韋維,黃海舸,陸佳明,周蒞
(右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 胃腸外科,廣西 百色 533000)
胃癌是全球高發(fā)的惡性腫瘤之一,據(jù)2015年我國國家癌癥中心統(tǒng)計,胃癌在我國惡性腫瘤病死率排名第3位[1-2]。microRNAs(miRNAs)是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為18~25個核苷酸序列的小分子RNA,作為腫瘤標志物參與胃癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移及化療抵抗,受到學(xué)術(shù)界越來越多的關(guān)注[3-4]。據(jù)文獻[5-6]報道,miRNA發(fā)揮癌基因和抑癌基因的功能,參與細胞增殖、凋亡和分化的調(diào)控,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用。其中,miR-124在多種腫瘤中發(fā)揮抑癌基因的功能,如膀胱癌、肺癌、乳腺癌和前列腺癌[7-10]。磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol-3-kinases,PI3K)/蛋白質(zhì)絲氨酸蘇氨酸激酶(protein-serine-threonine kinase,Akt)信號通路在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中常被激活,被認為是腫瘤治療的關(guān)鍵信號途徑,是腫瘤治療的關(guān)鍵靶點[11]。有研究[12]發(fā)現(xiàn),miR-107表達抑制胃癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移;過表達miR-107可通過調(diào)控PI3K/Akt信號通路抑制胃癌細胞增殖。近年,有學(xué)者[13]發(fā)現(xiàn),miR-124在胃癌細胞及組織中表達下調(diào),且在胃癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要調(diào)控作用。但目前miR-124對胃癌細胞增殖、凋亡影響的機制研究較少。本研究主要探討miR-124對胃癌細胞增殖、凋亡的影響,并進一步研究其調(diào)控PI3K/Akt信號通路的作用機制。
1.1.1 細胞株胃癌細胞系MGC803、AGS、MNK-45、SGC-7901 和人正常胃黏膜上皮細胞GES-1 均購自上海中科院細胞庫,由本科室實驗室保存。
1.1.2 主要試劑TRIzol?Reagent、Lipofectamine?2000試劑均購自Invitrogen公司;SYBR Green qPCR Mix、4×Reverse Transcription Master Mix均購自TaKaRa 公司;CCK8 試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;Transwell 小室購自上海子起生物科技有限公司;miR-124 模擬物、陰性對照序列購自上海吉瑪公司;胎牛血清購自美國PeproTech 公司;DMEM 培養(yǎng)基購自美國Gibco 公司;PI3K、Akt、p-PI3K 和p-AKT 單克隆抗體、HRP 標記山羊抗兔IgG 二抗均購自美國Abcam公司;引物均由上海生工生物工程公司設(shè)計合成(其中miR-124 引物序列正向:5'-GCT AAG GCA CGC GGT G-3', 反 向:5'-GTG CAG GGT CCG AGG T-3';U6 正向:5'-GCT CGC TTC GGC AGC ACA-3',反向:5'-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3')。
1.1.3 主要儀器1658033 小型蛋白垂直電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(武漢科昊佳生物科技有限公司);ABI 7500 熒光定量PCR 儀(美國ABI 公司);美國SHELLAB 2406-2 CO2培養(yǎng)箱( 美 國SHELLAB公司);CLARIOstar 全功能多功能酶標儀(德國BMG LABTECH 公司);凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad 公司)。
1.2.1 細胞培養(yǎng)及miR-124 的表達水平檢測將各胃癌細胞系及人正常胃黏膜上皮細胞GES-1 培養(yǎng)在含10% 的胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基中,置于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),用于后續(xù)的實驗。采用qRT-PCR 技術(shù)檢測各細胞系內(nèi)miR-124 的表達。收集細胞后,PBS 洗滌2 遍,離心取細胞沉淀,按照Trizol?Reagent 說明書提取胃癌細胞MGC803 的總RNA,依據(jù)4×Reverse Transcription Master Mix 試劑盒說明書將組織總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為總cDNA,按照SYBR Green qPCR Mix 試劑盒說明書操作,以cDNA 為模板,進行熒光定量PCR 反應(yīng)。反應(yīng)條件:94℃ 2 min,94℃20 s,60℃30 s,共40 個循環(huán)。以U6 為內(nèi)參,miR-124 基因的相對表達量以2-ΔΔCt表示。
1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染選擇MGC803 細胞作為研究對象,分別設(shè)置miR-124m 模擬物與陰性對照組,待MGC803 細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期時,使用胰酶消化細胞后,洗滌2 遍后應(yīng)用完全培養(yǎng)基將細胞調(diào)至3.0×106個/mL, 取200μL 細胞液接種至corning6孔板中培養(yǎng)24 h。分別向3個EP管中加入5μL LipofectamineTM2000,5μL LipofectamineTM2000+ 陰性質(zhì)粒,5μL LipofectamineTM2000+5μL miR-124模擬物,室溫靜置5 min 后混合,加入不含血清的DMEM 培養(yǎng)基調(diào)整終體積至2 mL,置于37℃、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng)6 h 后,更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),完成MGC803 細胞轉(zhuǎn)染,并繼續(xù)擴大培養(yǎng)以用于后續(xù)實驗。
1.2.3 qRT-PCR 檢測轉(zhuǎn)染后細胞內(nèi)miR-124 的表達細胞轉(zhuǎn)染成功后,采用qRT-PCR 技術(shù)檢測細胞內(nèi)miR-124 的表達。按“1.2.1”項下方法進行PCR 擴增,均以U6 為內(nèi)參,miR-124 基因的相對表達量以2-ΔΔCt表示。
1.2.4 CCK8 檢測細胞增殖水平待轉(zhuǎn)染后的MGC803 細胞生長至對數(shù)期時,使用胰酶消化細胞后,洗滌2 遍后應(yīng)用完全培養(yǎng)基將細胞調(diào)至3.0×103個/mL,每孔(96 孔板) 接種100μL細胞液。分別培養(yǎng)24、48、72 h,加入配置好的CCK8 試劑(10μL CCK8 試劑+90μL 完全培養(yǎng)基)孵育2 h,采用酶標儀檢測OD450值。
1.2.5 細胞克隆實驗兩組細胞以200 個/ 皿接種 于60 mm 的細胞培養(yǎng)皿(含10mL培養(yǎng)液)中,置37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育,2 周后肉眼可見細胞克隆的形成。小心吸棄培養(yǎng)液,用PBS 洗滌2 次,將兩組細胞以4% 的多聚甲醛固定15 min,再用0.1% 的結(jié)晶紫染色20 min,用清水清洗染液并風(fēng)干,于熒光顯微鏡下隨機選取5 個視野統(tǒng)計形成的細胞克隆數(shù)(大于50 個克隆數(shù)為有效克?。?。
1.2.6 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡消化MGC803細胞后使用含血清DMEM 培養(yǎng)基將細胞濃度調(diào)至3×105個/mL,收集對數(shù)生長的各組細胞,據(jù)說明書進行操作,采用Annexin V/PI 凋亡試劑盒檢測不同時間點各組細胞的凋亡率。其中,各組樣品分別加入500μL 結(jié)合緩沖液,5μL Annexin V,5μL PI,混勻,室溫避光反應(yīng)5~15 min,用流式細胞儀檢測細胞凋亡水平。
1.2.7 miR-124 對MGC803 細 胞PI3K/Akt 信 號通路的調(diào)控作用按照1:10(g/mL)的比例加入RIPA 裂解液,按BCA 蛋白定量試劑盒說明書方法測定所提取的各組細胞的總蛋白含量,以確保每組樣本之間的上樣量相同。裂解、提取各組蛋白后,經(jīng)SDS-PAGE 電泳分離,轉(zhuǎn)至硝酸纖維素(PVDF)膜,將轉(zhuǎn)好的PVDF 膜于5% 脫脂奶粉溶液中室溫封閉2 h,TBST 洗滌液漂洗3~4 次。加入一抗,4℃孵育過夜。再漂洗3~4 次,加入HRP 標記的二抗體,室溫孵育2 h,漂洗3~4 次?;瘜W(xué)發(fā)光檢測底物ECL 工作液顯色,采用Image J 圖像分析系統(tǒng)對蛋白顯影圖進行灰度分析,以β-actin 為內(nèi)參,分析PI3K、Akt、p-PI3K 和p-Akt 蛋白相對表達水平。再次收集MGC803 細胞后,PBS 洗滌2 次,離心取細胞沉淀,按照TRIzol?Reagent 說明書提取miR-124 模擬物組與miR-124 陰性對照組胃癌細胞MGC803 的總RNA,按“1.2.1”項下方法進行PCR 擴增,均以β-actin 為內(nèi)參,分別檢測PI3K、Akt 的mRNA 水平。引物由上海生工生物工程公司設(shè)計提供,引物序列見表1。
表1 PI3K/Akt 信號通路關(guān)鍵基因引物序列Table 1 Primer sequences of key genes in PI3K/Akt signaling pathway
采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對本研究數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析,計量資料采用均數(shù)±標準差(x±s)表示,應(yīng)用單因素方差分析和LSD-t檢驗比較兩組間各指標水平差異,P <0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
與人正常胃黏膜上皮細胞GES-1(1.00±0.06)比較,miR-124 在胃癌細胞MGC803(0.28±0.05)、AGS(0.30±0.09)、MNK-45(0.46±0.07)、SGC-7901(0.34±0.09)中均明顯降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=48.884,P<0.01),而miR-124在MGC803細胞中表達水平最低,因此本研究采用MGC803細胞作為研究對象(圖1)。
MGC803細胞轉(zhuǎn)染miR-124模擬物后,miR-124的表達量為4.15 ± 0.18 ,陰性對照組胃2.01±0.14,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=17.984,P=0.006)(圖2)。
圖1 各胃癌細胞系及人正常胃黏膜上皮細胞中miR-124 的表達水平Figure 1 Expression levels of miR-124 in gastric cancer cell lines and human normal gastric mucosa epithelial cells
圖2 轉(zhuǎn)染效率檢測結(jié)果Figure 2 Results of transfection efficiency determination
轉(zhuǎn)染24、48、72h 后,miR-124 模擬物組細胞的OD450值分別為0.46±0.09、0.86±0.08、1.08±0.13;其中,轉(zhuǎn)染48、72 h后,miR-124模擬物組顯著低于miR-124陰性對照組的(1.25±0.14)和(1.72±0.17)(t=8.245、14.257,P=0.027、0.008)(圖3)。
miR-124 模擬物組細胞克隆形成數(shù)為(71.3±4.5)個,陰性對照組(103.8±10.1)個,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=9.450,P<0.001)。
細胞轉(zhuǎn)染24、48、72h 后,miR-124 模擬物組細胞凋亡率分別(12.70±5.14)%、(51.80±8.14)%、(70.40±7.14)%。
圖3 miR-124 對MGC803 細胞增殖的影響Figure 3 Effect of miR-124 on proliferation of MGC803 cells
細胞轉(zhuǎn)染后,miR-124模擬物組PI3K/Akt信號通路中關(guān)鍵靶點PI3K、Akt、p-PI3K和p-AKT蛋白相對表達分別為0.87±0.05、0.95±0.11、0.89±0.09、0.91±0.10,均明顯低于陰性對照組(1.25±0.13、1.34±0.08、0.95±0.12、miR-124 模擬物組轉(zhuǎn)染48、72 h 后的細胞凋亡率明顯高于陰性對照組[(24.81±7.41)%、(33.21±8.29)%],差有統(tǒng)計學(xué)意義(t=17.565、18.147,P=0.007、0.005)(圖4)。1.12±0.09),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=13.542、15.224、4.159、12.357,P=0.007、0.008、0.035、0.006)。同時,miR-124模擬物組PI3K/Akt信號通路中PI3K及Akt基因相對表達分別為0.73±0.08、0.64±0.11,陰性對照組分別為0.87±0.15、0.94±0.10,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=8.365、10.324,P=0.007、0.009)(圖5)。
圖4 miR-124 對MGC803 細胞凋亡的影響Figure 4 Effect of miR-124 on apoptosis of MGC803 cells
圖5 miR-124 對MGC803 細胞PI3K/Akt 信號通路的影響Figure 5 Effect of miR-124 on PI3K/Akt signaling pathway in MGC803 Cells
胃癌是一種起源于胃黏膜上皮的全球性常見惡性腫瘤,我國胃癌發(fā)病率和病死率均占全球胃癌發(fā)病率和病死率的50%[14-15]。由于胃癌的發(fā)病隱匿及診斷水平限制,多數(shù)胃癌患者在確診時已經(jīng)發(fā)展為中晚期,失去了手術(shù)機會,即使早期胃癌患者在接受手術(shù)治療后仍有可能發(fā)生局部復(fù)發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致治療失敗[16-17]。故尋找新的藥物靶點已成為近年來的研究熱點,旨在為胃癌的治療尋找新的突破。近年的研究[18]表明miRNA可通過調(diào)控細胞增殖、凋亡和分化,促進或抑制腫瘤的惡性表型,相比正常細胞,腫瘤組織中miRNA存在明顯異常表達,這些異常表達的miRNA在腫瘤形成中扮演重要角色,可作為腫瘤病因?qū)W、生物學(xué)特性、組織分型和臨床分級分期的分子標志物。
miRNA是一種小的非編碼RNA,能夠通過切割靶信使RNA或抑制靶基因翻譯的方式來抑制靶基因的表達[19]。miR-124在多種腫瘤包括消化系統(tǒng)腫瘤的細胞或組織中均表達下調(diào)。有研究[20]發(fā)現(xiàn),miR-124與多種癌癥有關(guān),其在胃癌細胞中表達降低,并與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、總生存期縮短和無病生存率有關(guān),可能是胃癌患者生存和治療策略的獨立指標。Xie等[21]研究發(fā)現(xiàn),通過上調(diào)miR-124表達水平,高濃度的miR-124不僅可抑制胃癌細胞增殖,還可促進胃癌細胞凋亡的作用;同時發(fā)現(xiàn),與5-氟尿嘧啶聯(lián)合使用后,miR-124對胃癌細胞的抑制作用更加明顯,這為miR-124作為胃癌治療的潛在藥物靶點提供了有力的證據(jù)。但目前國內(nèi)關(guān)于miR-124與胃癌發(fā)生發(fā)展及相關(guān)機制的研究報道較少?;诖?,本研究成功將miR-124轉(zhuǎn)染至人胃癌MGC803細胞中,并進一步考察miR-124對胃癌細胞MGC803增殖及凋亡的影響,結(jié)果顯示miR-124模擬物組中細胞的miR-124高表達;轉(zhuǎn)染48 h后miR-124模擬物組MGC803細胞的增殖較陰性對照組顯著降低;同時流式細胞術(shù)結(jié)果顯示,miR-124模擬物組MGC803細胞凋亡率較陰性對照組顯著提高。由此可見,miR-124可抑制胃癌細胞MGC803增殖并促進MGC803細胞凋亡。
雖然miRNA 調(diào)控異常在胃癌中普遍存在,但miRNA在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的確切作用尚不清楚,目前有關(guān)miRNA的機制主要集中在細胞增殖、凋亡和侵襲等細胞過程中的關(guān)鍵途徑上[22-24]。有研究[25-26]發(fā)現(xiàn),miR-124在非小細胞肺癌組織和細胞系中均下調(diào);miR-124可抑制非小細胞肺癌細胞增殖,并促進電離輻射誘導(dǎo)非小細胞肺癌細胞凋亡。為了進一步探討miR-124對人胃癌細胞MGC803增殖及凋亡的作用機制,本研究采用Western blot法和qRT-PCR法測定PI3K/Akt信號通路關(guān)鍵靶點蛋白和mRNA水平。研究證實,PI3K/Akt信號通路參與調(diào)節(jié)細胞的增殖、凋亡等重要活動,其調(diào)控的失衡與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及耐藥密切相關(guān),已成為值得深入研究的治療靶點[27]。研究[28]表明,PI3K/Akt信號激活后可促進Akt的磷酸化水平,從而防止氧化損傷,因此PI3K/Akt信號通路在細胞存活過程中起重要作用。Akt蛋白處于PI3K/AKt信號通路的中心位置,經(jīng)磷酸化后被激活形成p-AkT,后者進一步使多個Akt下游蛋白發(fā)生磷酸化(包括PI3K等),從而調(diào)控腫瘤細胞的增殖與凋亡等[29]。有學(xué)者[30]分別檢測胃癌干細胞和胃癌細胞中PI3K、Akt的表達,發(fā)現(xiàn)胃癌干細胞中PI3K、Akt蛋白與mRNA的表達明顯高于胃癌細胞,推測PI3K/Akt信號通路與胃癌進展密切相關(guān)。本研究考察了miR-124對人胃癌MGC803細胞PI3K、Akt、p-PI3K和p-Akt蛋白表達及PI3K、Akt基因水平,發(fā)現(xiàn)miR-124模擬物組上述蛋白及基因表達均較陰性對照組顯著降低。提示,miR-124可抑制PI3K/Akt信號通路,從而促進人胃癌MGC803細胞凋亡,并抑制細胞增殖,與文獻報道一致[31]。
綜上所述,miR-124表達的下調(diào)可促進胃癌細胞的增殖,并抑制其凋亡,其可能的機制與抑制PI3K/Akt信號通路表達有關(guān)。本研究可為胃癌的診斷與基因治療提供參考。