韋維，黃海舸，陸佳明，周蒞

（右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 胃腸外科，廣西 百色 533000）

胃癌是全球高發(fā)的惡性腫瘤之一，據(jù)2015年我國國家癌癥中心統(tǒng)計(jì)，胃癌在我國惡性腫瘤病死率排名第3位[1-2]。microRNAs（miRNAs）是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為18～25個(gè)核苷酸序列的小分子RNA，作為腫瘤標(biāo)志物參與胃癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移及化療抵抗，受到學(xué)術(shù)界越來越多的關(guān)注[3-4]。據(jù)文獻(xiàn)[5-6]報(bào)道，miRNA發(fā)揮癌基因和抑癌基因的功能，參與細(xì)胞增殖、凋亡和分化的調(diào)控，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用。其中，miR-124在多種腫瘤中發(fā)揮抑癌基因的功能，如膀胱癌、肺癌、乳腺癌和前列腺癌[7-10]。磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol-3-kinases，PI3K）/蛋白質(zhì)絲氨酸蘇氨酸激酶（protein-serine-threonine kinase，Akt）信號(hào)通路在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中常被激活，被認(rèn)為是腫瘤治療的關(guān)鍵信號(hào)途徑，是腫瘤治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)[11]。有研究[12]發(fā)現(xiàn)，miR-107表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移；過表達(dá)miR-107可通過調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路抑制胃癌細(xì)胞增殖。近年，有學(xué)者[13]發(fā)現(xiàn)，miR-124在胃癌細(xì)胞及組織中表達(dá)下調(diào)，且在胃癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要調(diào)控作用。但目前miR-124對胃癌細(xì)胞增殖、凋亡影響的機(jī)制研究較少。本研究主要探討miR-124對胃癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響，并進(jìn)一步研究其調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株胃癌細(xì)胞系MGC803、AGS、MNK-45、SGC-7901 和人正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1 均購自上海中科院細(xì)胞庫，由本科室實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑TRIzol?Reagent、Lipofectamine?2000試劑均購自Invitrogen公司；SYBR Green qPCR Mix、4×Reverse Transcription Master Mix均購自TaKaRa 公司；CCK8 試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Transwell 小室購自上海子起生物科技有限公司；miR-124 模擬物、陰性對照序列購自上海吉瑪公司；胎牛血清購自美國PeproTech 公司；DMEM 培養(yǎng)基購自美國Gibco 公司；PI3K、Akt、p-PI3K 和p-AKT 單克隆抗體、HRP 標(biāo)記山羊抗兔IgG 二抗均購自美國Abcam公司；引物均由上海生工生物工程公司設(shè)計(jì)合成（其中miR-124 引物序列正向：5'-GCT AAG GCA CGC GGT G-3'， 反 向：5'-GTG CAG GGT CCG AGG T-3'；U6 正向：5'-GCT CGC TTC GGC AGC ACA-3'，反向：5'-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3'）。

1.1.3 主要儀器1658033 小型蛋白垂直電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（武漢科昊佳生物科技有限公司）；ABI 7500 熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司）；美國SHELLAB 2406-2 CO2培養(yǎng)箱（ 美 國SHELLAB公司）；CLARIOstar 全功能多功能酶標(biāo)儀（德國BMG LABTECH 公司）；凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及miR-124 的表達(dá)水平檢測將各胃癌細(xì)胞系及人正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1 培養(yǎng)在含10% 的胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。采用qRT-PCR 技術(shù)檢測各細(xì)胞系內(nèi)miR-124 的表達(dá)。收集細(xì)胞后，PBS 洗滌2 遍，離心取細(xì)胞沉淀，按照Trizol?Reagent 說明書提取胃癌細(xì)胞MGC803 的總RNA，依據(jù)4×Reverse Transcription Master Mix 試劑盒說明書將組織總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為總cDNA，按照SYBR Green qPCR Mix 試劑盒說明書操作，以cDNA 為模板，進(jìn)行熒光定量PCR 反應(yīng)。反應(yīng)條件：94℃ 2 min，94℃20 s，60℃30 s，共40 個(gè)循環(huán)。以U6 為內(nèi)參，miR-124 基因的相對表達(dá)量以2-ΔΔCt表示。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染選擇MGC803 細(xì)胞作為研究對象，分別設(shè)置miR-124m 模擬物與陰性對照組，待MGC803 細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期時(shí)，使用胰酶消化細(xì)胞后，洗滌2 遍后應(yīng)用完全培養(yǎng)基將細(xì)胞調(diào)至3.0×106個(gè)/mL， 取200μL 細(xì)胞液接種至corning6孔板中培養(yǎng)24 h。分別向3個(gè)EP管中加入5μL LipofectamineTM2000，5μL LipofectamineTM2000+ 陰性質(zhì)粒，5μL LipofectamineTM2000+5μL miR-124模擬物，室溫靜置5 min 后混合，加入不含血清的DMEM 培養(yǎng)基調(diào)整終體積至2 mL，置于37℃、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng)6 h 后，更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，完成MGC803 細(xì)胞轉(zhuǎn)染，并繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 qRT-PCR 檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)miR-124 的表達(dá)細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功后，采用qRT-PCR 技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)miR-124 的表達(dá)。按“1.2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，均以U6 為內(nèi)參，miR-124 基因的相對表達(dá)量以2-ΔΔCt表示。

1.2.4 CCK8 檢測細(xì)胞增殖水平待轉(zhuǎn)染后的MGC803 細(xì)胞生長至對數(shù)期時(shí)，使用胰酶消化細(xì)胞后，洗滌2 遍后應(yīng)用完全培養(yǎng)基將細(xì)胞調(diào)至3.0×103個(gè)/mL，每孔（96 孔板） 接種100μL細(xì)胞液。分別培養(yǎng)24、48、72 h，加入配置好的CCK8 試劑（10μL CCK8 試劑+90μL 完全培養(yǎng)基）孵育2 h，采用酶標(biāo)儀檢測OD450值。

1.2.5 細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)兩組細(xì)胞以200 個(gè)/ 皿接種 于60 mm 的細(xì)胞培養(yǎng)皿（含10mL培養(yǎng)液）中，置37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育，2 周后肉眼可見細(xì)胞克隆的形成。小心吸棄培養(yǎng)液，用PBS 洗滌2 次，將兩組細(xì)胞以4% 的多聚甲醛固定15 min，再用0.1% 的結(jié)晶紫染色20 min，用清水清洗染液并風(fēng)干，于熒光顯微鏡下隨機(jī)選取5 個(gè)視野統(tǒng)計(jì)形成的細(xì)胞克隆數(shù)（大于50 個(gè)克隆數(shù)為有效克?。?。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡消化MGC803細(xì)胞后使用含血清DMEM 培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度調(diào)至3×105個(gè)/mL，收集對數(shù)生長的各組細(xì)胞，據(jù)說明書進(jìn)行操作，采用Annexin V/PI 凋亡試劑盒檢測不同時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞的凋亡率。其中，各組樣品分別加入500μL 結(jié)合緩沖液，5μL Annexin V，5μL PI，混勻，室溫避光反應(yīng)5～15 min，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡水平。

1.2.7 miR-124 對MGC803 細(xì) 胞PI3K/Akt 信 號(hào)通路的調(diào)控作用按照1:10（g/mL）的比例加入RIPA 裂解液，按BCA 蛋白定量試劑盒說明書方法測定所提取的各組細(xì)胞的總蛋白含量，以確保每組樣本之間的上樣量相同。裂解、提取各組蛋白后，經(jīng)SDS-PAGE 電泳分離，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素（PVDF）膜，將轉(zhuǎn)好的PVDF 膜于5% 脫脂奶粉溶液中室溫封閉2 h，TBST 洗滌液漂洗3～4 次。加入一抗，4℃孵育過夜。再漂洗3～4 次，加入HRP 標(biāo)記的二抗體，室溫孵育2 h，漂洗3～4 次?；瘜W(xué)發(fā)光檢測底物ECL 工作液顯色，采用Image J 圖像分析系統(tǒng)對蛋白顯影圖進(jìn)行灰度分析，以β-actin 為內(nèi)參，分析PI3K、Akt、p-PI3K 和p-Akt 蛋白相對表達(dá)水平。再次收集MGC803 細(xì)胞后，PBS 洗滌2 次，離心取細(xì)胞沉淀，按照TRIzol?Reagent 說明書提取miR-124 模擬物組與miR-124 陰性對照組胃癌細(xì)胞MGC803 的總RNA，按“1.2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，均以β-actin 為內(nèi)參，分別檢測PI3K、Akt 的mRNA 水平。引物由上海生工生物工程公司設(shè)計(jì)提供，引物序列見表1。

表1 PI3K/Akt 信號(hào)通路關(guān)鍵基因引物序列Table 1 Primer sequences of key genes in PI3K/Akt signaling pathway

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對本研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，應(yīng)用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)比較兩組間各指標(biāo)水平差異，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各胃癌細(xì)胞系及人正常胃黏膜上皮細(xì)胞中miR-124 的表達(dá)水平

與人正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1（1.00±0.06）比較，miR-124 在胃癌細(xì)胞MGC803（0.28±0.05）、AGS（0.30±0.09）、MNK-45（0.46±0.07）、SGC-7901（0.34±0.09）中均明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=48.884，P＜0.01），而miR-124在MGC803細(xì)胞中表達(dá)水平最低，因此本研究采用MGC803細(xì)胞作為研究對象（圖1）。

2.2 轉(zhuǎn)染效率檢測

MGC803細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-124模擬物后，miR-124的表達(dá)量為4.15 ± 0.18 ，陰性對照組胃2.01±0.14，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=17.984，P=0.006）（圖2）。

圖1 各胃癌細(xì)胞系及人正常胃黏膜上皮細(xì)胞中miR-124 的表達(dá)水平Figure 1 Expression levels of miR-124 in gastric cancer cell lines and human normal gastric mucosa epithelial cells

圖2 轉(zhuǎn)染效率檢測結(jié)果Figure 2 Results of transfection efficiency determination

2.3 miR-124 的表達(dá)對細(xì)胞增殖的影響

轉(zhuǎn)染24、48、72h 后，miR-124 模擬物組細(xì)胞的OD450值分別為0.46±0.09、0.86±0.08、1.08±0.13；其中，轉(zhuǎn)染48、72 h后，miR-124模擬物組顯著低于miR-124陰性對照組的（1.25±0.14）和（1.72±0.17）（t=8.245、14.257，P=0.027、0.008）（圖3）。

2.4 miR-124 對MGC803 細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)

miR-124 模擬物組細(xì)胞克隆形成數(shù)為（71.3±4.5）個(gè)，陰性對照組（103.8±10.1）個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.450，P＜0.001）。

2.5 miR-124對MGC803 細(xì)胞凋亡的影響

細(xì)胞轉(zhuǎn)染24、48、72h 后，miR-124 模擬物組細(xì)胞凋亡率分別（12.70±5.14）%、（51.80±8.14）%、（70.40±7.14）%。

圖3 miR-124 對MGC803 細(xì)胞增殖的影響Figure 3 Effect of miR-124 on proliferation of MGC803 cells

2.6 miR-124 對MGC803 細(xì)胞PI3K/Akt 信號(hào)通路的影響

細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，miR-124模擬物組PI3K/Akt信號(hào)通路中關(guān)鍵靶點(diǎn)PI3K、Akt、p-PI3K和p-AKT蛋白相對表達(dá)分別為0.87±0.05、0.95±0.11、0.89±0.09、0.91±0.10，均明顯低于陰性對照組（1.25±0.13、1.34±0.08、0.95±0.12、miR-124 模擬物組轉(zhuǎn)染48、72 h 后的細(xì)胞凋亡率明顯高于陰性對照組[（24.81±7.41）%、（33.21±8.29）%]，差有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=17.565、18.147，P=0.007、0.005）（圖4）。1.12±0.09），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=13.542、15.224、4.159、12.357，P=0.007、0.008、0.035、0.006）。同時(shí)，miR-124模擬物組PI3K/Akt信號(hào)通路中PI3K及Akt基因相對表達(dá)分別為0.73±0.08、0.64±0.11，陰性對照組分別為0.87±0.15、0.94±0.10，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.365、10.324，P=0.007、0.009）（圖5）。

圖4 miR-124 對MGC803 細(xì)胞凋亡的影響Figure 4 Effect of miR-124 on apoptosis of MGC803 cells

圖5 miR-124 對MGC803 細(xì)胞PI3K/Akt 信號(hào)通路的影響Figure 5 Effect of miR-124 on PI3K/Akt signaling pathway in MGC803 Cells

3 討 論

胃癌是一種起源于胃黏膜上皮的全球性常見惡性腫瘤，我國胃癌發(fā)病率和病死率均占全球胃癌發(fā)病率和病死率的50%[14-15]。由于胃癌的發(fā)病隱匿及診斷水平限制，多數(shù)胃癌患者在確診時(shí)已經(jīng)發(fā)展為中晚期，失去了手術(shù)機(jī)會(huì)，即使早期胃癌患者在接受手術(shù)治療后仍有可能發(fā)生局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致治療失敗[16-17]。故尋找新的藥物靶點(diǎn)已成為近年來的研究熱點(diǎn)，旨在為胃癌的治療尋找新的突破。近年的研究[18]表明miRNA可通過調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡和分化，促進(jìn)或抑制腫瘤的惡性表型，相比正常細(xì)胞，腫瘤組織中miRNA存在明顯異常表達(dá)，這些異常表達(dá)的miRNA在腫瘤形成中扮演重要角色，可作為腫瘤病因?qū)W、生物學(xué)特性、組織分型和臨床分級(jí)分期的分子標(biāo)志物。

miRNA是一種小的非編碼RNA，能夠通過切割靶信使RNA或抑制靶基因翻譯的方式來抑制靶基因的表達(dá)[19]。miR-124在多種腫瘤包括消化系統(tǒng)腫瘤的細(xì)胞或組織中均表達(dá)下調(diào)。有研究[20]發(fā)現(xiàn)，miR-124與多種癌癥有關(guān)，其在胃癌細(xì)胞中表達(dá)降低，并與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、總生存期縮短和無病生存率有關(guān)，可能是胃癌患者生存和治療策略的獨(dú)立指標(biāo)。Xie等[21]研究發(fā)現(xiàn)，通過上調(diào)miR-124表達(dá)水平，高濃度的miR-124不僅可抑制胃癌細(xì)胞增殖，還可促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡的作用；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，與5-氟尿嘧啶聯(lián)合使用后，miR-124對胃癌細(xì)胞的抑制作用更加明顯，這為miR-124作為胃癌治療的潛在藥物靶點(diǎn)提供了有力的證據(jù)。但目前國內(nèi)關(guān)于miR-124與胃癌發(fā)生發(fā)展及相關(guān)機(jī)制的研究報(bào)道較少?；诖耍狙芯砍晒iR-124轉(zhuǎn)染至人胃癌MGC803細(xì)胞中，并進(jìn)一步考察miR-124對胃癌細(xì)胞MGC803增殖及凋亡的影響，結(jié)果顯示miR-124模擬物組中細(xì)胞的miR-124高表達(dá)；轉(zhuǎn)染48 h后miR-124模擬物組MGC803細(xì)胞的增殖較陰性對照組顯著降低；同時(shí)流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，miR-124模擬物組MGC803細(xì)胞凋亡率較陰性對照組顯著提高。由此可見，miR-124可抑制胃癌細(xì)胞MGC803增殖并促進(jìn)MGC803細(xì)胞凋亡。

雖然miRNA 調(diào)控異常在胃癌中普遍存在，但miRNA在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的確切作用尚不清楚，目前有關(guān)miRNA的機(jī)制主要集中在細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲等細(xì)胞過程中的關(guān)鍵途徑上[22-24]。有研究[25-26]發(fā)現(xiàn)，miR-124在非小細(xì)胞肺癌組織和細(xì)胞系中均下調(diào)；miR-124可抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖，并促進(jìn)電離輻射誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡。為了進(jìn)一步探討miR-124對人胃癌細(xì)胞MGC803增殖及凋亡的作用機(jī)制，本研究采用Western blot法和qRT-PCR法測定PI3K/Akt信號(hào)通路關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白和mRNA水平。研究證實(shí)，PI3K/Akt信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、凋亡等重要活動(dòng)，其調(diào)控的失衡與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及耐藥密切相關(guān)，已成為值得深入研究的治療靶點(diǎn)[27]。研究[28]表明，PI3K/Akt信號(hào)激活后可促進(jìn)Akt的磷酸化水平，從而防止氧化損傷，因此PI3K/Akt信號(hào)通路在細(xì)胞存活過程中起重要作用。Akt蛋白處于PI3K/AKt信號(hào)通路的中心位置，經(jīng)磷酸化后被激活形成p-AkT，后者進(jìn)一步使多個(gè)Akt下游蛋白發(fā)生磷酸化（包括PI3K等），從而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖與凋亡等[29]。有學(xué)者[30]分別檢測胃癌干細(xì)胞和胃癌細(xì)胞中PI3K、Akt的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)胃癌干細(xì)胞中PI3K、Akt蛋白與mRNA的表達(dá)明顯高于胃癌細(xì)胞，推測PI3K/Akt信號(hào)通路與胃癌進(jìn)展密切相關(guān)。本研究考察了miR-124對人胃癌MGC803細(xì)胞PI3K、Akt、p-PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)及PI3K、Akt基因水平，發(fā)現(xiàn)miR-124模擬物組上述蛋白及基因表達(dá)均較陰性對照組顯著降低。提示，miR-124可抑制PI3K/Akt信號(hào)通路，從而促進(jìn)人胃癌MGC803細(xì)胞凋亡，并抑制細(xì)胞增殖，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[31]。

綜上所述，miR-124表達(dá)的下調(diào)可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖，并抑制其凋亡，其可能的機(jī)制與抑制PI3K/Akt信號(hào)通路表達(dá)有關(guān)。本研究可為胃癌的診斷與基因治療提供參考。