張九娜，翟山，李校天

0 引言

食管鱗癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率高并且嚴(yán)重威脅人類生命健康的消化道惡性腫瘤之一，我國(guó)是世界上食管鱗癌新發(fā)病例最多的國(guó)家，男性明顯多于女性。2018年中國(guó)癌癥流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)顯示食管鱗癌在男性最常見(jiàn)的癌癥中位居第5位（9.0%）[1]。眾所周知，食管鱗癌預(yù)后差、病死率高，并且近年來(lái)發(fā)病率有逐漸升高的趨勢(shì)，但是其發(fā)病機(jī)制尚不清楚。大量研究表明，皮層肌動(dòng)蛋白（cortactin,CTTN）能調(diào)控多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，如乳腺癌[2]、膀胱癌[3]、頭頸部鱗癌[4]等。在我們的前期研究[5]中發(fā)現(xiàn)CTTN不僅在食管鱗癌中高表達(dá)而且與患者的病理分期、不良預(yù)后明顯相關(guān)。因此本研究通過(guò)敲低和過(guò)表達(dá)CTTN，探討其對(duì)食管鱗癌細(xì)胞增殖和凋亡以及PI3K-AKT的影響，旨在闡明CTTN調(diào)控食管鱗癌的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系 人食管鱗癌細(xì)胞系EC109、TE1購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.1.2 裸鼠 本課題所用的荷瘤模型均為5～6周齡健康雄性BALB/c裸鼠，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司（許可證號(hào)：SCXK（冀）1403088），由河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心專職人員負(fù)責(zé)飼養(yǎng)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程符合中華人民共和國(guó)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》及倫理要求。

1.1.3 慢病毒 過(guò)表達(dá)及干擾CTTN的慢病毒載體由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司構(gòu)建。過(guò)表達(dá)CTTN的慢病毒采用LV17載體，元件順序?yàn)镋F-1a-CMVluci17-T2A-puromycin，插入載體序列：GGCGAA TTCTGATGTGGAAAGCCTCTGC。干擾CTTN的慢病毒采用LV16（U6/Luciferase17&Puro）載體，元件為U6-CMV-/Luc17-T2A-puromycin，插入序列CCATGGCT ATGGAGGGA AATT。兩載體的對(duì)照載體插入序列均為：TTCTCCGAACGTGTCACGT。

1.1.4 主要試劑及抗體 RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶-EDTA溶液、青鏈霉素購(gòu)自美國(guó)Gibco BRL公司。高效RIPA組織/細(xì)胞裂解液、磷酸酶抑制劑盒4×蛋白上樣緩沖液均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。CCK-8試劑盒購(gòu)自東仁化學(xué)科技（上海）有限公司。兔抗CTTN、PCNA、cleaved-PARP、β-actin單克隆抗體均購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。兔抗cleaved-Caspase3單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。小鼠抗p-PI3K、p-AKT單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)CST公司。兔抗PI3K、AKT多克隆抗體均購(gòu)自上海斯信生物科技有限公司。熒光標(biāo)記的羊抗兔二抗、熒光標(biāo)記的羊抗小鼠二抗均購(gòu)自美國(guó)LI-COR公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、傳代及凍存 EC109、TE1置于含10%FBS、100 u/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中，在5%CO2孵箱中37℃恒溫培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%融合度時(shí)，常規(guī)胰酶消化、傳代，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。暫時(shí)不用的細(xì)胞按常規(guī)流程予以凍存。

1.2.2 慢病毒感染實(shí)驗(yàn)及穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選 在食管鱗癌細(xì)胞E C 109、T E 1 中敲低、過(guò)表達(dá)CTTN：根據(jù)上海吉瑪公司提供的慢病毒使用說(shuō)明書進(jìn)行細(xì)胞慢病毒感染及后續(xù)嘌呤霉素的篩選穩(wěn)定細(xì)胞株。EC109、TE1分別分為四組：過(guò)表達(dá)組（LV-CTTN）、對(duì)照組（LV-NC）和敲低組（LVsh-CTTN）、對(duì)照組（LV-sh-NC）。經(jīng)嘌呤霉素篩選后的穩(wěn)定細(xì)胞檢測(cè)過(guò)表達(dá)和抑制效果。

1.2.3 Western blot檢測(cè) 常規(guī)收集細(xì)胞、提取總蛋白，為防止磷酸化蛋白的降解，細(xì)胞裂解液中需添加PMSF和磷酸酶抑制劑。蛋白采用BCA法定量后組間稀釋成相同的合適濃度，加4×上樣Buffer 95℃加熱8 min。根據(jù)蛋白分子量制作合適濃度的SDS-PAGE膠，上樣，電泳，采用PVDF膜濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，后5%脫脂奶粉封閉PVDF膜。根據(jù)抗體說(shuō)明書用TBST稀釋一抗：cleaved-PARP（1:1000）、PCNA（1:3000）、cleaved-Caspase3（1:200）、p-PI3K（1:500）、PI3K（1:1000）、p-AKT（1:500）、AKT（1:800）、β-actin（1:5000），PVEF膜在稀釋的一抗中4℃孵育過(guò)夜。熒光二抗用TBST按1:20000稀釋，室溫避光孵育1 h，最后采用Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描。

1.2.4 CCK-8實(shí)驗(yàn) 篩選好的EC109、TE1的穩(wěn)定細(xì)胞株按以上分組接種于96孔板，先饑餓細(xì)胞（無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)）12。后分別在0、24、48、72和96 h加入CCK-8試劑，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育3 h。用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm 處的吸光度（OD）。

1.2.5 平板克隆形成實(shí)驗(yàn) 將篩選后的穩(wěn)定細(xì)胞株按以上分組接種于6孔板中，每孔1000個(gè)細(xì)胞，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的克隆時(shí)，終止培養(yǎng)，4%甲醛固定10 min，后Giemsa染液染色20 min，最后流水沖洗，空氣干燥。肉眼計(jì)數(shù)克隆數(shù)。

1.2.6 軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn) 將篩選后的穩(wěn)定細(xì)胞株按以上分組消化離心后用2×完全培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×103個(gè)/毫升。底層瓊脂的配制：以1:1的比例混合1.2%的瓊脂和2×完全培養(yǎng)基，含細(xì)胞的上層瓊脂的配制：以1:1的比例混合0.6%的瓊脂和上述制備好的單細(xì)胞懸液，待上層瓊脂凝固后，放入孵箱培養(yǎng)。2周后計(jì)數(shù)克隆數(shù)。

1.2.7 裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn) 選用5～6周齡、18～20 g雄性BALB/c裸鼠10只，隨機(jī)分為兩組：EC109細(xì)胞LVsh-NC組和LV-sh-CTTN組，每組5只；將兩組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EC109細(xì)胞懸液0.2 ml（1×107個(gè)）接種于裸鼠右側(cè)腋下皮膚，待腫瘤出現(xiàn)后，用游標(biāo)卡尺測(cè)量記錄兩組裸鼠皮下腫瘤體積的變化（每2天測(cè)量1次，共2周），腫瘤體積V=a×b2×1/6π，a為腫瘤最長(zhǎng)徑，b為最短徑。以每組動(dòng)物移植瘤體積的均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)繪制移植瘤生長(zhǎng)曲線。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料首先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)性檢驗(yàn)的以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。兩組不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞相對(duì)增殖率、移植瘤體積大小比較采用雙因素方差分析（two-way ANOVA）。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒感染過(guò)表達(dá)、敲低CTTN效果的驗(yàn)證

Western blot結(jié)果顯示EC109、TE1細(xì)胞過(guò)表達(dá)組（LV-CTTN組）的CTTN表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組（LV-NC組）（8.38±0.28vs.4.08±0.35,7.39±0.29vs.3.39±0.31,P=4.12E-04,P=2.28E-04），見(jiàn)圖1A；EC109、TE1細(xì)胞敲低組（LV-sh-CTTN組）的CTTN表達(dá)水平均顯著低于對(duì)照組（LV-sh-NC組）（1.07±0.16vs.4.16±0.26,0.84±0.14vs.3.46±0.27,P=6.56E-04,P=5.87E-04），見(jiàn)圖1B。

2.2 CTTN通過(guò)PI3K-AKT通路促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞的增殖、抑制其凋亡

2.2.1 CTTN通過(guò)上調(diào)PI3K-AKT通路促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞增殖抑制其凋亡 Western blot結(jié)果顯示，兩種食管鱗癌細(xì)胞系的LV-CTTN組與其各自LV-NC組相比，細(xì)胞核增殖抗原PCNA、PI3KAKT通路的關(guān)鍵蛋白p-PI3K、p-AKT均明顯升高（P=4.143E-04,P=3.11E-04,P=2.15E-04），而凋亡標(biāo)志蛋白cleaved-Caspase3、cleaved-PARP的表達(dá)明顯降低（P=1.14E-04,P=2.34E-04），見(jiàn)圖2A、C；與LV-sh-NC組相比，兩種食管鱗癌細(xì)胞系的LV-sh-CTTN組PCNA、p-PI3K、p-AKT表達(dá)均顯著下降（P=3.36E-04,P=1.98E-04,P=3.11E-04），同時(shí)cleaved-Caspase3、cleaved-PARP代表凋亡的蛋白表達(dá)明顯升高（P=1.78E-04,P=3.61E-04），見(jiàn)圖2B、D。

2.2.2 CTTN提高食管鱗癌細(xì)胞生長(zhǎng)活力 CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，兩種食管鱗癌細(xì)胞系EC109、T E1的LV-CTT N 組較其各自LV-NC組細(xì)胞活力均明顯升高（P=9.5E-04，P=8.7E-03）；與相應(yīng)對(duì)照組相比，敲低C T T N 能顯著降低兩種食管鱗癌細(xì)胞系E C 109、T E 1 的細(xì)胞活力（P=8.3E-04,P=6.9E-03），見(jiàn)圖3。

圖1 慢病毒LV-CCTN、LV-sh-CCTN在食管鱗癌細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)(A)、敲低CTTN(B)Figure 1 Cortactin(CTTN) was overexpressed(A) and down-regulated(B) by lentivirus LV-CCTN and LV-sh-CCTN in ESCC cell lines

2.2.3 CTTN促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞克隆形成 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)反映細(xì)胞增殖，結(jié)果顯示：兩種食管鱗癌細(xì)胞系EC109、TE1的LV-NC組的細(xì)胞克隆數(shù)分別為39.50±1.90、28.80±2.310，而LV-CTTN組形成的克隆數(shù)分別為83.50±1.80、63.2±1.50，顯著高于對(duì)照組（P=9.32E-05,P=8.21E-04）；兩種食管鱗癌細(xì)胞系EC109、TE1的LV-sh-CTTN組的細(xì)胞克隆數(shù)分別為15.50±1.00、13.5±1.90，明顯低于LVsh-NC組42.00±2.40、29.80±2.30，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=5.78E-04,P=3.41E-04），見(jiàn)圖4A。

軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)評(píng)估腫瘤細(xì)胞在動(dòng)物細(xì)胞的成瘤性，結(jié)果顯示：兩種食管鱗癌細(xì)胞系EC109、TE1的LV-NC組的細(xì)胞克隆數(shù)分別為35.30±5.60、29.00±2.89，而LV-CTTN組形成的克隆數(shù)分別為66.50±2.90、59.00±3.00，顯著高于對(duì)照組（P=2.81E-04,P=3.61E-04）；兩種食管鱗癌細(xì)胞系EC109、TE1的LV-sh-CTTN組的細(xì)胞克隆數(shù)分別為13.50±1.87、12.00±1.40，明顯低于LV-sh-NC組29.80±3.30、28.8±1.63，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=1.92E-04,P=1.87E-04），見(jiàn)圖4B。

圖2 過(guò)表達(dá)CTTN通過(guò)PI3K-AKT通路促進(jìn)EC109、TE1細(xì)胞增殖和凋亡(A,C)，敲低CTTN可通過(guò)PI3K-AKT通路抑制EC109、TE1細(xì)胞增殖和凋亡(B,D)Figure 2 Effect of CTTN overexpression(A,C) and knockdown(B,D) on proliferation and apoptosis of EC109 and TE1 cells through PI3K-AKT pathway

圖3 CTTN的表達(dá)水平調(diào)控食管鱗癌細(xì)胞系的細(xì)胞活力Figure 3 Effect of CTTN expression on viability of ESCC cell lines

2.3 敲低CTTN抑制裸鼠EC109細(xì)胞皮下移植瘤生長(zhǎng)

基于以上體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果，為進(jìn)一步驗(yàn)證CTTN促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，我們應(yīng)用裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)觀察敲低CTTN對(duì)裸鼠EC109細(xì)胞皮下種植瘤生長(zhǎng)的影響。LV-sh-CTTN組裸鼠平均腫瘤體積明顯小于LV-sh-NC組（P=6.42E-04），見(jiàn)圖5。

3 討論

CTTN是重要的腫瘤調(diào)控分子，在多種腫瘤中存在高表達(dá)。CTTN易發(fā)生酪氨酸和絲氨酸/蘇氨酸磷酸化，磷酸化的CTTN促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲性偽足成熟和細(xì)胞外基質(zhì)的降解，進(jìn)而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，CTTN這種生物學(xué)功能近年來(lái)已在大量研究中得到證實(shí)。例如，有研究報(bào)道CTTN通過(guò)上調(diào)細(xì)胞分裂因子1促進(jìn)結(jié)腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。CTTN在ATM激酶的介導(dǎo)下發(fā)生磷酸化和聚合進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移[6]。CTTN這種生物學(xué)功能在非小細(xì)胞肺癌[7]中也得到了證實(shí)。但是CTTN能否促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖并抑制凋亡在不同的腫瘤中結(jié)論不一致。先前有研究報(bào)道在NIH3T3細(xì)胞中過(guò)表達(dá)CTTN能促進(jìn)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和遷移能力但并不能促進(jìn)細(xì)胞增殖。然而最近在肝癌和膠質(zhì)瘤中發(fā)現(xiàn)CTTN不僅能促進(jìn)細(xì)胞增殖而且抑制細(xì)胞凋亡[8-9]。

圖4 CTTN的表達(dá)水平調(diào)控ESCC細(xì)胞系的克隆形成Figure 4 Effect of CTTN expression on colony formation of ESCC cell lines

圖5 敲低CTTN可抑制裸鼠EC109細(xì)胞皮下移植瘤生長(zhǎng)Figure 5 CTTN knockdown suppressed growth of transplant subcutaneous tumor of EC109 cells in nude mice

PCNA反映細(xì)胞DNA合成狀態(tài)，因此常用作反映細(xì)胞增殖的指標(biāo)[10]。Caspase3[11]介導(dǎo)蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)引起的細(xì)胞程序化死亡是細(xì)胞凋亡最重要的途徑。Caspase3的底物包括Caspase3自身、PARP（poly ADP-ribose polymerase）、DNA依賴的蛋白激酶以及細(xì)胞因子等，Caspase3通過(guò)水解這些底物傳導(dǎo)凋亡信號(hào)，引發(fā)細(xì)胞凋亡。PARP是與DNA修復(fù)密切相關(guān)的一種酶，在體外可以被多種Caspase剪切，在體內(nèi)是Caspase3的主要剪切對(duì)象。因此cleaved-Caspase3、cleaved-PARP可以作為反映凋亡的標(biāo)志蛋白，同時(shí)cleaved-PARP也可以作為Caspase3激活的指標(biāo)[12]。本研究結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)CTTN不僅能提高細(xì)胞PCNA表達(dá)水平，提升細(xì)胞活力，而且增加細(xì)胞克隆形成；反之，敲低CTTN后PCNA表達(dá)水平、細(xì)胞活力受到抑制，同時(shí)抑制細(xì)胞克隆的形成以及裸鼠皮下種植瘤的生長(zhǎng)。綜合評(píng)估，結(jié)果均顯示CTTN促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞增殖，抑制凋亡。

PI3K-AKT通路調(diào)控多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[13]，是經(jīng)典的細(xì)胞通路，發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制凋亡、促進(jìn)血管生成、促進(jìn)侵襲轉(zhuǎn)移以及抗化療等廣泛作用。在本課題中，與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)CTTN上調(diào)PI3K-AKT通路的關(guān)鍵蛋白p-PI3K、p-AKT的表達(dá)水平，同時(shí)與對(duì)照組相比，敲低CTTN抑制p-PI3K、p-AKT的表達(dá)提示CTTN通過(guò)上調(diào)PI3K-AKT通路促進(jìn)食管鱗癌的增殖并抑制凋亡。表明針對(duì)CTTN的拮抗劑如siRNA或者抑制劑有望成為食管鱗癌精準(zhǔn)治療的新靶點(diǎn)。

綜上所述，本研究從細(xì)胞水平和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探究了CTTN對(duì)食管鱗癌增殖和凋亡方面的作用及機(jī)制，但在食管鱗癌中CTTN是否還發(fā)揮其他生物學(xué)作用，還有待進(jìn)一步探討。