徐婭，付烊，朱詩(shī)聰，章必成

0 引言

近年來(lái)腫瘤免疫治療的飛速發(fā)展改變了腫瘤治療的格局，其中嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor,CAR）T細(xì)胞在臨床上已經(jīng)取得了顯著的成效，兩款自體CAR T細(xì)胞產(chǎn)品已獲美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration,FDA）批準(zhǔn)上市。但是，因?yàn)槟[瘤免疫抑制性微環(huán)境的存在，大部分患者無(wú)法提供足量且高質(zhì)量的T細(xì)胞進(jìn)行治療，所以這種直接取材于患者自身或造血干細(xì)胞移植受體中的干細(xì)胞供體的高度個(gè)性化的策略限制了其更廣泛的應(yīng)用[1-2]。此外，制備自體T細(xì)胞產(chǎn)品所需的長(zhǎng)生產(chǎn)周期和高昂費(fèi)用，也是患者所面臨的實(shí)際問(wèn)題。雖然使用來(lái)自健康供體經(jīng)過(guò)遺傳修飾的同種異體T細(xì)胞作為現(xiàn)成的“通用”T細(xì)胞能快速治療多個(gè)患者，理論上可以規(guī)避這些限制，但輸注同種異體T細(xì)胞所引起的移植排斥反應(yīng)又會(huì)引發(fā)新的臨床安全等問(wèn)題。

人類(lèi)白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen,HLA）分子包括Ⅰ類(lèi)（HLA-Ⅰ）和Ⅱ類(lèi)（HLA-Ⅱ）抗原。其中，HLA-Ⅰ類(lèi)分子負(fù)責(zé)將抗原肽呈遞給CD8+T細(xì)胞，被激活的CD8+T細(xì)胞可以攻擊異己細(xì)胞，介導(dǎo)免疫排斥反應(yīng)[3]。由β2-微球蛋白（beta 2-microglobulin,B2M）基因編碼的B2M蛋白構(gòu)成HLA-Ⅰ類(lèi)分子的輕鏈。B2M基因的敲除可以導(dǎo)致HLA-Ⅰ類(lèi)分子功能喪失，顯著降低了B2M缺失人類(lèi)胚胎干細(xì)胞（human embryonic stem cells,hESCs）對(duì)CD8+T細(xì)胞的免疫原性[4]。程序性細(xì)胞死亡蛋白-1（programmed cell death protein 1,PD-1）基因可表達(dá)于T細(xì)胞表面，通過(guò)與程序性細(xì)胞死亡配體1（programmed cell death ligand 1,PD-L1）結(jié)合而抑制T細(xì)胞的活化及細(xì)胞因子的產(chǎn)生，在維持機(jī)體的外周耐受上發(fā)揮至關(guān)重要的作用，而腫瘤細(xì)胞利用此機(jī)制形成免疫逃逸。PD-1/PD-L1抑制劑正是通過(guò)阻斷此信號(hào)通路重新激活T細(xì)胞，從而達(dá)到抗腫瘤效果。Rupp等[5]發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞PD-L1表達(dá)可使人CAR T細(xì)胞功能低下，而通過(guò)基因編輯技術(shù)敲除CAR T細(xì)胞及T細(xì)胞受體（T cell receptor,TCR）T細(xì)胞的PD-1基因可顯著增強(qiáng)其體外腫瘤細(xì)胞殺傷功能[6]。此外，臨床前研究已經(jīng)證實(shí)特異性阻斷PD-1分子的抑制劑可以有效地增強(qiáng)CAR T細(xì)胞的治療效果[7]。

本研究利用成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列相關(guān)蛋白9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein 9,CRISPR Cas9）核糖核蛋白（ribonucleoprotein,RNP）技術(shù)制備B2M和PD-1雙基因敲除的人原代T細(xì)胞，以消除HLA-Ⅰ類(lèi)分子所介導(dǎo)的同種異體移植免疫排斥反應(yīng)，為減輕甚至消除“通用”CAR T細(xì)胞的免疫排斥反應(yīng)，并同時(shí)增強(qiáng)T細(xì)胞的功能提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

HEK293T細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室所有；人原代T淋巴細(xì)胞（以下簡(jiǎn)稱(chēng)T細(xì)胞）分離自健康供體血液；pGL3-U6-PGK-puromycin及spCas9質(zhì)粒來(lái)自上?？萍即髮W(xué)黃行許教授實(shí)驗(yàn)室。單向?qū)NA（single-guide RNA,sgRNA）及Cas9蛋白由南京金斯瑞生物科技公司化學(xué)合成，引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。感受態(tài)大腸桿菌DH5α菌株、DM2000 DNA marker購(gòu)自北京康為世紀(jì)有限公司；高保真限制性內(nèi)切酶BsaⅠ-HF（#B7002S）、CutsMart Buffer、NEBuffer 2購(gòu)自美國(guó)New England Biolabs公司；Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase PCR試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；DNA A-Tailing Kit、pMDTM19-T Vector Cloning Kit、DNA Ligation Kit Ver 2.1、6×Loading Buffer購(gòu)自TaKaRa公司；2×Hieff PCR Master Mix購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司；無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；DNA純化試劑盒AxyPrepTMPCR Cleanup Kit購(gòu)自美國(guó)AXYGEN公司；B2MPE單克隆抗體（#A15770）、PD-1-PE單克隆抗體（#12-9985-82）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；Ficoll-PaqueTMPLUS單核細(xì)胞分離液購(gòu)自美國(guó)GE Healthcare公司；Lipofectamine2000、CD3磁珠、CD3/CD28磁珠購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；Lonza Cell Line Nucleofector Kit V（#amaxa-V4XP-30）電穿孔試劑盒、X-VIVO15培養(yǎng)基購(gòu)自瑞士LONZA公司；無(wú)血清培養(yǎng)基Opti-MEM、雙抗（1%青霉素-鏈霉素）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）、0.25%胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffer saline,PBS）、RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Corning公司，DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；嘌呤霉素（puromycin,PM）購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司；氨芐青霉素（ampicillin,AMP）、50×TAE電泳緩沖液等試劑購(gòu)自生工生物（上海）工程股份有限公司。

1.2 初篩sgRNA

1.2.1 sgRNA的設(shè)計(jì)

利用CCTop-CRISPR/Cas9 target online predictor網(wǎng)站針對(duì)B2M和PD-1基因各設(shè)計(jì)2條sgRNA；針對(duì)B2M sgRNA及PD-1 sgRNA各設(shè)計(jì)一對(duì)體外擴(kuò)增（PCR）引物：B2M sg1-2 F:ATTCCTGAAGCTGACAGCAT；B2M sg1-2 R:TTATCGACGCCCTAAACTTTGT；PD-1 sg1-2 F:AGAAGCTGCAGCCTCACGTAGAAG；PD-1 sg1-2 R:AGAGGTAGGTGCCGCTGTCATTG；pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin質(zhì)粒Sanger測(cè)序引物Assembly F:CGATTAGTGAACGGATCTCGACG。在NCBI網(wǎng)站驗(yàn)證其特異性。Sanger測(cè)序由蘇州金唯智生物科技有限公司完成。

1.2.2 質(zhì)粒構(gòu)建

1.2.2.1 載體線性化 將帶有U6啟動(dòng)子的pGL3-U6-PGK-puromycin質(zhì)粒載體用高保真限制性內(nèi)切酶BsaⅠ-HF酶切消化（37℃水浴過(guò)夜）；酶切產(chǎn)物用AxyPrepTMPCR Clean up Kit試劑盒純化，用超微量分光光度儀（Nanodrop Spectrophotometer）測(cè)濃度并標(biāo)記，-20℃冰箱保存。

1.2.2.2 退火及連接 將依據(jù)sgRNA序列合成的寡聚核苷酸（Oligo）成對(duì)變性退火形成雙鏈：取正向和反向Oligo各1 μl，按說(shuō)明書(shū)加NEBuffer 2（#B7002S）進(jìn)行退火，條件：95℃ 5 min；95℃30s；85℃ 30 s，每個(gè)循環(huán)降2℃，30個(gè)循環(huán)；25℃1 min，每個(gè)循環(huán)降0.1℃，10個(gè)循環(huán)。退火產(chǎn)物1 μl加線性化載體（pGL3-U6-PGK-puromycin）50 ng、Solution Ⅰ（DNA Ligation Kit Ver 2.1）1.5 μl，混勻，16℃連接30 min。

1.2.2.3 轉(zhuǎn)化、驗(yàn)證并抽提質(zhì)粒 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α，涂AMP抗性（終濃度100 μg/ml）LB板，培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2）過(guò)夜培養(yǎng)（12～16 h），挑取數(shù)個(gè)單菌落于含有AMP（終濃度100 μg/ml）的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2）培養(yǎng)1～2 h，取2 μl菌液加10 μl 2×Hieff PCR Master Mix、Assembly F 1 μl、反向B2M sgRNA1/2或反向PD-1 sgRNA1/21 μl，加水補(bǔ)足體積至20 μl，置于PCR儀擴(kuò)增，條件：95℃ 5 min；95℃ 30 s，62℃ 30 s，每個(gè)循環(huán)降0.2℃，72℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。PCR產(chǎn)物凝膠電泳，選取能擴(kuò)增出單一明亮且位置正確的條帶所對(duì)應(yīng)的菌液送測(cè)序；將經(jīng)測(cè)序鑒定正確連接的菌液接種于10～15 ml 含AMP的LB培養(yǎng)基，搖菌（37℃，250 r/min，12～16 h），用天根無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒抽提質(zhì)粒pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin，測(cè)濃度并標(biāo)記后置于-20℃冰箱保存。

1.2.3 Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞篩選高效率sgRNA

將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HEK293T細(xì)胞消化離心后，用含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，以2×105個(gè)細(xì)胞/毫升密度鋪滿24孔板（500 μl細(xì)胞懸液每孔）；按質(zhì)粒SpCas9:pGL3-U6-sgRNAPGK-puromycin=2:1比例（共1 μg）加入EP管（A液），取Lipofectamine20002 μl于另一EP管（B液），分別加50 μl無(wú)血清培養(yǎng)基Opti-MEM稀釋混勻并室溫靜置5 min，將B液加入A液中，混勻后室溫靜置20 min，緩慢滴入HEK293T細(xì)胞中（實(shí)驗(yàn)組），對(duì)照組HEK293T細(xì)胞不加含sgRNA的質(zhì)粒部分，余條件與實(shí)驗(yàn)組保持相同。6 h后更換為新鮮完全培養(yǎng)基（DMEM+10%FBS+1%雙抗），24 h加PM（終濃度2 μg/ml），72 h收集細(xì)胞提取基因組DNA，分別對(duì)應(yīng)用B2M sg1-2 F/R及PD-1 sg1-2 F/R引物擴(kuò)增相應(yīng)sgRNA附近片段（根據(jù)Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase試劑說(shuō)明書(shū)），擴(kuò)增產(chǎn)物送測(cè)序。

1.3 T細(xì)胞的分離、分選與活化

T細(xì)胞是從新鮮的全血中分離得到。全血來(lái)自于健康獻(xiàn)血者。使用淋巴細(xì)胞分離液（Ficoll-PaqueTMPLUS）從全血中分離得到外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMC），重懸于RPMI 1640培養(yǎng)基中。利用CD3磁珠分選出CD3+T細(xì)胞；用CD3/CD28磁珠刺激活化T細(xì)胞，以含10%FBS及白細(xì)胞介素（IL-2、IL-7、IL-15）的X-VIVO15 T細(xì)胞完全培養(yǎng)基按照1×106個(gè)細(xì)胞/毫升密度置于無(wú)菌培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2）進(jìn)行培養(yǎng)。

1.4 sgRNA在T細(xì)胞中的效率驗(yàn)證

生長(zhǎng)狀態(tài)良好的T細(xì)胞計(jì)數(shù)后分組（2×106個(gè)細(xì)胞/份），離心（300g，8 min）后棄上清液。以Nucleofector Solution:Supplement=82:18比例配制電穿孔緩沖液2×20 μl，用緩沖液重懸T細(xì)胞；按照sgRNA（B2M sgRNA1或PD-1 sgRNA1）：Cas9蛋白=150 pmol:30 pmol比例輕輕混勻，形成RNP復(fù)合物，吸取T細(xì)胞懸液，加入RNP復(fù)合物，將混合物與T細(xì)胞（實(shí)驗(yàn)組）混勻后輕輕轉(zhuǎn)至電穿孔杯中，置于電穿孔儀進(jìn)行電穿孔，往電穿孔杯加入預(yù)熱的培養(yǎng)基，對(duì)照組細(xì)胞不加sgRNA，余條件與實(shí)驗(yàn)組保持相同。將細(xì)胞轉(zhuǎn)入預(yù)先鋪有預(yù)熱的培養(yǎng)基的孔板中，無(wú)菌培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2）培養(yǎng)48 h后分別收取實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組細(xì)胞，提取基因組DNA并行PCR分析，產(chǎn)物送測(cè)序；純化PCR產(chǎn)物（AxyPrep PCR Clean up Kit試劑盒）后進(jìn)行TA克?。喝? μg純化PCR產(chǎn)物加5 μl 10×A-tailing Buffer、4 μl dNTP mix、0.5 μl A-tailing Enzyme，加水補(bǔ)足至50 μl體系，72℃金屬浴20 min，冰置 2 min；取加A尾產(chǎn)物2 μl加pMDTM19-T Vector 0.5 μl、SolutionⅠ 2.5 μl，16℃，≥1 h（PCR儀）。已連接T載體的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α，將轉(zhuǎn)化菌涂AMP抗性板，培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜（12～16 h）。每板挑取25個(gè)單菌落，分別接種于LB培養(yǎng)基（含AMP），菌液2 μl加通用引物M13-47 FOR及M13-48 REV各1 μl、2×Hieff PCR Master Mix 10 μl，加水補(bǔ)足體積至20 μl，進(jìn)行菌液PCR，電泳，選擇單一明亮且位置正確的條帶所對(duì)應(yīng)菌液送測(cè)序。

1.5 構(gòu)建雙基因敲除的T細(xì)胞

按照B2M sgRNA1:PD-1 sgRNA1:Cas9蛋白=150 pmol:150 pmol:30 pmol比例配制電穿孔緩沖液100 μl（實(shí)驗(yàn)組）；對(duì)照組不加sgRNA，其他條件與實(shí)驗(yàn)組保持相同。余按照1.4中方法電穿孔T細(xì)胞后加培養(yǎng)基鋪6孔板。培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2）培養(yǎng)48 h，分別收取適量細(xì)胞提取基因組DNA，用B2M sg1-2 F/R和PD-1 sg1-2 F/R引物進(jìn)行PCR并送測(cè)序；分別進(jìn)行TA克?。浑姶┛缀?6 h收取兩份實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞、三份對(duì)照組細(xì)胞（5×106個(gè)細(xì)胞/份樣品），雙敲除組及對(duì)照組細(xì)胞各2份分別避光孵育單克隆抗體（B2M-PE ＆ PD-1-PE）15～20 min，PBS洗去背景抗體后重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。B2M或PD-1基因表達(dá)下調(diào)率=（對(duì)照組表達(dá)量-實(shí)驗(yàn)組表達(dá)量）/對(duì)照組表達(dá)量×100%。

2 結(jié)果

2.1 sgRNA的設(shè)計(jì)與構(gòu)建

為獲得B2M及PD-1基因的移碼突變，針對(duì)B2M基因1號(hào)及2號(hào)外顯子分別設(shè)計(jì)一對(duì)sgRNA，見(jiàn)圖1A；針對(duì)PD-1基因1號(hào)外顯子設(shè)計(jì)兩對(duì)sgRNA，見(jiàn)圖1B。將訂購(gòu)的單鏈sgRNA上下游退火形成雙鏈，載體質(zhì)粒pGL3-U6-PGK-puromycin含有U6啟動(dòng)子、BsaⅠ-HF特異性酶切位點(diǎn)、PM及AMP抗性標(biāo)簽，經(jīng)高保真限制性內(nèi)切酶BsaⅠ-HF酶切后形成黏性互補(bǔ)末端，與雙鏈sgRNA連接形成pGL3-U6-PGK-sgRNA-puromycin質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化至DH5α，涂板，隔天挑取單克隆測(cè)序，選擇含構(gòu)建成功質(zhì)粒的菌液擴(kuò)大培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒，見(jiàn)圖1C、1D。

2.2 sgRNA在HEK293T細(xì)胞中的篩選

利用Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法將構(gòu)建好的質(zhì)粒pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin與spCas9質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后24 h加入PM（終濃度2 μg/ml），72 h后對(duì)照組細(xì)胞全部死亡，實(shí)驗(yàn)組約5%細(xì)胞死亡。用PBS輕洗實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，去掉死亡細(xì)胞后余下細(xì)胞計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組各取5～10萬(wàn)個(gè)細(xì)胞提取基因組DNA，并體外擴(kuò)增B2M及PD-1基因組sgRNA附近序列，Sanger測(cè)序結(jié)果顯示B2M sgRNA1及PD-1 sgRNA1具有高編輯效率（約90%），見(jiàn)圖2。

2.3 初篩的高效率sgRNA在T細(xì)胞中的效率驗(yàn)證

圖1 sgRNA的設(shè)計(jì)與構(gòu)建Figure 1 Design and construction of sgRNAs

圖2 B2M sgRNA和PD-1 sgRNA在HEK293T細(xì)胞中的篩選Figure 2 Screening of B2M sgRNA and PD-1 sgRNA in HEK293T cells

將B2M sgRNA1、PD-1 sgRNA1分別與Cas9蛋白混合形成RNP復(fù)合物，使用LONZA電穿孔試劑盒分別電穿孔T細(xì)胞；48 h后收集細(xì)胞提取基因組DNA，分別用B2M sg1-2 F/R和PD-1 sg1-2 F/R引物進(jìn)行PCR并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，Sanger測(cè)序結(jié)果表明B2M sgRNA1及PD-1 sgRNA1在T細(xì)胞中同樣具有高編輯效率，見(jiàn)圖3A、3B。將B2M和PD-1基因編輯后的T細(xì)胞分別進(jìn)行裂解，提取基因組DNA進(jìn)行PCR，PCR產(chǎn)物純化并克隆至T載體，TA克隆測(cè)序結(jié)果分析顯示B2M sgRNA1和PD-1 sgRNA1在T細(xì)胞中的編輯效率均達(dá)到90%，見(jiàn)圖3C、3D。

2.4 構(gòu)建B2M及PD-1雙基因敲除的T細(xì)胞

經(jīng)驗(yàn)證的高效sgRNA（B2M sgRNA1和PD-1 sgRNA1）與Cas9蛋白混合形成RNP復(fù)合物并電穿孔T細(xì)胞。Cas9 RNP方式電穿孔T細(xì)胞后的基因修飾通常在轉(zhuǎn)染后48 h內(nèi)完成，但丟失的靶蛋白表達(dá)所需時(shí)間是可變的，既往對(duì)于T細(xì)胞中多個(gè)靶標(biāo)進(jìn)行流式分析或Western Blot顯示通常48～72 h足以看到靶蛋白表達(dá)的完全喪失。故而我們?cè)陔姶┛缀?8 h后收取5～10萬(wàn)個(gè)細(xì)胞提取基因組DNA進(jìn)行PCR，測(cè)序并進(jìn)行TA克隆；72 h后收集實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組T細(xì)胞分別孵育B2M-PE及PD-1-PE單抗并上機(jī)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析蛋白表達(dá)情況。

圖3 B2M sgRNA1或PD-1 sgRNA1編輯效率在T細(xì)胞中的驗(yàn)證Figure 3 Verification of editing efficiencies of B2M sgRNA1 or PD-1 sgRNA1 in T cells

Cas9結(jié)合sgRNA形成復(fù)合體，通過(guò)與靶序列以堿基互補(bǔ)配對(duì)原則定位至特定部位，引發(fā)特異性的切割靶序列導(dǎo)致雙鏈DNA斷裂（double-strand DNA breaks,DSBs），從而引起生物體內(nèi)DNA的損傷修復(fù)機(jī)制，包括同源定向重組（homologydirected recombination,HDR）和容易出現(xiàn)錯(cuò)配的非同源末端連接 （non-homologous end joining,NHEJ）。出現(xiàn)錯(cuò)配的NHEJ事件后最終產(chǎn)生堿基替換、插入或缺失等不同類(lèi)型基因修飾，從而達(dá)到編輯基因的效果。實(shí)驗(yàn)組中Sanger測(cè)序峰值圖中的雙峰或多峰顯示了在B2M和PD-1基因座處CRISPR介導(dǎo)的NHEJ事件，見(jiàn)圖4A。TA克隆測(cè)序分析顯示多種類(lèi)型的編輯結(jié)果主要集中在sgRNA位置附近，包括單/多堿基替換、敲除及插入，B2M及PD-1基因?qū)用婢庉嬓示哌_(dá)90%，見(jiàn)圖4B。

在T細(xì)胞中，B2M蛋白為組成性表達(dá)，而PD-1主要由TCR介導(dǎo)T細(xì)胞活化從而被誘導(dǎo)表達(dá)，高表達(dá)于衰竭T細(xì)胞[8]。流式分析對(duì)照組T細(xì)胞中B2M及PD-1蛋白表達(dá)量分別為99.9%和16.4%，而實(shí)驗(yàn)組分別為14%、1.83%，表達(dá)下調(diào)率分別達(dá)86%、89%，蛋白層面同樣顯示編輯效果顯著，見(jiàn)圖4C。

圖4 B2M和PD-1雙基因敲除的T細(xì)胞中的編輯效率Figure 4 Editing efficiencies of B2M and PD-1 in double genes knock-out T cells

3 討論

來(lái)源于微生物（細(xì)菌和古菌）的CRISPR/Cas9因操作簡(jiǎn)單、高效、安全性高和脫靶率低等特點(diǎn)，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)便被廣泛采用，已經(jīng)成為最常用的可編輯核酸酶。Cas9系統(tǒng)由DNA內(nèi)切酶Cas9蛋白和sgRNA兩部分組成，可以誘導(dǎo)人和小鼠等多個(gè)物種細(xì)胞內(nèi)源基因組位點(diǎn)的精確切割[9-10]，從而使原代T細(xì)胞的體外編輯成為可能。但由于缺乏有效的轉(zhuǎn)染方法，由Cas9系統(tǒng)所介導(dǎo)的人原代T細(xì)胞內(nèi)源基因修飾受到限制。傳統(tǒng)病毒傳遞[11-12]或電穿孔轉(zhuǎn)入構(gòu)建體質(zhì)粒方式[13-14]在T細(xì)胞中靶向編輯效率相對(duì)低下，且后者細(xì)胞毒性大，常規(guī)T細(xì)胞存活率低于50%。為了解決這一困境，多個(gè)學(xué)者嘗試?yán)肅as9 RNP方式電穿孔人原代T細(xì)胞，通過(guò)不斷探索優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案，發(fā)現(xiàn)靶基因的編輯效率可達(dá)50%～90%[15-17]。研究證實(shí)通過(guò)Cas9 RNP方式編輯后的T細(xì)胞的活性及功能并未受到影響，總體T細(xì)胞存活率約60%～80%，并且單次轉(zhuǎn)入RNP總量的增加并不降低T細(xì)胞活性及IFN-γ等細(xì)胞因子的分泌功能[18]，較傳統(tǒng)電穿孔導(dǎo)入構(gòu)建體質(zhì)粒方式顯著降低T細(xì)胞的毒性。此外，由于Cas9 RNP復(fù)合物在細(xì)胞內(nèi)快速降解，其脫靶效應(yīng)遠(yuǎn)低于既往的常規(guī)基因遞送方法[19]。

近年來(lái)，陸續(xù)有研究探討利用不同組合模式的Cas9系統(tǒng)（SpCas9質(zhì)粒、Cas9 mRNA或Cas9蛋白等與不同sgRNAs）對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行PD-1或B2M基因敲除，以改善或優(yōu)化其功效。Seki等[18]通過(guò)Cas9 RNP技術(shù)敲除鼠和人原代T細(xì)胞中PD-1等多個(gè)靶基因的效率超過(guò)85%，且PD-1基因敲除并不影響T細(xì)胞的活化及功能。Rupp等[5]通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)PD-1基因敲除顯著增強(qiáng)CAR T細(xì)胞在體外的腫瘤細(xì)胞殺傷效應(yīng)，同時(shí)增強(qiáng)了其對(duì)體內(nèi)PD-L1+腫瘤異種移植物的清除能力。胡邊等[20]發(fā)現(xiàn)，PD-1基因敲除并不影響CAR的表達(dá)。另一項(xiàng)研究[21]通過(guò)Cas9 mRNA與sgRNA組合電轉(zhuǎn)T細(xì)胞以實(shí)現(xiàn)B2M基因敲除，結(jié)果顯示B2M及HLA-Ⅰ類(lèi)分子雙陰性比例達(dá)79.9%，而T細(xì)胞中B2M基因的缺失顯著降低了其對(duì)共培養(yǎng)同種異體PBMC的反應(yīng)性；該研究[21]同時(shí)還證實(shí)T細(xì)胞內(nèi)B2M及PD-1基因的敲除并不影響CAR T細(xì)胞的體內(nèi)植入、增殖及抗腫瘤功效。然而，上述研究雖然已經(jīng)顯著提高了T細(xì)胞內(nèi)多個(gè)基因的編輯效率，但是仍無(wú)法實(shí)現(xiàn)目的基因在種族水平上的完全敲除。為了消除“通用”T細(xì)胞產(chǎn)品的同種異體移植免疫排斥反應(yīng)并增強(qiáng)T細(xì)胞功能，我們?cè)O(shè)計(jì)并進(jìn)行了此次實(shí)驗(yàn)研究：首先利用HEK293T細(xì)胞完成sgRNA編輯效率的初步篩選，然后分別進(jìn)行T細(xì)胞中B2M及PD-1單基因敲除以再次驗(yàn)證sgRNA效率，最后通過(guò)同時(shí)加入2種高效sgRNA與Cas9蛋白結(jié)合形成RNP復(fù)合物，用電穿孔方式轉(zhuǎn)入T細(xì)胞中進(jìn)行雙基因敲除。在未進(jìn)行任何純化或篩選的情況下，雙基因敲除T細(xì)胞在基因?qū)用鍮2M及PD-1的編輯效率均達(dá)到了90%，蛋白表達(dá)下調(diào)率分別為86%、89%。

總之，我們首次采用Cas9 RNP技術(shù)實(shí)現(xiàn)B2M及PD-1雙基因高效率同步敲除。提供了一種更高效率的T細(xì)胞基因編輯實(shí)驗(yàn)流程，克服了通過(guò)病毒或一體化載體質(zhì)粒構(gòu)建方式編輯T細(xì)胞內(nèi)源基因的局限性。在顯著提高編輯效率的同時(shí)，該技術(shù)極大程度簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)步驟，節(jié)約了時(shí)間及經(jīng)濟(jì)成本。今后，我們將通過(guò)體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)已被基因編輯的T細(xì)胞的增殖、免疫功能等生物學(xué)特征及脫靶效率，并驗(yàn)證是否能達(dá)到消除“通用”T細(xì)胞的同種異體移植排斥反應(yīng)并增強(qiáng)其功能的目的。此外，我們擬通過(guò)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，優(yōu)化sgRNA設(shè)計(jì)方案，增加針對(duì)多個(gè)靶基因的多個(gè)sgRNA并調(diào)整Cas9蛋白與sgRNA比例進(jìn)行不同組合，以實(shí)現(xiàn)同步編輯T細(xì)胞多內(nèi)源基因（例如T細(xì)胞其他抑制性位點(diǎn)，包括細(xì)胞毒性T細(xì)胞抗原-4（cytotoxic T cell antigen-4,CTLA-4）、T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白域-3（T cell immunoglobulin and mucin domain-3,TIM-3）、淋巴細(xì)胞激活基因-3（lymphocyte activation gene 3,LAG-3）等），并進(jìn)一步提高編輯效率，降低T細(xì)胞毒性。我們相信，將Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)與非HLA依賴的CAR T細(xì)胞的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)相結(jié)合，有望在克服同種異體“通用”CAR T細(xì)胞的免疫排斥問(wèn)題同時(shí)增強(qiáng)T細(xì)胞功能，拓寬CAR T細(xì)胞的發(fā)展前景，為腫瘤醫(yī)生及患者提供更多高效的治療選擇方案。