李淵婷，高小玲，李永紅△

(甘肅省人民醫(yī)院：1.臨床研究與轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究所；2.國家衛(wèi)生健康委胃腸腫瘤診治重點實驗室,甘肅蘭州 730030)

自2019年12月底湖北省武漢市發(fā)現(xiàn)新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)感染患者以來，院內(nèi)感染及對病毒傳播途徑認知不足致使生物安全防護欠缺或不到位是導致醫(yī)務人員暴露并感染的重要原因[1]。

SARS-CoV-2是人類分離的第七類冠狀病毒，屬于β屬的新型冠狀病毒，有包膜的單股正鏈RNA病毒，直徑60～140 nm，形態(tài)不一，多為圓形或橢圓形。其基因特征與嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)和中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)有明顯區(qū)別[2]，但都是通過血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(ACE2)感染細胞。目前研究顯示，SARS-CoV-2與蝙蝠SARS樣冠狀病毒(bat-SL-CoVZC45)同源性達85%以上。體外分離培養(yǎng)時，SARS-CoV-2 96 h左右即可在人呼吸道上皮細胞內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，而在Vero E6和Huh-7細胞系中分離培養(yǎng)需約6 d。對冠狀病毒理化特性的認識多來自對SARS-CoV和MERS-CoV的研究。病毒對紫外線和熱敏感，56 ℃ 30 min、乙醚、75%乙醇、含氯消毒劑、過氧乙酸和氯仿等脂溶劑均可有效滅活病毒，氯己定不能有效滅活病毒[2]。

我國2020年1月20日將新型冠狀病毒肺炎納入乙類傳染病并采取甲類傳染病的預防、控制措施。SARS-CoV-2傳染源主要為確診患者，潛伏期患者和攜帶者也有傳染性，潛伏期1～14 d，人群普遍易感。傳播途徑除了主要的呼吸道飛沫傳播、接觸傳播，新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第六版)新增一條傳播途徑：在相對封閉的環(huán)境中長時間暴露于高濃度氣溶膠情況下存在經(jīng)氣溶膠傳播的可能[2]。對于潛在的氣溶膠傳播途徑而言，核酸檢測的實驗室是高?？剖?，檢測人員在實驗過程中存在較大的感染風險，因此，加強實驗室生物防護顯得極為重要。本文從實驗室生物安全防護、個人生物安全防護、核酸檢測過程生物安全防護等各個環(huán)節(jié)進行了探討。

1 實驗室生物安全防護

根據(jù)實驗室所處理對象的生物危害程度和采取的防護措施，實驗室生物安全分為4個等級：一級生物安全實驗室(BSL-1)、二級生物安全實驗室(BSL-2)、三級生物安全實驗室(BSL-3)、四級生物安全實驗室(BSL-4)。我國將SARS-CoV-2按照病原微生物危害程度分類中第二類高致病性病原微生物進行管理,其分離培養(yǎng)、動物實驗等活動在生物安全三級實驗室開展，病毒抗原檢測、血清學檢測、核酸檢測、生化分析等操作應在生物安全二級實驗室開展，其中核酸檢測盡可能在有外排功能的生物安全柜中進行[3]。

SARS-CoV-2核酸檢測必須在標準PCR實驗室或負壓PCR實驗室中進行，檢測人員按三級生物安全防護進入PCR實驗室作業(yè)，嚴格遵守試劑準備區(qū)→標本制備區(qū)→擴增區(qū)→擴增產(chǎn)物分析區(qū)單一流向的原則，防止氣溶膠逆向流動，造成污染[4]。

核酸檢測實驗前檢查生物安全柜，保證其內(nèi)盡量少放物品，以便生物安全柜內(nèi)形成穩(wěn)定且潔凈的氣流循環(huán)。用75%乙醇對試劑準備區(qū)及標本制備區(qū)生物安全柜和臺面進行消毒后紫外線照射30 min，打開安全柜風機運行15～30 min后開始實驗。生物安全柜中應配備利器盒，裝0.55%～1.00%含氯消毒液用于丟棄標本、廢液及與試劑、標本接觸過的實驗耗材(槍頭、EP管等)。實驗結(jié)束后對PCR實驗室的每個區(qū)域進行消毒，依次用75%乙醇及1.00%含氯消毒劑對安全柜臺面、移液器等用品和地面進行消毒，安全柜風機至少運行10 min后方可關(guān)機。用75%乙醇對空氣進行消毒，10 min后開啟通風裝置10 min，關(guān)閉通風裝置后打開安全柜及實驗室的紫外燈照射30 min[5]，注意紫外燈距臺面0.9 m以內(nèi)，密閉30 min以上，人員離開。紫外燈照射后，為有效去除實驗過程中的氣溶膠，對實驗室進行通風至少1 h，實驗室不定期通風是重要的防護措施。

實驗過程中如有生物安全操作失誤或意外，對污染的臺面使用0.55%含氯消毒劑的紙巾覆蓋消毒30 min以上，消毒劑現(xiàn)用現(xiàn)配，24 h內(nèi)使用[4]。實驗室污染時，除了覆蓋消毒30 min之外，要保持實驗室密閉，必要時過氧乙酸加熱熏蒸過夜，劑量為2 g/m3。清理污染物嚴格遵循病毒生物安全操作要求，高壓蒸汽滅活病毒，實驗室通風換氣，防止次生危害[6]。

2 個人生物安全防護

檢測人員個人生物安全防護是SARS-CoV-2核酸檢測生物安全防護的重點。實驗室人員生物安全防護按不同等級病原微生物所采取的不同綜合防護措施可分為3級：具體防護用品分配見表1[6-7]。SARS-CoV-2核酸檢測過程中檢測人員為三級生物安全防護，嚴格遵循其穿脫順序是保護檢測人員、避免院內(nèi)感染的重點防護措施，具體步驟見圖1、2。

表1 個人生物安全防護分級

注：●為應選擇，*為根據(jù)暴露風險選擇，空白為無需選擇。

2.1防護用品的穿戴注意事項 除嚴格遵守穿戴順序外，手衛(wèi)生也是不可忽視的重點，可采用有效碘含量為0.5%、75%乙醇或70%異丙醇的消毒劑浸泡或擦拭手部，作用1～3 min，然后用醫(yī)用洗手液按照“七步洗手法”洗凈雙手。每次佩戴口罩前應做佩戴氣密性檢查，戴兩層口罩時，內(nèi)層為醫(yī)用防護口罩或N95，外層為醫(yī)用外科口罩。戴無菌手套時手套反折，緊套袖口防止手套污染。

圖1 三級防護的穿戴流程

圖2 三級防護的脫摘流程

2.2防護用品摘脫的注意事項 脫下的護目鏡、防護靴等非一次性使用的物品可用75%乙醇浸泡30 min后紫外消毒30 min備用。脫防護服時要注意，脫去第一層手套后，進行手部消毒后再脫防護服，如果是一次性防護服，可用手接觸防護服內(nèi)側(cè)，緩慢從上到下脫去防護服置于三層黃色醫(yī)療垃圾袋中；如果是可重復使用的防護服，用75%乙醇均勻噴灑后，用消毒后的內(nèi)層手套，僅接觸防護服外側(cè)脫去防護服，然后將防護服進行紫外照射至少30 min后備用，脫卸防護裝備的每一步均應進行手消毒。注意摘口罩時不要觸碰正面，摘脫多個防護用品時，務必確保醫(yī)用防護口罩最后摘除。將手套、醫(yī)用防護帽、鞋套，防護服等放入三層黃色醫(yī)療垃圾袋中作為醫(yī)療廢物集中高壓滅活病毒。

脫防護服時其表面的氣溶膠、噴濺液體容易浮在空氣中，應盡量減少呼吸頻率，減少語言交流，并閉上眼睛。所有防護裝備全部脫完后再次洗手、手消毒；按流程脫去之后，用乙醇或碘制劑，擦拭暴露的面部、鼻孔(適當深度)、耳部和耳道。建議脫去之后用生理鹽水滴眼睛、漱口，如果條件許可，脫下防護服后，盡快更換隔離服，洗澡且時長應超過30 min。

3 檢測流程中的生物安全防護

3.1標本采集及運輸?shù)淖⒁馐马?SARS-CoV-2核酸檢測標本主要包括上呼吸道標本(口咽拭子、鼻咽拭子、鼻咽抽取物等)、下呼吸道標本(深咳痰液、呼吸道抽取物、支氣管灌洗液、肺泡灌洗液和肺組織活檢標本等)、發(fā)病期血液及糞便[5]。標本采集時必須保證采集者為三級生物安全防護[6]。據(jù)SARS-CoV-2核酸檢測數(shù)據(jù)統(tǒng)計，最常用的咽拭子標本核酸檢出率偏低，靈敏度不高，而下呼吸道標本的陽性率相對較高，有專家推薦使用深咳痰標本進行病毒核酸檢測，采集深咳痰時建議用3%的生理鹽水6 mL，霧化吸入15 min，由采集者從下至上輕輕手拍患者背部，誘導排痰。針對無法采集痰液標本的患者，仍需采集咽拭子進行核酸檢測，但應注意采集拭子的材料、采集部位、深度等影響核酸檢測的因素。

標本轉(zhuǎn)運人員為二級生物安全防護[6]，采集標本后用75%乙醇噴灑標本采集管外部，放入專用兩層一次性密封袋，75%乙醇消毒后放入轉(zhuǎn)運箱(有生物安全標識)，消毒并及時送檢，轉(zhuǎn)運工作要在2 h內(nèi)完成。轉(zhuǎn)運人員隨身攜帶75%乙醇，處理可能發(fā)生的意外[5]。但《2019新型冠狀病毒肺炎臨床實驗室檢測的生物安全防護指南》指出，如發(fā)生意外，轉(zhuǎn)運者不要自行處理轉(zhuǎn)運箱，需到接收地點說明情況，同接收人員共同處理[6]。在此，筆者認為轉(zhuǎn)運者應隨聲攜帶75%乙醇，當發(fā)生轉(zhuǎn)運箱密封性損傷時，轉(zhuǎn)運者可及時進行緊急消毒處理；當標本發(fā)生灑漏，則到接收地點同接收人員共同處理。

3.2標本接收的注意事項 接收人員為二級生物安全防護[6]，標本進行雙簽收后，接收人員用75%乙醇對轉(zhuǎn)運箱外部進行消毒，靜置3～5 min后，小心打開轉(zhuǎn)運箱后再次對箱子內(nèi)部及密封袋消毒，檢查標本運送過程中有無撒漏并核對患者信息，然后將標本放入儲存盒中置于專用冰箱4 ℃冷藏(不超過24 h)保存，長期保存可置于-70 ℃或更低溫度下保存，血漿標本可在4 ℃存放3 d，-20 ℃長期保存。標本采集，轉(zhuǎn)運，交接環(huán)節(jié)應有記錄，以便回溯。

3.3核酸檢測中的注意事項 檢測人員采用三級生物安全防護[6]，進入核酸檢測實驗室，嚴格按照PCR實驗室單一流向進行實驗，實驗過程中可能會有高濃度氣溶膠的產(chǎn)生，因此，可加戴一個帽子，防護服外加穿隔離衣，穿上防護服后，要避免劇烈運動，減少內(nèi)外氣體流動，防止帶入氣溶膠附著在內(nèi)部衣物上。

試劑準備區(qū)配置實驗試劑后，進入標本處理區(qū)。標本處理應在具有外排功能的生物安全柜中進行?？谘适米?、鼻咽拭子、肺泡灌洗液、糞便置于水浴箱中56 ℃ 45 min進行病毒滅活[5]，每10 min輕輕搖勻一次，滅活后靜置10 min(防止產(chǎn)生氣溶膠，靜置時間越長，產(chǎn)生氣溶膠風險越小)用于核酸提??；痰液標本應提前40 min加入痰消化儲存液、含1 g/L蛋白酶K的磷酸鹽緩沖液[5]或4%NAOH液化處理后進行病毒滅活。血液標本1 500×g離心10 min后冰浴3～5 min后進行核酸提取?！缎滦凸跔畈《痉窝讓嶒炇覚z測技術(shù)指南(第四版)》指出血清標本主要用于抗體測定[8]，從血清抗體水平對病例感染狀況進行確定，血清標本不進行核酸檢測，而血漿標本可用于核酸檢測，建議核酸檢測使用含有乙二胺四乙酸抗凝劑的真空采血管采集血液標本5 mL。

提取核酸時，戴雙層手套(外層需為無粉丁腈手套)小心旋轉(zhuǎn)標本盒螺口，打開標本盒后，吸取足量標本，將標本盒蓋緊。剩余標本放入密封袋中，表面噴灑75%乙醇后重新放入儲存盒，再放入標本轉(zhuǎn)運箱內(nèi)。標本離心時，檢測人員不能離開離心機。正常離心結(jié)束后，靜置10 min以上(有效減少氣溶膠的形成)，75%乙醇噴霧消毒后，開離心機蓋噴霧消毒，轉(zhuǎn)入生物安全柜中。如果疑似意外發(fā)生，比如離心過程有異常聲響，則停止離心，離心停止30 min以上，75%乙醇噴霧消毒后，開離心機蓋噴霧消毒。按實驗流程進行操作，實驗過程中發(fā)現(xiàn)外層手套污染或破損時，用75%乙醇消毒后棄去外層手套，對內(nèi)層手套用75%乙醇消毒后更換新外層手套。皮膚被污染物污染時，應立即清除污染物，再用一次性吸水材料沾取0.5%碘伏或過氧化氫消毒劑擦拭消毒3 min以上，使用清水清洗干凈；黏膜污染時應用大量生理鹽水沖洗或0.05%碘伏沖洗消毒。操作過程中不能用75%乙醇對空氣消毒。核酸提取完成后在生物安全柜內(nèi)將模板加入PCR擴增體系中。標本檢測過程中的槍頭、離心管、廢液等與標本接觸的耗材放入盛有1%含氯消毒劑的黃色利器盒中浸泡30 min以上，蓋緊利器盒，按醫(yī)療廢物處置方法處置。擴增體系放入擴增儀，核對并運行擴增程序。標本檢測結(jié)束后，將擴增產(chǎn)物放入三層黃色醫(yī)療垃圾袋中封存高壓；檢測后滅活的標本密封后放在專用的冰箱中，設(shè)立專人管理，雙人雙鎖做好登記。

檢測過程中的利器盒及檢測人員的防護服、手套、鞋套、帽子等廢棄物用75%乙醇消毒后收集于三層醫(yī)療廢物包裝袋，鵝頸結(jié)密封，并標注為新型冠狀病毒肺炎。經(jīng)過高壓滅活病毒后，由專員統(tǒng)一處理。

本次疫情對實驗室生物安全防控體系是一場考驗，實驗室生物安全防護和個人生物安全防護都是避免院內(nèi)感染的重要環(huán)節(jié)。每個醫(yī)務工作者都應該提高生物安全防控意識，從工作中總結(jié)經(jīng)驗，吸取教訓，及時發(fā)現(xiàn)和改善不足，不斷完善實驗室生物安全防控體系，做到精準檢測的同時有效保護每一位醫(yī)務人員。