劉 權(quán)劉 雨李艷艷楊鳳梅馬 進和占龍禹文海趙 遠

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所,云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點實驗室,昆明 650118)

奇異變形桿菌(Proteus mirabilis,P.mirabilis)屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae),是一種無莢膜、無芽孢的革蘭氏陰性桿菌[1-2]。該菌在自然界中分布較廣,主要存在于土壤、水源、人和大小家畜以及各種經(jīng)濟動物的糞便中,是一種條件致病菌。當(dāng)人和動物體質(zhì)較差,免疫力低下時,該菌容易和其他細菌混合感染,造成腸道、血液、呼吸系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)等多處出現(xiàn)炎癥病變,導(dǎo)致人和動物發(fā)病[3-4],人誤食奇異變形桿菌污染的食品從而引起食物中毒事件的報道屢見不鮮[5-8]。有研究報道,經(jīng)濟動物如鴿子、狐貍、貂也受到奇異變形桿菌的感染[9-12]。該菌在人工飼養(yǎng)的獼猴群體中廣泛流行,趙遠等[13]研究發(fā)現(xiàn)離乳嬰猴感染奇異變形桿菌,造成4只死亡。劉國璋等[14]在福建某實驗中心獼猴場,研究發(fā)現(xiàn)感染奇異變形桿菌病例,導(dǎo)致21只死亡,Povar等[15]研究發(fā)現(xiàn)恒河猴感染奇異變形桿菌出現(xiàn)急慢性腸胃炎的臨床癥狀。因此,本試驗對新引進食蟹猴(Macaca fascicularis)檢疫期進行帶菌情況檢測,并對分離到的奇異變形桿菌菌株進行耐藥性和致病性分析,為今后食蟹猴飼養(yǎng)管理、疾病防控和臨床用藥提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所從云南金杰康生物科技有限公司引進食蟹猴60只,普通級[SCXK(滇)K2018-0002],年齡6～8歲,體重 3.5～5.0 kg,單籠飼養(yǎng)于隔離檢疫動物房[SYXK(滇)K2015-0006];SPF級ICR小鼠9只,體重18～20 g,來源于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所[SCXK(滇)K2019-0002],實驗操作在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所實驗動物部屏障動物實驗設(shè)施進行[SYXK(滇)K2019-0003]。實驗過程嚴格遵循實驗動物使用的3R和福利倫理原則,實驗經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所倫理委員會審核批準(DWSP201812008)。

1.2 主要試劑與儀器

SS瓊脂(青島海博生物技術(shù)有限公司,批號：20180813);GN增菌液(青島海博生物技術(shù)有限公司,批號：20190226);普通肉湯(青島海博生物技術(shù)有限公司,批號：20180318);三糖鐵瓊脂(青島海博生物技術(shù)有限公司,批號：20190312);生化試驗用培養(yǎng)基(青島海博生物技術(shù)有限公司,批號：20180806);藥敏片(溫州康泰生物有限公司,批號：QL2509Z1)。ID32E 生化鑒定試紙條、ATB Expression儀、ATBTMNew軟件均購自法國梅里埃公司;顯微鏡(日本OLYMPUS,型號CX31);病理成像系統(tǒng)(日本NIKON,型號digital sight DS-FI2);恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司,型號DHP-9082)。

1.3 實驗方法

1.3.1 細菌分離與培養(yǎng)

對60只食蟹猴肛拭子采集糞樣接種到GN增菌液,37℃培養(yǎng)24 h,觀察結(jié)果。挑取瓊脂平皿上可疑單個典型菌落接種于三糖鐵瓊脂,37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h。

1.3.2 生化試驗

采用由法國梅里埃公司提供的ATB Expression儀配套ID32E生化鑒定試紙條完成。將分離到的菌株置于0.85%NaCl中,混勻,用比濁儀調(diào)整成濃度為108CFU,用加樣槍將適量體積的菌懸液加至檢測試條孔內(nèi),滴加礦物油覆蓋,蓋上試紙條蓋子,37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h,使用ATBTMNew軟件判讀實驗結(jié)果。

1.3.3 染色鏡檢

挑取可疑菌落及純培養(yǎng)物涂片、革蘭氏染色后鏡檢。

1.3.4 藥敏試驗

對分離到的菌株采用紙片擴散法進行抗生素藥物的敏感性試驗,37℃培養(yǎng)24 h之后取出,最后觀察結(jié)果并用直尺測量抑菌環(huán)直徑大小(mm)。結(jié)果的判定標準參考美國臨床藥敏試驗標準1999-2005年頒布的藥敏和規(guī)定進行試驗和判定結(jié)果[16]。

1.3.5 動物致病性試驗

實驗小鼠隨機分成實驗組6只和對照組3只。挑選分離培養(yǎng)到的1株奇異變形桿菌用0.85%NaCl溶液稀釋制成菌液,用ATB比濁儀調(diào)整為濃度3.5 Mcf。實驗組每只腹腔注射菌液0.5 mL,對照組每只腹腔注射0.85%NaCl溶液0.5 mL,觀察并記錄臨床癥狀和發(fā)病致死情況。采集不同組織及腸段內(nèi)容物重復(fù)1.2.1～1.2.2進行分離鑒定。

2 結(jié)果

2.1 細菌培養(yǎng)特征

可疑菌株在SS培養(yǎng)基上形成的中間黑色周圍無色透明的菌落。在三糖鐵培養(yǎng)基上出現(xiàn)淡藍色透明菌落,較扁平、薄、中央為黑色。鏡下可見菌株為革蘭氏陰性桿菌,兩端鈍圓,單個或多個鏈條狀的小桿菌,無莢膜和芽孢。

2.2 生化鑒定結(jié)果

采用三糖鐵培養(yǎng)基進行菌株的分離純培養(yǎng),用ID32E生化鑒定試紙條和ATB Expression儀器檢測分析,鑒定試紙條編碼：11001101002,生化鑒定結(jié)果顯示該分離菌株為奇異變形桿菌,見表1。結(jié)果顯示60只食蟹猴糞便中分離到8株奇異變形桿菌,食蟹猴該菌攜帶率為13.3%。

2.3 藥敏試驗結(jié)果

藥敏結(jié)果顯示該菌株對頭孢曲松、頭孢賽肟,頭孢哌酮、頭孢唑啉、青霉素等高度敏感,對阿米卡星、慶大霉素、氨芐西林鈉、呋喃妥因等中度敏感,對諾氟沙星、四環(huán)素、低度敏感、對桿菌肽、環(huán)丙沙星、卡那霉素、林可霉素和呋喃唑酮產(chǎn)生耐藥性,見表2。

2.4 動物致病性試驗結(jié)果

試驗組6只小鼠在5～6 h內(nèi)出現(xiàn)精神狀態(tài)較差,活動量減少,嗜睡,呼吸、心跳加快等癥狀,在12 h內(nèi)全部死亡,致死率為100%,對死亡小鼠腸道內(nèi)容物進行培養(yǎng),分離到奇異變形桿菌。對照組3只小鼠未出現(xiàn)異常的臨床癥狀。經(jīng)解剖發(fā)現(xiàn),實驗組小鼠十二指腸,空腸、回腸和盲腸處見出血、淤血、充血和脹氣現(xiàn)象,見圖1A。與對照組病理結(jié)果比較顯示,實驗組小鼠十二指腸絨毛較短,肌層較窄(黑色箭頭),回腸固有層少量毛細血管淤血擴張,管腔內(nèi)還可見少量白細胞(紅色箭頭),空腸固有層少量毛細血管淤血擴張,管腔內(nèi)可見少量中性粒細胞(紅色箭頭),結(jié)腸固有層較多毛細血管淤血擴張,部分管腔內(nèi)還可見少量中性粒細胞(黑色箭頭),固有層內(nèi)少量炎性細胞浸潤(紅色箭頭),盲腸黏膜層上皮不完整,可見部分上皮細胞壞死脫落,胞核碎裂,胞質(zhì)嗜酸性增強(黑色箭頭),腸腺排列疏松,間隙增寬(紅色箭頭),固有層內(nèi)少量炎性細胞浸潤(黃色箭頭),結(jié)果表明該菌株對小鼠有較強的致病性,見圖1B。

3 討論

奇異變形桿菌分布較為廣泛,主要來源于大小動物和人的體表、消化道、粘膜等組織和臟器中[17]。有研究報道,飼養(yǎng)家畜豬、雞、羊等也容易被該菌感染而發(fā)病[18-20],劉國璋等[14]1996年首次發(fā)現(xiàn)獼猴與人感染奇異變形桿菌造成死亡的研究報道以來,陸續(xù)出現(xiàn)了獼猴感染奇異變形桿菌的報道。研究發(fā)現(xiàn),在不同年齡階段的獼猴群體都感染奇異變形桿菌,尤其對于7～8月齡的嬰猴,其感染率可達19%[13]。禹文海等[21]應(yīng)用PCR方法檢測正常飼養(yǎng)的恒河猴群中,該菌攜帶率為2.5%,福建某獼猴養(yǎng)殖場該菌攜帶率為2.9%,本試驗研究對象為新入場檢疫的食蟹猴,其帶菌率達到13.3%,推測猴群在長途運輸過程中,因環(huán)境改變、途中衛(wèi)生條件較差、應(yīng)激等因素造成機體免疫力下降引起交叉感染導(dǎo)致感染率高于正常飼養(yǎng)群體。

表1 分離菌株的生化鑒定結(jié)果Table 1 Biochemical identification results of isolated strains

表2 藥敏實驗結(jié)果Table 2 Results of drug sensitivity experiment

圖1 小鼠各臟器病變圖Note.A,Lesions of each intestinal segment in mice.B,HE staining results of pathological sections of each intestinal segment in mice.Figure 1 Pathological changes of various organs of mice

藥敏試驗結(jié)果表明該菌對頭孢曲松、頭孢賽肟,頭孢哌酮、頭孢唑啉、青霉素等高度敏感,對阿米卡星、慶大霉素、氨芐西林鈉、呋喃妥因等中度敏感,對諾氟沙星、四環(huán)素、低度敏感、對桿菌肽、環(huán)丙沙星、卡那霉素、林可霉素和呋喃唑酮產(chǎn)生耐藥性。本試驗藥敏結(jié)果耐藥性藥物和低度敏感藥物：四環(huán)素、呋喃類藥、慶大霉素3種與劉國璋等[14]、陳武等[22]兩個猴場藥敏耐藥性結(jié)果相當(dāng)。頭孢菌素類抗生素4種藥物高度敏感與趙遠等[13]和王艷君等[23]人工哺育期腹瀉嬰猴奇異變形桿菌的分離與鑒定和一株松鼠猴奇異變形桿菌的分離與鑒定藥敏試驗結(jié)果相當(dāng)。在臨床上,抗生素喹諾酮類、氨基糖苷類,四環(huán)素類,硝基呋喃類不作為抗菌藥物治療。諾氟沙星出現(xiàn)低度敏感與王俊書等[24]兔奇異變形桿菌的分離鑒定及耐藥性分析檢測結(jié)果相當(dāng)。根據(jù)藥敏結(jié)果,頭孢類抗生素可作為該病治療的首選藥,其次可考慮阿米卡星和青霉素類來進行治療。

致病性結(jié)果顯示,該菌株對小鼠有較強致病性,能引起小鼠發(fā)病死亡,對死亡小鼠解剖和病理結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)奇異變形桿菌主要感染腸道系統(tǒng),解剖發(fā)現(xiàn)在十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸等處出現(xiàn)充血和淤血跡象,以十二指腸、空腸和盲腸較為明顯,病理切片結(jié)果顯示感染小鼠各腸段均出現(xiàn)不同程度的病理改變,并在攻毒小鼠腸道內(nèi)分離到該菌株,說明該菌株能夠感染小鼠并引起死亡,對小鼠有較強的致病性。同時,在檢測到該細菌的8只食蟹猴中有4只先后出現(xiàn)不同程度腹瀉,其中2只出現(xiàn)重度脫水,經(jīng)抗生素治療后4只腹瀉猴均治愈。

通過以上研究結(jié)果表明,作為規(guī)?；瘜嶒灪镳B(yǎng)殖場,應(yīng)嚴格做好引進猴的檢疫工作,防止外來病原在養(yǎng)殖場內(nèi)的傳播。另外,盡管奇異變形桿菌不是普通級獼猴要求排除的病原,但其有一定致病力,有必要對場內(nèi)動物進行定期監(jiān)測,采取有效的防控措施來控制本病的流行與傳播,同時做好飼養(yǎng)環(huán)境、動物飼料及實驗人員衛(wèi)生,防止人獸共患傳染病的發(fā)生。