張 蕾, 李秋雙, 郝婧瑋, 宛春雷, 景云榮, 柴軍紅, 紀秋妍

(牡丹江師范學院 生命科學與技術學院, 黑龍江 牡丹江 157011)

紫蘇梗(Perillastem)為唇形科紫蘇屬植物紫蘇 (Perillafrutescens(L.) Brit)的干燥莖部分, 別名紫蘇莖、 蘇梗、 紫蘇桿. 梗性溫, 味辛, 氣味芳香, 分布廣泛, 具有理氣寬中、 止痛、 安胎等功效[1], 常用于治療水腫、 心腹氣滯、 腎氣游風等癥. 研究表明, 紫蘇梗具有降糖、 影響結腸平滑肌細胞等作用[2-5]. 紫蘇含有多種化學成分, 如酚酸類(迷迭香酸為主)、 花色素苷、 黃酮苷、 紫蘇酮、 石竹烯、 紫蘇醛[6]、 齊墩果酸、 烏索酸、 熊果酸、 阿魏酸、 咖啡酸及其酯類衍生物、 迷迭香酸、 迷迭香酸甲酯、 丁香酚、 脂肪酸以及甾醇類化合物等. 紫蘇梗中含有多種黃酮類化合物, 如黃酮類、 二氫黃酮類、 黃酮醇類、 二氫黃酮醇類等[7], 其中黃酮類化合物和迷迭香酸均具有抗菌、 抗氧化及清除自由基等活性[8-10]. 生物體內的自由基可使體內脂質過氧化, 導致機體逐漸衰老或發(fā)生疾病. 紫蘇梗中含有豐富的黃酮類化合物[7], 該類化合物中的酚羥基對各種自由基均有較強的清除能力[11-14]. 目前對紫蘇抗氧化作用的研究文獻報道較少. 本文用不同有機溶劑和水提取中草藥紫蘇梗中的多種有效成分, 并用不同方法研究各提取物的抗氧化效果, 為探索紫蘇梗藥用成分防治相關臨床疾病機理的研究提供參考數(shù)據.

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

紫蘇梗購于牡丹江市天利藥店； 沒食子酸、 金絲桃苷購于四川維克奇生物科技有限公司； 齊墩果酸購于貴州迪大生物科技有限責任公司； 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH·)、 鄰苯三酚購于成都生物制品研究所.

Waters2998型高效液相色譜儀(美國Waters公司).

1.2 方 法

1.2.1 制備紫蘇梗提取物 將5 kg紫蘇梗晾曬除濕后粉碎. 用體積分數(shù)為95%的乙醇浸泡12 h,m(料)∶V(液)=1∶2, 充分攪拌. 重復浸提3次, 使紫蘇梗中的化學成分溶解于乙醇中. 用旋轉蒸發(fā)儀處理浸提液后得到乙醇提取相. 紫蘇梗各有機相提取物簡稱為某有機相.

1) 有機溶劑萃取紫蘇梗提取物. 用石油醚、 乙酸乙酯、 氯仿、 正丁醇4種有機溶劑以1∶1的體積比分別萃取紫蘇梗的乙醇提取液至無色, 獲得的萃取液即為紫蘇梗正丁醇相、 紫蘇梗氯仿相(黃酮類和生物堿類化合物)、 紫蘇梗乙酸乙酯相(有機酸類和香豆素類化合物)、 紫蘇梗石油醚相(油脂和三萜類化合物)[15], 蒸干溶劑, 最終獲得紫蘇梗提取物粉末, 分別為石油醚相20.8 g、 氯仿相29.7 g、 乙酸乙酯相34.5 g和正丁醇相26.4 g. 用無水乙醇溶解各萃取物, 配制成質量濃度為1 g/mL的母液.

2) 紫蘇梗水提取物. 先將200 g紫蘇梗溶于1 L蒸餾水中, 浸泡30 min, 再加入1 L蒸餾水, 煎煮至約50 mL, 過濾, 得到質量濃度為0.1 g/mL紫蘇梗水提物母液.

1.2.2 抗氧化效果

1) 清除羥基自由基(·OH)能力測定. 準備若干具塞試管分別進行標記, 取pH=7.4的磷酸鹽緩沖液2 mL和鄰二氮菲溶液1 mL(1.5 mmol/L), 加入每個具塞試管中, 充分搖勻后, 先加入FeSO4溶液1 mL(1.5 mmol/L), 混勻, 再加入φ(H2O2)=0.02%溶液1 mL或不同的紫蘇梗提取液1 mL, 最后加入φ(H2O2)=0.02%溶液1 mL, 搖勻. 分別向每個具塞試管中加入蒸餾水定容至8 mL, 先在37 ℃恒溫水浴鍋中水浴加熱1 h, 再在波長為510 nm處測量其吸光度[16]. ·OH的清除率為

·OH清除率=[(A1-A2)/(A3-A4)]×100%,

(1)

其中：A1為僅加樣品和空白溶液的吸光度;A2為加H2O2溶液和樣品溶液的空白溶液吸光度;A3為不加H2O2和樣品空白溶液的吸光度;A4為僅加H2O2溶液和空白溶液的吸光度.

鄰苯三酚自氧化速率的測定： 參照文獻[16], 取pH=8.2的Tris-HCl緩沖液5 mL(50 mmol/L)于具塞試管中, 向其加入鄰苯三酚溶液5 μL(50 mmol/L), 搖勻, 在波長為325 nm處測量其吸光度, 每隔0.5 min測量一次, 測定3.5 min, 共測5次, 取平均值.

(2)

其中： ΔAa為鄰苯三酚自氧化吸光值(3.5 min時吸光度值與初始時吸光值之差); ΔAb為樣品的吸光值(3.5 min時吸光度值與初始時吸光值之差).

3) 清除DPPH·自由基的能力測定. 利用Saiga原理[17], 取3個具塞試管, 分別標記為1,2,3. 分別裝入2.5 mL DPPH·溶液和1.5 mL不同的紫蘇梗提取液、 2.5 mL DPPH·溶液和1.5 mLφ(乙醇)=95%溶液及1.5 mL不同的提取物溶液和2.5 mLφ(乙醇)=95%溶液. 用φ(乙醇)=95%溶液作為參比溶液, 具塞試管中溶液充分搖勻后, 在黑暗條件下反應20 min, 反應結束后, 在波長為525 nm處測量其吸光值. DPPH·的清除率為

DPPH·清除率=[1-(A1-A3)/A2]×100%,

(3)

其中：A1為DPPH·溶液與不同質量濃度紫蘇?；旌先芤旱奈舛戎?A2為DPPH·溶液與φ(乙醇)=95%溶液混合溶液的吸光度值;A3為不同質量濃度紫蘇梗與φ(乙醇)=95%溶液混合溶液的吸光度值.

1.2.3 高效液相色譜(HPLC)條件 色譜柱. 沒食子酸流動相：V(甲醇)∶V(水)=1∶4, 流速為1 mL/ min, 柱溫為23 ℃, 記錄儀紙速為0.3 cm/min, 進樣量10 μL, 檢測波長為270 nm, 平行進樣3次.

齊墩果酸流動相：V(乙腈)∶V(水)=9, 流速為1 mL/min, 柱溫為23 ℃, 記錄儀紙速為0.3 cm/min, 進樣量10 μL, 檢測波長為210 nm, 平行進樣3次.

金絲桃苷流動相：V(乙腈)∶V(水)=16∶84, 流速為1 mL/min, 柱溫為23 ℃, 記錄儀紙速為0.3 cm/min, 進樣量10 μL, 檢測波長為360 nm, 平行進樣3次.

以標準品峰面積為縱坐標, 對照品質量濃度1.56,6.25,12.5,25,50,100 μg/mL為橫坐標, 繪制標準曲線.

1.3 統(tǒng)計分析

用SPSS13.0軟件進行數(shù)據統(tǒng)計分析.

2 結果與討論

2.1 高效液相色譜法測量紫蘇梗各提取相中活性物質的含量

用高效液相法繪制各種標準品的標準曲線分別為

沒食子酸：y=1 442.6x-5 710.2,R2=0.990 6；

齊墩果酸：y=4 654.1x-6 510.7,R2=0.998 2；

金絲桃苷：y= 20 885x-17 782,R2=0.999 2.

各提取相的高效液相色譜如圖1所示. 有機酸類物質具有抗氧化、 抑菌、 消炎、 抗病毒等作用[18], 在食品、 醫(yī)藥等領域應用廣泛. 乙醇和正丁醇提取相中的主要成分為有機酸類物質, 沒食子酸是有機酸的一種, 具有一定的抗氧化效果[19-20]. 用反高效液相色譜法測定的正丁醇提取相中存在沒食子酸, 保留時間均為5.346 min, 根據峰面積計算得到沒食子酸的質量比為0.6 g/kg, 得率為0.06%(圖1(A),(B)). 藥用植物中的三萜皂苷具有抗氧化、 抑菌、 降糖等藥理活性, 在紫蘇梗中含有齊墩果酸[21], 從紫蘇梗氯仿相中發(fā)現(xiàn)三萜類化合物齊墩果酸的保留時間為11.286 min, 根據峰面積計算得到紫蘇梗氯仿相中齊墩果酸的質量比為0.9 g/kg, 得率為0.09%(圖1(C),(D)). 由于黃酮類化合物具有一定的抗氧化效果[22-23], 金絲桃苷屬于黃酮醇苷類化合物, 因此金絲桃苷在體內有一定的抗氧化效果[24]. 在紫蘇梗乙酸乙酯和氯仿提取相中金絲桃苷的保留時間為26.039 min, 根據峰面積計算得到乙酸乙酯相中金絲桃苷的質量比為1.2 g/kg, 得率為0.12%； 氯仿相中金絲桃苷的質量比為1.1 g/kg, 得率為0.11%(圖1(E),(F),(G)).

圖1 紫蘇梗各提取相中的有效成分

2.2 抗氧化結果

圖2 紫蘇梗各提取相對·OH的清除能力

1) 對羥基自由基(·OH)的清除能力. ·OH是導致組織細胞損傷的主要活性氧之一[25]. 紫蘇梗各提取相對·OH的清除能力如圖2所示. 由圖2可見, 1 mg/mL的紫蘇梗乙酸乙酯提取相對·OH的清除能力最強, 清除率達79%; 正丁醇提取相對·OH清除能力最弱.

3) 對DPPH·的清除能力. DPPH·可用于抗氧化成分的體外抗氧化性評價. 紫蘇梗各提取相對DPPH·均有一定的清除能力, 結果如圖4所示. 由圖4可見: 乙酸乙酯提取相清除DPPH·能力最強, 清除率達83%; 氯仿與正丁醇提取相物清除DPPH·的能力相近.

圖3 紫蘇梗各提取相對的清除能力

圖4 紫蘇梗各提取相對DPPH·的清除能力

綜上可見, 紫蘇梗各提取相均具有不同程度的抗氧化作用, 對超氧自由基、 羥自由基及DPPH·自由基均有一定的清除能力.