dá)情況Table 2 AKAP12 expression in 8 cases of HER2-positive breast cancer and metastases tissues

2.5 AKAP12 mRNA表達(dá)與HER2陽(yáng)性乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系

采用Bc-GenExMiner v4.4數(shù)據(jù)庫(kù)繪制生存曲線發(fā)現(xiàn)，在HER2陽(yáng)性乳腺癌中，AKAP12 mRNA低表達(dá)患者總生存率顯著低于高表達(dá)者（P=0.0288），見(jiàn)圖3。

2.6 AKAP12表達(dá)與HER2陽(yáng)性乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系

在HER2陽(yáng)性乳腺癌中，AKAP12低表達(dá)患者生存率低于高表達(dá)者（P=0.020），見(jiàn)圖4。

2.7 影響HER2陽(yáng)性乳腺癌患者預(yù)后因素

單因素分析和多因素Cox回歸分析證實(shí)脈管浸潤(rùn)（P=0.028）、AKAP12表達(dá)（P=0.028）及放射治療（P=0.047）是影響HER2陽(yáng)性乳腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，見(jiàn)表4。

3 討論

圖2 AKAP12在HER2陽(yáng)性乳腺癌癌組織和癌旁組織中的表達(dá) (SP ×200)Figure 2 AKAP12 expression in HER2-positive breast cancer and para-cancerous tissues (SP ×200)

表3 AKAP12表達(dá)與HER2陽(yáng)性乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系Table 3 Relation between AKAP12 expression and clinicopathological features in HER2-positive breast cancer patients

圖3 AKAP12 mRNA表達(dá)與HER2陽(yáng)性乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系Figure 3 Correlation of AKAP12 mRNA expression with survival of HER2-positive breast cancer patients

圖4 AKAP12表達(dá)與HER2陽(yáng)性乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系Figure 4 Correlation of AKAP12 expression with survival of HER2-positive breast cancer patients

表4 Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析影響HER2陽(yáng)性乳腺癌患者OS的因素Table 4 Multivariate Cox regression analysis of influence factors for OS of HER2-positive breast cancer patients

AKAP12作為A激酶錨定蛋白家族成員之一，1992年由Gelman等在重癥肌無(wú)力患者血清中發(fā)現(xiàn)，該家族是一類細(xì)胞骨架蛋白，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、細(xì)胞存活及侵襲信號(hào)通路激活[6]。AKAP12基因定位于6q24-25.2，據(jù)GeneCard數(shù)據(jù)庫(kù)（www.genecards.org/）數(shù)據(jù)顯示正常情況下AKAP12在各類型組織中廣泛表達(dá)。近年文獻(xiàn)報(bào)道AKAP12在多種惡性腫瘤中表達(dá)下調(diào)，如肝癌、直腸癌、前列腺癌等，且其低表達(dá)與腫瘤細(xì)胞增殖快、易遷移侵襲有關(guān)，提示患者預(yù)后不良[10]。Parade等[11]研究表明AKAP12可抑制良性腦膜瘤細(xì)胞侵襲遷移，干擾SF4433細(xì)胞中AKAP12表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞周期失控、增殖、遷移和侵襲。另有研究發(fā)現(xiàn)胰腺癌實(shí)質(zhì)細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中AKAP12表達(dá)下調(diào)，其低表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移形成[12]。有學(xué)者采用RT-PCR研究發(fā)現(xiàn)肝癌組織中AKAP12 mRNA表達(dá)下調(diào)，多因素分析證實(shí)AKAP12低表達(dá)是肝癌獨(dú)立預(yù)后危險(xiǎn)因素[7]。Xie等[9]探討前列腺癌組織AKAP12 mRNA表達(dá)與臨床參數(shù)關(guān)系，研究認(rèn)為AKAP12低表達(dá)與Gleason高評(píng)分有關(guān)。Liu等[8]等采用免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)直腸癌組織中AKAP12的表達(dá)水平，結(jié)直腸癌組織中AKAP12低表達(dá)與腫瘤高分期及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，低表達(dá)HDAC3通過(guò)上調(diào)AKAP12調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路和減少抗凋亡蛋白bcl-2表達(dá)，抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。這一結(jié)果與皮膚鱗狀細(xì)胞癌一項(xiàng)研究相似，該研究認(rèn)為皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系和癌組織中AKAP12顯著下調(diào)，進(jìn)一步分析證實(shí)癌組織中AKAP12與腫瘤分期呈負(fù)相關(guān)[13]。以上研究均表明AKAP12是一種潛在腫瘤抑制基因，其低表達(dá)與多種類型腫瘤惡性進(jìn)展及預(yù)后差有關(guān)，也有研究認(rèn)為AKAP12高表達(dá)與腫瘤不良預(yù)后有關(guān)，周西漢等[14]通過(guò)RT-PCR檢測(cè)胃癌組織中AKAP12表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)與癌旁組織相比，胃癌組織AKAP12高表達(dá)與腫瘤高侵襲性生物性行為及預(yù)后差有關(guān)。Bateman等[15]研究卵巢癌AKAP12高表達(dá)與紫杉醇耐藥正相關(guān)，認(rèn)為AKAP12可作為卵巢癌的預(yù)后預(yù)測(cè)獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素。

本研究結(jié)果顯示，AKAP12在乳腺癌中表達(dá)下調(diào)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)在HER2陽(yáng)性乳腺癌中，AKAP12與腫瘤大小、TNM分期有關(guān)。AKAP12或與HER2陽(yáng)性乳腺癌進(jìn)展有關(guān)。Bc-GenExMiner v4.4數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)AKAP12 mRNA低表達(dá)患者總生存率顯著低于高表達(dá)患者（P=0.0288）。與此同時(shí)，AKAP12蛋白低表達(dá)患者總生存率顯著低于高表達(dá)者（P=0.020），單因素及多因素Cox回歸風(fēng)險(xiǎn)模型分析證實(shí)AKAP12表達(dá)、脈管浸潤(rùn)及放射治療是影響HER2陽(yáng)性乳腺癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。綜上，AKAP12低表達(dá)可能與患者預(yù)后差有關(guān)。Zhang等[16]利用GEO數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)乳腺癌中有254個(gè)差異表達(dá)基因，其中AKAP12作為miR-183-5p的靶基因顯著下調(diào)，Kaplan-Meier plotter在線數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)AKAP12 mRNA高表達(dá)患者總生存率顯著延長(zhǎng)。Soh等[17]采用Western blot法證實(shí)與乳腺正常上皮MCF10A相比，乳腺癌細(xì)胞系中AKAP12下降，敲除AKAP12基因發(fā)現(xiàn)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞遷移侵襲能力增加。以上研究均表明AKAP12低表達(dá)或與乳腺癌進(jìn)展有關(guān)。

綜上所述，HER2陽(yáng)性乳腺癌中AKAP12表達(dá)與腫瘤大小及TNM分期有關(guān)，AKAP12是影響HER2陽(yáng)性乳腺癌預(yù)后獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素，有望成為HER2陽(yáng)性乳腺癌預(yù)后預(yù)測(cè)的生物學(xué)標(biāo)志物。