王美蓮，張耀文，劉北星

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，沈陽(yáng) 110122）

瘧疾主要在撒哈拉以南的非洲地區(qū)流行，兒童較成人更易感染。瘧原蟲(chóng)感染機(jī)體可造成全身多個(gè)系統(tǒng)及器官發(fā)生損傷［1］。實(shí)驗(yàn)室研究中主要利用伯氏瘧原蟲(chóng)（Plasmodium berghei，P.b）感染實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行相關(guān)免疫機(jī)制的研究，感染初期即發(fā)生強(qiáng)烈的Th1反應(yīng)，其中樹(shù)突狀細(xì)胞在誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫過(guò)程中起到重要作用。已有研究［1］報(bào)道樹(shù)突狀細(xì)胞參與了瘧疾感染期間T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫過(guò)程的建立與調(diào)節(jié)。血吸蟲(chóng)感染是熱帶與亞熱帶另一種常見(jiàn)寄生蟲(chóng)病，人們對(duì)其免疫過(guò)程的研究［2］證實(shí)血吸蟲(chóng)卵可影響樹(shù)突狀細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的過(guò)程。此外，體外卵源性抗原刺激的樹(shù)突狀細(xì)胞可增強(qiáng)體內(nèi)的Th2反應(yīng)。因此，樹(shù)突狀細(xì)胞免疫應(yīng)答在血吸蟲(chóng)感染中起重要作用［2］。

從流行病學(xué)角度來(lái)說(shuō)，瘧疾與血吸蟲(chóng)病可在相同區(qū)域內(nèi)流行，因此也可能在同一人群中并發(fā)。在這樣情況下，感染血吸蟲(chóng)病可能會(huì)對(duì)感染瘧疾機(jī)體產(chǎn)生的免疫應(yīng)答造成一定的影響。本研究探討P.b與日本血吸蟲(chóng)（Schistosoma japonicum，S.j）并發(fā)感染時(shí)樹(shù)突狀細(xì)胞免疫應(yīng)答的改變；在改變兩種感染的寄生蟲(chóng)數(shù)量或濃度時(shí)，樹(shù)突狀細(xì)胞免疫應(yīng)答有無(wú)進(jìn)一步改變。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物感染與分組

選取5～6周C57BL/6雌性小鼠，分為低濃度組（小鼠感染150條S.j尾蚴8周后接續(xù)感染5×104P.b）、高濃度組（小鼠感染300條S.j尾蚴8周后感染5×104P.b）、對(duì)照組（單獨(dú)感染P.b小鼠）。分別在小鼠感染P.b后0、2、5、8 d后處死小鼠。本研究已獲得中國(guó)醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)研究動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 脾細(xì)胞分離與培養(yǎng)

處死小鼠后在無(wú)菌狀態(tài)下分離脾臟，取出后常規(guī)用0.17 mol/L NH4Cl對(duì)其內(nèi)紅細(xì)胞進(jìn)行裂解。隨即加入濃度為10%的FCS及PRMI1640對(duì)脾細(xì)胞的濃度進(jìn)行調(diào)整。將脾細(xì)胞懸液置于培養(yǎng)板中，37 ℃環(huán)境下加入5%的CO2培養(yǎng)48 h后收集上清液，-80 ℃環(huán)境下冷凍用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞表面染色劑胞內(nèi)染色

（1）取單份樣品，分別加入CD11b-FITC單克隆抗體、CD11c-PE單克隆抗體及CD45R/B220-PerCP單克隆抗體，進(jìn)行3種顏色分析。于染色管中加入脾細(xì)胞液后，加入FcγⅡ封閉抗體，再加入CD11b-FITC單克隆抗體、CD11c-PE單克隆抗體及CD45R/B220-PerCP單克隆抗體行細(xì)胞表面染色。（2）取單份樣品，分別加入CD11c-PE單克隆抗體、MHCⅡ-FITC單克隆抗體及CD86-PerCP單克隆抗體，進(jìn)行3種顏色分析。于染色管中加入脾細(xì)胞液后，加入FcγⅡ封閉抗體，再加入CD11c-PE單克隆抗體、MHCⅡ-FITC單克隆抗體及CD86-PerCP單克隆抗體。離心后去掉上清液，重新懸浮細(xì)胞后加入流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。（3）取單份樣品，分別加入CD11c-PE單克隆抗體及TLR-4-FITC單克隆抗體后進(jìn)行2種顏色分析。染色管中加入脾細(xì)胞液后，加入FcγⅡ封閉抗體，再加入CD11c-PE單克隆抗體及TLR-4-FITC單克隆抗體。（4）取單份樣品，加入CD11c-PE單克隆抗體并進(jìn)行2種顏色分析。染色管中加入脾細(xì)胞液后，加入FcγⅡ封閉抗體，進(jìn)行固定并行透膜，加入生物素-TLR9單克隆抗體。

流式細(xì)胞儀進(jìn)行數(shù)據(jù)檢測(cè)分析，激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)置為488 nm及635 nm，使用FACS Cell quest軟件對(duì)樣品中的細(xì)胞進(jìn)行分析。確定目標(biāo)細(xì)胞群后，以陰性對(duì)照管內(nèi)的細(xì)胞為對(duì)照進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 樹(shù)突狀細(xì)胞亞群的變化

本研究檢測(cè)的細(xì)胞群中，CD11c+CD11b+以及CD11c+CD45R/B220+為2種樹(shù)突狀細(xì)胞。對(duì)并發(fā)S.j與P.b感染后不同時(shí)間檢測(cè)樹(shù)突狀細(xì)胞亞群數(shù)量的結(jié)果顯示，所有小鼠脾細(xì)胞樹(shù)突狀細(xì)胞亞群中的細(xì)胞于感染P.b后第5天達(dá)峰值，繼而下降。在感染P.b后第5天及第8天，低濃度及高濃度組小鼠樹(shù)突狀細(xì)胞亞群的數(shù)量較對(duì)照組顯著降低（P＜ 0.05）。與低濃度組比較，高濃度組在感染P.b后第5天及第8天可進(jìn)一步減少樹(shù)突狀細(xì)胞亞群的細(xì)胞數(shù)（P＜ 0.05），見(jiàn)圖1。

2.2 樹(shù)突狀細(xì)胞成熟度的變化

CD86及MHCⅡ 2種樹(shù)突狀細(xì)胞分子是評(píng)價(jià)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟度的指標(biāo)。結(jié)果顯示，所有小鼠脾細(xì)胞中樹(shù)突狀細(xì)胞分子在感染P.b后逐漸增高，第5天達(dá)峰值后逐漸降低。在感染P.b后第5天及第8天，與對(duì)照組比較，低濃度及高濃度組小鼠樹(shù)突狀細(xì)胞分子數(shù)量顯著降低（P＜ 0.05）。與低濃度組比較，高濃度組在感染P.b后第5天及第8天樹(shù)突狀細(xì)胞分子數(shù)量進(jìn)一步減少（P＜ 0.05），見(jiàn)圖2。

圖1 3組小鼠感染后不同時(shí)間脾細(xì)胞中樹(shù)突狀細(xì)胞數(shù)比較Fig.1 Comparison of the number of mice splenic dendritic cells among the three groups at different time points of post-infection

圖2 3組小鼠感染后不同時(shí)間脾細(xì)胞中樹(shù)突狀細(xì)胞相關(guān)分子比較Fig.2 Comparison of the number of mice splenic dendritic molecules among the three groups at different time points of post-infection

2.3 Toll樣受體數(shù)量的改變

Toll樣受體分布于不同免疫細(xì)胞表面，有時(shí)在其內(nèi)部。本研究中利用CD11c+來(lái)定義樹(shù)突狀細(xì)胞，TLR4+及TLR9+來(lái)定義不同的Toll樣受體。本研究利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)的CD11c+TLR4+和CD11c+TLR9+為樹(shù)突狀細(xì)胞中2種不同Toll樣受體的數(shù)量。結(jié)果顯示，所有小鼠脾細(xì)胞中2種Toll樣受體數(shù)量在感染P.b后均開(kāi)始增高，第5天達(dá)峰值后降低。在感染P.b后第5天及第8天，與對(duì)照組比較，低濃度及高濃度組Toll樣受體數(shù)量顯著減低（P＜ 0.05）。與低濃度組比較，高濃度組在感染P.b后第5天及第8天2種Toll樣受體數(shù)量進(jìn)一步減低（P＜ 0.05），見(jiàn)圖3。

3 討論

圖3 3組小鼠感染后不同時(shí)間樹(shù)突狀細(xì)胞中Toll樣受體數(shù)量比較Fig.3 Comparison of the number of Toll-like receptors among the three groups at different time points of post-infection

瘧原蟲(chóng)感染與血吸蟲(chóng)感染均為熱帶及亞熱帶地區(qū)常見(jiàn)的寄生蟲(chóng)病，且在當(dāng)?shù)囟卟l(fā)感染亦十分常見(jiàn)［2-3］。人群可感染不同種屬的瘧原蟲(chóng)（惡性瘧原蟲(chóng)及P.b等）與血吸蟲(chóng)（埃及血吸蟲(chóng)及曼氏血吸蟲(chóng)等），其發(fā)病過(guò)程、免疫機(jī)制及最終的結(jié)局也有所不同［4］。S.j主要存在于我國(guó)江浙一帶地區(qū)，而P.b則在東南亞地區(qū)較為流行，關(guān)于S.j與瘧原蟲(chóng)并發(fā)感染的實(shí)驗(yàn)室研究罕有報(bào)道。此外，大多數(shù)關(guān)于原蟲(chóng)與蠕蟲(chóng)并發(fā)感染的研究主要集中在Treg介導(dǎo)的Th1/Th2調(diào)節(jié)性免疫應(yīng)答，主要涉及適應(yīng)性免疫過(guò)程，鮮有關(guān)于并發(fā)感染時(shí)固有免疫機(jī)制變化的報(bào)道。

樹(shù)突狀細(xì)胞是固有免疫機(jī)制中涉及的主要細(xì)胞之一，在原蟲(chóng)感染過(guò)程中，首先由其發(fā)現(xiàn)并吞噬瘧原蟲(chóng)寄生的紅細(xì)胞，且在機(jī)體感染致病體后樹(shù)突狀細(xì)胞會(huì)增強(qiáng)其吞噬功能，通過(guò)抗原提呈作用將其識(shí)別的抗原提交給CD4+T細(xì)胞，從而引發(fā)T細(xì)胞介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫過(guò)程［5-7］。在此過(guò)程中，樹(shù)突狀細(xì)胞的活化可進(jìn)而調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞的表達(dá)形式及活性［8］。小鼠脾臟樹(shù)突狀細(xì)胞群中主要存在髓樣樹(shù)突狀細(xì)胞與漿樣樹(shù)突狀細(xì)胞2種細(xì)胞，在進(jìn)行細(xì)胞標(biāo)記時(shí)分別為CD11c+CD11b+以及CD11c+CD45R/B220+。本研究結(jié)果表明S.j與P.b并發(fā)感染時(shí)，2種樹(shù)突狀細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)均較P.b單獨(dú)感染時(shí)顯著下降，這也可能對(duì)Th1免疫應(yīng)答有潛在的抑制作用。增加感染S.j數(shù)量時(shí)樹(shù)突狀細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)一步降低，這也進(jìn)一步提示了S.j感染對(duì)固有免疫應(yīng)答的抑制作用。

機(jī)體對(duì)瘧原蟲(chóng)感染的免疫應(yīng)答中Toll樣受體發(fā)揮了不可替代的作用［9］。TLR4會(huì)針對(duì)于原蟲(chóng)感染時(shí)機(jī)體內(nèi)存在的糖基磷脂酰肌醇發(fā)生免疫應(yīng)答，而TLR9則會(huì)與原蟲(chóng)感染時(shí)產(chǎn)生的瘧色素發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生相應(yīng)的免疫應(yīng)答。隨后，機(jī)體發(fā)生進(jìn)一步反應(yīng)分泌相關(guān)細(xì)胞因子與化學(xué)因子，從而產(chǎn)生更多的共刺激分子。事實(shí)上，實(shí)驗(yàn)性腦型瘧疾產(chǎn)生大腦的病理?yè)p傷可能與腦細(xì)胞中過(guò)多存在的樹(shù)突狀細(xì)胞以及CD8+T細(xì)胞有關(guān)，而在敲除TLR9等Toll樣受體的小鼠中發(fā)生原蟲(chóng)感染時(shí)不會(huì)發(fā)生實(shí)驗(yàn)性腦型瘧疾，這也說(shuō)明實(shí)驗(yàn)性腦型瘧原蟲(chóng)感染產(chǎn)生的固有免疫過(guò)程中TLR9主要發(fā)揮免疫損傷作用［9］。本研究結(jié)果顯示S.j與P.b并發(fā)感染較P.b單獨(dú)感染時(shí)其脾細(xì)胞內(nèi)的Toll樣受體的數(shù)量顯著降低。增加感染S.j數(shù)量時(shí)Toll樣受體數(shù)量進(jìn)一步降低，這也進(jìn)一步提示了S.j感染對(duì)固有免疫應(yīng)答的抑制作用。

已有研究［10］表明樹(shù)突狀細(xì)胞成熟的主要特征是MHCⅡ及CD86等分子表達(dá)的增加，此時(shí)樹(shù)突狀細(xì)胞的抗原提呈作用加強(qiáng)，從而進(jìn)一步上調(diào)機(jī)體適應(yīng)性免疫向Th1方向偏移。換言之，樹(shù)突狀細(xì)胞成熟度增高或減低會(huì)改變?cè)x(chóng)感染中Th1/Th2的平衡點(diǎn)。本研究結(jié)果表明S.j預(yù)感染會(huì)降低與P.b并發(fā)感染時(shí)樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟度，而增加感染S.j尾蚴的數(shù)量時(shí)將進(jìn)一步抑制樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟。這將最終影響原蟲(chóng)感染中Th1免疫應(yīng)答。

綜上所述，S.j與P.b并發(fā)感染時(shí)對(duì)小鼠的固有免疫產(chǎn)生一定的影響，與P.b單獨(dú)感染比較，并發(fā)感染時(shí)小鼠脾細(xì)胞的樹(shù)突狀細(xì)胞數(shù)量、分化形式及成熟度表型會(huì)有顯著差異。這也說(shuō)明了S.j感染可抑制P.b感染所產(chǎn)生的固有免疫應(yīng)答，在改變感染的S.j尾蚴數(shù)量時(shí)，將對(duì)并發(fā)感染過(guò)程中的固有免疫應(yīng)答產(chǎn)生進(jìn)一步影響。在后續(xù)研究中，應(yīng)進(jìn)一步明確并發(fā)S.j感染對(duì)P.b感染Th1/Th2免疫應(yīng)答的影響以及其產(chǎn)生的前炎性細(xì)胞因子與抗炎性細(xì)胞因子的影響。