黃小蘭，周祥德，楊 勤，張椿翊，何旭峰，周 濃

(1.重慶三峽學院 生物與食品工程學院，三峽庫區(qū)道地藥材綠色種植與深加工重慶市工程實驗室，重慶 404100；2.重慶市萬州食品藥品檢驗所，重慶 404100；3.重慶三峽醫(yī)藥高等專科學校 中醫(yī)學院，重慶 404100)

地參為唇形科地筍屬植物毛葉地筍(Lycopuslucidusvar.hirtusRegel)的干燥根莖，其性平味甘，有化瘀止血、益氣利水之功效[1]，是我國名貴的中草藥，其藥用價值在多部古籍中均有介紹?！侗静菔斑z》記載其具有利九竅、通血脈、排膿、治血等作用；《嘉佑本草》記載其能主治一切血病；《四川常用中草藥》中記載其具有調(diào)和氣血、補精髓、治頭暈的作用[2]；現(xiàn)代其作為中藥材收載于2009版《湖南省中藥材標準》[3]。地參不僅有較高的藥用價值，而且還頗具營養(yǎng)價值，其飽滿脆嫩的根莖因營養(yǎng)豐富、味道鮮美而享有“蔬菜珍品”之美譽，是一種傳統(tǒng)的藥食兼用佳品[4-5]。

研究表明，地參含有豐富的糖類、氨基酸、粗蛋白、礦物元素和維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，地參中的總糖含量高達干重的40%以上，是其加工開發(fā)的主要利用物質(zhì)[6-7]。糖類物質(zhì)是植物通過光合作用合成，為自然界中一切生命體提供能量來源，是生命活動不可或缺的物質(zhì)基礎[8]。其中的多糖類成分更是因其在藥理方面的突出作用而備受關注，王文靜等[9]發(fā)現(xiàn)不同采收期的地參多糖具有較強的抗氧化作用；熊偉等[10-11]在將精制的野生地參多糖灌胃給正常和糖尿病小鼠的實驗中發(fā)現(xiàn)，地參多糖具有較好的降血糖、降血脂作用；Yang等[12]研究了地參涼茶的多糖組成及其在改善免疫系統(tǒng)方面的顯著作用。目前，對地參中糖類物質(zhì)的研究主要集中在多糖的提取測定以及生物活性方面[9-14]，尚未見其他糖類物質(zhì)的系統(tǒng)性研究。

本研究以我國云南、江蘇、山東、廣西、重慶等地參主產(chǎn)區(qū)[15]的10批樣品作為研究對象，采用苯酚-硫酸法測定總糖和可溶性多糖含量，3,5-二硝基水楊酸(DNS)顯色法測定其還原糖的含量并進行比較研究，分析其含量分布規(guī)律，旨在為地參的綜合開發(fā)提供基礎數(shù)據(jù)，為藥材的道地性、栽培引種以及多指標質(zhì)量評價體系提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

地參自采或委托采集于全國5個主產(chǎn)區(qū)，詳見表1，重慶三峽學院生物與食品工程學院周濃教授鑒定為唇形科地筍屬植物毛葉地筍(L.lucidusvar.hirtus)的干燥根莖。D-無水葡萄糖對照品(批號：Must-3122601，純度≥98%以上)，成都曼思特生物科技有限公司；苯酚(色譜純)，山東西亞化學股份有限公司；3,5-二硝基水楊酸、鹽酸、濃硫酸、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、碘、碘化鉀等其他化學試劑均為分析純，天津光復試劑有限公司。

表1 地參產(chǎn)地信息

1.2 儀器與設備

TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器責任有限公司)；GL2202-1SCN電子天平(精度0.01 g)、SQP Sartorius電子天平(精度0.000 1 g)(德國Sartorius公司)；KH-2000DB型超聲波清洗機(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；DZKW-S-6型電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)；Sigma4-16S型高速離心機(德國Sigma公司)；試驗用水為娃哈哈純凈水。

1.3 方法

1.3.1 地參樣品的預處理

預處理方法參照湖南省中藥材標準[3]，將地參洗凈泥沙，晾干水分，置于恒溫干燥箱45℃烘干至恒重，將其粉碎過35目篩，備用。

1.3.2 顯色試劑的配制

5%苯酚溶液：精密稱取5.00 g重蒸苯酚，用純凈水溶解并定容至100 mL，搖勻，轉(zhuǎn)至棕色瓶中置4℃冰箱中避光保存，備用。

DNS試劑：(1)稱取2.50 g 3,5-二硝基水楊酸，用純凈水溶解并定容至250 mL，得1% 3,5-二硝基水楊酸溶液。(2)稱取1.725 0 g重蒸苯酚溶于10%氫氧化鈉溶液中，并稀釋至17 mL，加入1.725 0 g亞硫酸氫鈉，溶解即得甲液。稱取63.75 g酒石酸鉀鈉溶于75 mL 10%氫氧化鈉溶液中，加入1% 3,5-二硝基水楊酸溶液220 mL混勻即得乙液。(3)將甲液與乙液混合搖勻即得DNS試劑，貯存于棕色試劑瓶中室溫下放置7 d后使用。

1.3.3 對照品溶液的配制

精密稱取減壓干燥至恒重的D-無水葡萄糖對照品0.171 1 g于100 mL棕色容量瓶中，用純凈水溶解并定容至刻度，得濃度為1.171 mg/mL的對照品儲備液。

1.3.4 供試品溶液的制備

1.3.4.1 總糖供試品溶液 總糖提取參照文獻[16]，稱取地參粉末0.5 g(精確至0.000 1 g)于50 mL離心管中，加入25 mL 10%鹽酸溶液，沸水浴加熱至水解完全。取1滴水解液于白瓷板上，加入1滴碘-碘化鉀試劑，水解液不顯藍色則為水解完全。取出放冷，4 000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液于50 mL容量瓶中，加入20 mL純凈水復提殘渣，合并上清液并定容至刻度，搖勻。精密移取1.00 mL于50 mL容量瓶中，用純凈水定容至刻度，搖勻，即得。

1.3.4.2 可溶性多糖的供試品溶液 取一定量的地參粉末，加入適量石油醚(60～90℃)，在60℃水浴中回流1.5 h進行脫脂，揮干溶劑。稱取0.5 g(精確至0.000 1 g)脫脂樣品于50 mL離心管中，加入80℃蒸餾水20 mL，超聲提取60 min后取出，放至室溫，4 000 r/min離心5 min，取上清液于另一離心管中，殘渣中加水10 mL，重復提取合并上清液。加入Sevage試劑(正丁醇∶三氯甲烷=1∶5，V/V)10 mL，渦旋振蕩，離心，取上清液，加入5倍量的無水乙醇，搖勻，于4℃條件下靜置24 h，棄去上層液，用無水乙醇洗滌沉淀2次，水浴揮干乙醇，用水將沉淀溶解轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，并定容至刻度，搖勻后精密移取1.00 mL于25 mL容量瓶中，用純凈水定容至刻度，搖勻，即得。

1.3.4.3 還原糖的供試品溶液 稱取地參粉末0.5 g(精確至0.000 1 g)于離心管中，加水15 mL，45℃水浴提取60 min，取出放冷，過濾至25 mL容量瓶中，加入8 mL水復提殘渣，合并上清液并定容至刻度，搖勻，即得。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

2.1.1 總糖和可溶性多糖標準曲線

分別移取0.50、1.25、2.50、5.00、7.50、10.00 mL葡萄糖儲備液于50 mL容量瓶中，加水定容至刻度搖勻，制得標準系列工作液。分別取1.00 mL于10 mL比色管中，以1.00 mL純凈水作空白對照，加入1.0 mL 5%苯酚溶液，搖勻，再迅速加入5.0 mL濃硫酸，立即蓋蓋，混勻[13]。置80℃水浴中加熱15 min，取出迅速用流水沖洗冷卻。以空白管校零，于490 nm處測定吸光度，以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程為Y=0.0101X+0.024 2，相關系數(shù)r=0.999 3，在11.71～234.20 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性良好。

2.1.2 還原糖標準曲線

分別吸取0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL葡萄糖儲備液于25 mL比色管中，加水至2.00 mL，以2.00 mL純凈水作空白，加入1.5 mL DNS試劑，搖勻，置于沸水浴中加熱8 min，取出迅速用流水沖洗冷卻，用純凈水定容至25 mL，搖勻。以空白管校零，于520 nm處測定吸光度，以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程為Y=0.014 0X-0.033 3，相關系數(shù)r=0.999 0，在4.68～46.84 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性良好。

2.2 方法學考察

2.2.1 精密度試驗

精密吸取1.00 mL總糖、可溶性多糖和還原糖供試品溶液(S1)各6份，分別按照“2.1.1”和“2.1.2”項下進行顯色測定其吸光度，計算RSD值分別為0.06%、0.32%和0.25%，表明精密度良好，符合分析要求。

2.2.2 重復性試驗

取地參粉末(S1)按“1.3.4”項下對應的方法制備供試品溶液，每個組分平行6份，再分別按照“2.1”項下對應的方法測定吸光度，得總糖、可溶性多糖和還原糖的RSD值分別為0.82%、2.33%和1.40%，表明該方法的重復性良好。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗

精密吸取1.00 mL總糖、可溶性多糖和還原糖供試品溶液(S1)各1份，分別按照“2.1.1”和“2.1.2”項下方法操作，每隔10 min測定吸光度，連續(xù)6次，計算RSD值分別為1.63%、2.66%和0.85%，小于3.00%，表明供試品溶液顯色后至少在60 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.4 加樣回收率試驗

精密稱取已測得總糖和還原糖含量的地參粉末(S1)0.25 g(精確至0.000 1 g)，取可溶性多糖溶液0.5 mL，各6份，分別加入葡萄糖儲備液適量，按“1.3.4”項下對應的方法制備供試品溶液，以“2.1.1”和“2.1.2”項下進行顯色測定吸光度并計算回收率和RSD值。結果顯示總糖、可溶性多糖和還原糖的平均回收率為94.25%～105.10%，RSD值為0.30%～2.12%，符合分析方法要求。

2.3 樣品測定

精密稱取不同產(chǎn)地共10個地參樣品各0.5 g(精確至0.000 1 g)，每個組分平行3份，分別按“1.3.4”項下對應的方法制備供試品溶液，以“2.1.1”和“2.1.2”項下進行顯色測定吸光度，計算總糖、可溶性多糖和還原糖的含量，結果以±s表示，詳見表2。結果表明，10批地參樣品中，總糖含量介于39.62%～51.20%之間，平均含量為46.14%，比許泳吉[7]對野生地參中總糖的研究結果略高，表明地參在栽培過程中予以施肥和人工管理后品質(zhì)更優(yōu)。從地理位置來看，云南大理、騰沖、昆明以及廣西玉林樣品總糖含量相對較高。這是因為西南地區(qū)日照充足，降雨豐沛，地參生長過程中有足夠的光合作用來合成糖類物質(zhì)，因此總糖含量豐富?？扇苄远嗵呛繛?5.80%～21.98%，平均含量為18.10%；還原糖含量為1.27%～3.83%，平均含量2.54%。3種糖在不同產(chǎn)區(qū)樣品間存在一定差異，其中以可溶性多糖和還原糖的差別較大，從可溶性多糖來看，產(chǎn)自江蘇沛縣(S9)樣品中可溶性多糖含量最高，是平均值的1.21倍，產(chǎn)自重慶萬州(S1)的地參含量較低，低于平均含量的13%，可溶性多糖作為地參品質(zhì)評價的重要指標，藥理作用的重要角色，在我國地域上呈現(xiàn)出了北方>南方>西南方的趨勢，再次驗證了黃小蘭等[17]前期對地參中多糖的單糖組成的研究結果；同時，在還原糖方面，以重慶萬州(S1)產(chǎn)區(qū)的含量最高，是平均含量的1.51倍，云南大理(S2)的含量最低，低于平均含量的50%。整體上看，還原性糖與總糖含量呈反比趨勢，總糖含量高的產(chǎn)地，還原性糖含量偏低，總糖含量低的產(chǎn)地，還原性糖含量偏低，這可能與還原性糖的還原性質(zhì)有關[18]，具體原因有待于進一步探究。

從不同產(chǎn)區(qū)地參中總糖、可溶性多糖和還原糖的組成結構上看，重慶萬州的結構比(成分之間含量的比)為11∶4∶1，廣西玉林(S5)22∶13∶1，山東菏澤為18∶7∶1，云南產(chǎn)區(qū)的3個樣本(S2、S3、S4)平均結構比為38∶13∶1，江蘇產(chǎn)區(qū)的4個不同樣本(S7、S8、S9、S10)平均結構比為15∶7∶1。從不同地參的結構比上發(fā)現(xiàn)，地理緯度相近的云南、廣西產(chǎn)區(qū)和江蘇、山東產(chǎn)區(qū)在3種糖的結構比例上相似度極高，而在我國南方和北方卻表現(xiàn)出較大差異。由此表明糖分的積累跟地理位置、環(huán)境條件等因素有關。

表2 不同產(chǎn)地地參中總糖、可溶性多糖和還原糖的測定結果(n=3)

2.4 聚類分析

以總糖、可溶性多糖和還原糖的含量作為變量，采用SPSS 20.0軟件對不同產(chǎn)區(qū)的10批地參樣品進行統(tǒng)計分析，當歐式距離為15時，10批地參被分為3類。其中S2、S3、S4、S5聚為第Ⅰ類；S1、S6、S7、S10聚為第Ⅱ類；S8、S9聚為第Ⅲ類，結果見圖1。聚類分析將云南以及鄰近的廣西產(chǎn)區(qū)聚為一類，這與它們相近的含量和相似的結構比密切相關；同時江蘇鹽城(S8)和江蘇沛縣(S9)因其較高的可溶性多糖和還原糖含量被聚為一類，品質(zhì)最佳；另一方面北方的山東菏澤(S6)、江蘇徐州(S7)、江蘇宿遷(S10)與西南方的重慶萬州(S1)存在交叉，沒有完全區(qū)分開，因為這幾個產(chǎn)區(qū)在我國地理位置上同屬北緯30°～35°范圍內(nèi)，日照量接近。從整體上看，5個大產(chǎn)區(qū)10個小產(chǎn)地根據(jù)緯度不同被分成了南北2類，與含量結果測定相符，表明生態(tài)因子對地參中糖類成分的積累存在一定影響。

圖1 不同產(chǎn)地地參樣品聚類結果Fig. 1 Clusteranalysis of L. lucidus var. hirtus from different habitats

3 討論

本研究測定還原糖時采用了3,5-二硝基水楊酸(DNS)顯色法，由于此法在不同樣品檢測中波長存在差異，既要考慮是否有最大吸收，同時要兼顧該波長下結果的穩(wěn)定性[19]，故本試驗分別以DNS試劑作為空白對葡萄糖對照品顯色液、供試品顯色液以及以純水作為空白，對DNS試劑和供試品顯色液在400～800 nm范圍內(nèi)進行光譜掃描，在兼顧最大吸收和排除干擾的情況下，確定最佳波長為520 nm。通過方法學考察，該法具有操作簡單、專屬性強、靈敏度高、回收率及精密度良好等優(yōu)點。

還原糖是指具有還原性的糖類，一般是含醛基或酮基的單糖、含醛基的二糖，不僅在有機體的代謝中起著重要作用[20]，其含量的高低更關系到地參后期加工[21]?？偺鞘撬苄蕴呛退蝗苄远嗵堑目偤停ㄟ€原糖、測定條件下能水解為還原性單糖的二糖和低聚糖，以及可能部分水解的淀粉?？扇苄远嗵鞘堑貐⒌闹饕钚猿煞郑哂锌寡趸?、降血糖血脂、抗腫瘤以及改善免疫系統(tǒng)的作用。因此，地參中糖類物質(zhì)的含量是其品質(zhì)評價的重要指標。

本試驗對不同產(chǎn)地地參中總糖、可溶性多糖和還原糖的含量進行測定，旨在分析出內(nèi)在規(guī)律。結果發(fā)現(xiàn)，糖類物質(zhì)在不同產(chǎn)地間存在差異，以總糖來看，南方的云南和廣西產(chǎn)區(qū)含量較高，平均值為50.17%；以可溶性多糖來看，北方的5個樣品平均含量最高，為18.70%；從還原糖方面看，北方高出南方2倍左右，與西南地區(qū)的重慶萬州相差無幾；從3種糖類物質(zhì)的內(nèi)在結構比上看，緯度為22°～26°的南方產(chǎn)區(qū)結構比更為接近，能很好的聚為一類，緯度為31°～35°的北方、西南方產(chǎn)區(qū)一致性較好，這可能與不同緯度條件下日照的長短有關。這一檢測結果，不僅為地參產(chǎn)品的綜合開發(fā)提供了新的思路，而且為其栽培引種指明了方向，還為其結合三萜類、酚酸類等其他成分指標進行多指標質(zhì)量評價提供科學依據(jù)。