王春，禹立霞，王立峰，錢漢清，嚴(yán)英慈，王欣玥，李茹恬

0 引言

順鉑（CDDP）是目前臨床最常用的廣譜抗腫瘤藥物之一[1]。近幾年，隨著腫瘤靶向治療和免疫治療的發(fā)展，順鉑也成為化療聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療[2]和化療聯(lián)合表皮生長因子受體抑制劑治療[3]中最常用的聯(lián)合化療藥物之一，依舊是腫瘤全身治療不可或缺的部分。順鉑引起的不良反應(yīng)包括消化道毒性、腎毒性、骨髓抑制等。為了降低順鉑的毒性使它更好地發(fā)揮療效，近年來，隨著藥物投遞系統(tǒng)的發(fā)展，出現(xiàn)了一些負(fù)載順鉑的藥物投遞系統(tǒng)，如順鉑-白蛋白微球[4]、脂質(zhì)體[5]、順鉑-PLGA微球[6]等。在眾多的藥物載體中，高分子納米載體由于可以顯著改變藥物的分布和代謝，提高療效、降低不良反應(yīng)，受到越來越多的關(guān)注。但是，新型載體的相關(guān)研究仍不夠深入細(xì)致，例如納米載體的配比結(jié)構(gòu)和藥物投遞系統(tǒng)性質(zhì)關(guān)系的研究，目前少有報(bào)道[7]。

納米載體的結(jié)構(gòu)比例，尤其是它的相對分子質(zhì)量和親水/疏水比，已被認(rèn)可為可以影響納米載體的功能和性質(zhì)[8]。傳統(tǒng)上通過在開環(huán)聚合反應(yīng)時控制PEG的分子量以及PEG和PCL的比例來合成各種不同親水/疏水比例的納米載體。我們前期采取了一種簡單的方法，通過混合末端帶有羥基的HO-PCL和已有的PEG-PCL，使HO-PCL進(jìn)入納米粒子的疏水內(nèi)核達(dá)到近似增加PCL疏水鏈長度的目的，從而調(diào)整納米粒子的親水/疏水比。這種簡單混合不涉及有機(jī)化學(xué)反應(yīng)，替代了傳統(tǒng)的高溫、高能量、高有機(jī)污染的開環(huán)聚合反應(yīng)，具有良好的應(yīng)用前景[9]。本研究主要探討5種配比型mPEGPCL順鉑納米粒子的生物相容性及其體外抗腫瘤作用，探討載體結(jié)構(gòu)與抗腫瘤療效之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

85-2型恒溫磁力攪拌器（常州國華儀器廠），核磁共振波譜儀（Bruker AM-300，德國），冷凍干燥機(jī)（FreeZone6型，Labconcon，美國），244型凝膠滲透色譜儀（Waters GPC244，美國），紫外分光光度計(jì)（UV3100，Shimadzu，日本），恒溫槽（ELLY4，TOKYO Rikaaikai，日本），BI-90plus型激光粒度儀（Brookheaven，美國），酶標(biāo)儀（ELX800 Biotek，美國），超聲波細(xì)胞破碎儀（XL2000型，Misonix，美國），真空干燥箱（DZF-6020型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

單甲氧基聚乙二醇（mPEG，相對分子質(zhì)量4000）（威爾化工，南京），使用前50℃下真空干燥24 h；ε-己內(nèi)酯（ε-CL）（Fluka，美國），使用前用CaH2干燥后減壓蒸餾；順鉑（山東鉑源化學(xué)有限公司），聚乙烯醇（PVA，醇解度88%，聚合度500，山東東倉國際貿(mào)易有限公司），胎牛血清、牛血清白蛋白、MTT（Amersen，美國），RPMI 1640培養(yǎng)液（Gibco，美國），辛酸亞錫（Sigma，美國）；無水乙醚、乙醇、N，二氯甲烷（DCM），N-二甲基酰胺（DMF），氯化鈉、甘露醇及其他分析純試劑使用前均未作特殊處理。透析袋（截留分子量12000，Sorua，德國）。人胃癌細(xì)胞株BGC-823、SGC-7901均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1.2 mPEG-PCL兩嵌段聚合物及HO-PCL的制備

參考文獻(xiàn)[10]，通過開環(huán)聚合法制備mPEG-PCL兩嵌段共聚物，在裝有適量mPEG的聚合管中加入0.1%（w/w）的辛酸亞錫以及計(jì)算量的ε-CL。在真空下封管置于130℃油浴反應(yīng)48 h。反應(yīng)得到的粗產(chǎn)物用二氯甲烷溶解后，沉淀于大量無水乙醚中以除去未反應(yīng)的單體及其他低相對分子質(zhì)量物質(zhì)。收集沉淀并洗滌數(shù)次后減壓干燥，得到mPEG-PCL兩嵌段聚合物。用同樣的方法，將少量水和ε-CL辛酸亞錫混合反應(yīng)，得到HO-PCL聚合物。

1.3 負(fù)載CDDP的納米粒子的制備

參考文獻(xiàn)[9]，采用改進(jìn)的雙乳劑法制備負(fù)載順鉑的載藥納米粒子。將含有順鉑5 mg/ml的水溶液200 μl作為內(nèi)水相滴入1 ml DCM中（內(nèi)含表1所示不同比例的mPEG-PCL），形成的乳液加入3 ml 5%PVA溶液中，進(jìn)行超聲（17.5 W，30 s）乳化，將制成的w/o/w雙乳進(jìn)一步分散在8 ml含有0.9%NaCl和1%PVA的溶液中，室溫下攪拌2 h，將得到的液體用慢速濾紙過濾后在純水中透析2 h以除去未包裹的藥物?？瞻琢Ｗ拥闹苽?，除內(nèi)水相不加入藥物外，其余方法同上。上述液體按3%（w/w）的比例加入甘露醇后，冷凍干燥72 h，避光貯存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

表1 不同納米微球的配比Table 1 Proportions of different nanoparticles (NPs)

1.4 負(fù)載CDDP的納米粒子的表征

1.4.1 HO-PCL共聚物的1H-NMR、GPC測試 以CDCl3為溶劑，聚合物的相對分子質(zhì)量以及化學(xué)組成通過1H-NMR圖譜中對應(yīng)于PCL和PEG上質(zhì)子峰的積分強(qiáng)度計(jì)算得到。另外，聚合物的相對分子質(zhì)量還通過GPC進(jìn)行測定（30℃，溶劑為四氫呋喃，流速1 ml/min，以標(biāo)準(zhǔn)苯乙烯樣品作為基準(zhǔn)）。

1.4.2 載藥量與載藥效率測定 采用SnCl2比色法測定載藥粒子中順鉑的含量：取30 mg左右載藥粒子凍干粉，溶于200 μl純水并于80℃干燥，將殘留物溶于200 μl DMF后，得到的溶液取100 μl，和等量的2 mmol/L鹽酸混合，再加入2 mmol/L鹽酸溶液、0.2 mmol/L的SnCl2共9.8 ml，反應(yīng)1 h后，通過紫外分光光度法在403 nm處測定其吸光度值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求溶液中順鉑的含量。根據(jù)以下公式計(jì)算載藥量和載藥效率：

載藥量（%）=順鉑質(zhì)量/（順鉑質(zhì)量+高分子質(zhì)量）× 100%

載藥效率（%）=順鉑實(shí)際質(zhì)量/順鉑的投料量×100%

1.4.3 粒子粒徑測定 納米粒子的粒徑通過動態(tài)光散射法測定，BI-90plus型激光粒度儀測試均測3次結(jié)果取平均值。

1.5 負(fù)載CDDP納米微球的體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

分別檢測順鉑單藥、負(fù)載順鉑的納米粒子以及空白納米粒子對人胃癌細(xì)胞株BGC-823、SGC-7901的體外細(xì)胞毒作用。采用MTT法測定細(xì)胞的增殖。以5×103每孔的密度將細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，培養(yǎng)液為含10%小牛血清的RPMI 1640。96孔板置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中全濕度培養(yǎng)24 h后，吸出培養(yǎng)液，按照2倍濃度梯度，每孔加入200 μl含順鉑單藥、不同載藥納米粒子或空白微球的培養(yǎng)液，每種納米微球設(shè)3個復(fù)孔。另設(shè)12個孔為空白，加入不含微球或藥物的培養(yǎng)液200 μl。細(xì)胞置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后每孔加入1 mg/ml MTT（3-（4,5-dimethyl-2-thiazolyl）-2,5-diphenyl-2-Htetrazolium bromide,Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide）20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去上清液，每孔加入DMSO 200 μl。置于振蕩儀上充分混勻，采用酶標(biāo)儀，490 nm為測試波長，620 nm為參考波長，測量各孔吸光度計(jì)算細(xì)胞生長抑制率，各組腫瘤細(xì)胞抑制率按下列公式計(jì)算。

細(xì)胞活力（%）=OD實(shí)驗(yàn)孔/OD對照孔×100%，抑制率（%）=（1-細(xì)胞活力）× 100%。

1.6 載體的生物相容性評價

MTT法測定空白納米粒子對BGC-823及SGC-7901細(xì)胞生長的抑制作用，以評估載體的毒性。具體步驟同1.5。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 mPEG-PCL兩嵌段聚合物及HO-PCL的合成

通過開環(huán)聚合，合成了mPEG-PCL兩嵌段聚合物及末端含有羥基的PCL，聚合物及HO-PCL的表征參見文獻(xiàn)[11]。凝膠滲透色譜（gel permeation chromatography,GPC）法測得mPEG-PCL聚合物相對分子質(zhì)量為25826 g/mol，HO-PCL相對分子質(zhì)量為21038 g/mol，見表2。

2.2 mPEG-PCL/PCL納米微球的制備及表征

表2 共聚物的相對分子質(zhì)量[11]Table 2 Relative molecular mass of polymers[11]

通過雙乳劑法制備了負(fù)載CDDP的納米粒子，其粒徑測定結(jié)果參見文獻(xiàn)[9]，見表3，結(jié)果顯示納米粒子的直徑在300～350 nm左右，差別并不顯著?？瞻准{米微球中G3L1型和G2L2型粒徑最大，G4型和G1L3型粒徑受載藥影響最小。5種納米粒子的載藥量和載藥效率參見文獻(xiàn)[9]，見表4?？梢奊3L1型的載藥量和載藥效率最高，L4型載藥量和載藥效率最低，其余三者無明顯區(qū)別。體外釋放實(shí)驗(yàn)顯示5種納米粒子和CDDP裸藥相比均具有緩釋特征，能延長CDDP的作用時間，在保證CDDP作用前提下減少給藥劑量，減輕CDDP的不良反應(yīng)，提高CDDP的穩(wěn)定性，結(jié)果參見文獻(xiàn)[9]，見圖1。

表3 動態(tài)光散射測定粒徑[9]Table 3 Diameters and polydispersity of nanoparticles[9]

表4 不同配比的納米粒子載藥量和載藥效率[9]Table 4 Drug-loading capacities and efficiencies of different NPs[9]

圖1 CDDP裸藥和CDDP納米粒子體外釋放數(shù)據(jù)圖[9]Figure 1 In vitro release profile of free CDDP and CDDPloaded NPs[9]

2.3 納米微球的體外細(xì)胞毒性

納米藥物投遞系統(tǒng)本身具有的EPR效應(yīng)和長循環(huán)效應(yīng)，在腫瘤靶向性、提高藥物生物利用度、減輕不良反應(yīng)方面具有明顯優(yōu)勢。不同親水/疏水比例會改變mPEG-PCL納米粒子的結(jié)構(gòu)，影響藥物釋放速率和納米粒子攝取效率，最終可能影響抗腫瘤作用的差異[9,12]。

結(jié)果顯示，無論是CDDP裸藥還是CDDP納米粒子，其細(xì)胞毒性都隨著藥物濃度的增加而增長。低濃度時，CDDP納米粒子和CDDP裸藥的細(xì)胞毒作用相當(dāng)或略弱于CDDP裸藥，隨著藥物濃度的增高，CDDP納米粒子顯示出更強(qiáng)的作用，見圖2。

圖2 CDDP裸藥和CDDP納米粒子在不同濃度下對于BGC-823(A)和SGC-7901(B)細(xì)胞的毒性作用Figure 2 Cytotoxicity of free CDDP and five CDDP-loaded NPs to BGC-823(A) and SGC-7901(B) cells at different concentrations in vitro

對比上述5種納米粒子，其細(xì)胞毒性呈現(xiàn)一定的異質(zhì)性，在CDDP濃度中等時這種異質(zhì)性最為明顯。5種納米粒子對比CDDP裸藥在兩種不同腫瘤細(xì)胞中都表現(xiàn)出較好的細(xì)胞毒性，在BGC-823細(xì)胞株中除G3L1型外的表現(xiàn)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在SGC-7901中僅G2L2、G1L3和L4型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表5。其中G4、G3L1、G1L3型納米粒子的體外細(xì)胞毒性與載藥濃度呈較好的線性依賴關(guān)系，見表6。

表5 5種納米粒子與CDDP裸藥的體外細(xì)胞毒性比較的P值Table 5 P value of in vitro cytotoxicity of five kinds of NPs versus free CDDP

表6 5種納米粒子體外細(xì)胞毒性與藥物濃度的線性相關(guān)分析Table 6 Pearson related coefficient between cytotoxicity of five NPs and CDDP concentration

2.4 空白載體的毒性評價

空白納米粒子對不同細(xì)胞株均無明顯的生長抑制作用，在納米粒子濃度為400 μg/ml時，對細(xì)胞生長的抑制作用基本在20%左右，見圖3。提示5種配比的載體安全性和生物相容性都較好。比較各種載體對于細(xì)胞生長的抑制作用，可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)納米粒子濃度在200和400 μg/ml時，G2L2及L4的毒性總體略高于G1L3。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)合成了帶有羥基的PCL，將其和mPEGPCL以一定比例混合后制備5種不同配比型的負(fù)載CDDP納米粒子，考察粒徑和載藥效率，探討其與CDDP裸藥相比，對人胃癌細(xì)胞株BGC-823和SGC-7901的生物相容性以及體外抗腫瘤效果。可以看出，隨著HO-PCL的比例不同，納米粒子的各方面性質(zhì)也存在差異。在細(xì)胞株BGC-823和SGC-7901中，不同配比型的納米粒子的抗腫瘤活性也呈現(xiàn)出一定程度的異質(zhì)性，表明納米粒子的抗腫瘤活性與粒子本身的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)有關(guān)，有關(guān)分子機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。比較上述結(jié)果，G1L3和G4型在粒徑穩(wěn)定性上具有優(yōu)勢，除L4型外均具有良好的載藥量與載藥效率，G2L2、G1L3、L4型具有較好的體外細(xì)胞毒性。綜合來看，5種納米粒子中G1L3型具有最佳的配比結(jié)構(gòu)，與前期我們對于不同配比納米粒子的各種表征性質(zhì)以及不同納米粒子在H22細(xì)胞系/腫瘤組織塊上的一系列研究的結(jié)論基本一致，因此，后續(xù)我們將采用G1L3的配比作為載體進(jìn)行進(jìn)一步研究。

圖3 不同空白載體對BGC-823(A)和SGC-7901(B)細(xì)胞生長的影響Figure 3 Impact of different NPs on viabilities of BGC-823(A) and SGC-7901(B) cell lines

目前關(guān)于納米藥物投遞系統(tǒng)的大部分研究并未深入探討配比結(jié)構(gòu)與功能的問題，我們探討了mPEG-PCL順鉑納米粒子的配比結(jié)構(gòu)與體外抗腫瘤作用的關(guān)系，認(rèn)為對于高分子嵌段共聚物納米粒子而言，其配比結(jié)構(gòu)對抗腫瘤作用具有重要影響，應(yīng)初步研究找出最佳配比結(jié)構(gòu)以利于后續(xù)進(jìn)一步研究。