王 敏李作孝

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,四川瀘州 646000)

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis,MS)是一種以彌漫性炎性脫髓鞘為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病,目前沒有任何藥物能夠完全預(yù)防或逆轉(zhuǎn)其漸進性神經(jīng)系統(tǒng)病變[1]。實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)是研究MS的經(jīng)典動物模型。MS和EAE發(fā)病主要由T細胞,尤其是CD4+T亞群介導(dǎo)。盡管如此,MS發(fā)病機制仍不清楚。研究顯示Janus激酶/信號轉(zhuǎn)換轉(zhuǎn)錄激活子(JAK/STAT)信號通路通過傳導(dǎo)多種炎性細胞因子信號參與EAE的發(fā)病過程[2]。并且有研究顯示STAT3可誘導(dǎo)維甲酸相關(guān)的孤兒受體γt(RORγt)的表達,驅(qū)動原始 CD4+T細胞向Th17細胞分化,從而導(dǎo)致Th17/Treg免疫失衡發(fā)揮致病作用[3]。Th17細胞產(chǎn)生促炎性細胞因子,主要是IL-17,有助于炎癥和脫髓鞘的發(fā)生。而細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制子(SOCS)蛋白家族能抑制 JAK/STAT信號通路發(fā)揮負調(diào)控作用[4]。復(fù)方甘草酸苷(compound glycyrrhizin,CG)是中藥甘草的提取物,具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、保護神經(jīng)以及促進髓鞘再生的作用[5]。受此啟發(fā),本研究建立了小鼠EAE模型,通過觀察各組小鼠臨床癥狀、脊髓組織炎癥及脫髓鞘情況,同時檢測腦組織 JAK2、STAT3及SOCS3蛋白含量及其 mRNA的表達以及 RORγt、Foxp3mRNA的表達,探討CG對EAE小鼠的防治作用及其可能機制,為MS的治療提供新的策略。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

雌性SPF級C57BL/6小鼠50只,8周齡,體重18～22 g,購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2016-0002],于西南醫(yī)科大學(xué)忠山動物房[SYXK(川)2018-065]飼養(yǎng),環(huán)境清潔,室內(nèi)通風(fēng)良好,保持室溫25℃左右,12 h明暗交替,食料和飲水充足。實驗方案通過西南醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會動物福利倫理審查(201912-8),并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 主要試劑

CG注射液(商品名“美能”,每支20 mL)購自衛(wèi)材(中國)藥業(yè)有限公司;小鼠髓鞘少突膠質(zhì)細胞糖蛋白多肽段(MOG35-55)購自上海吉爾生化有限公司;福氏完全佐劑和百日咳毒素均購自美國Sigma公司;兔抗JAK2購自美國CST公司;兔抗STAT3、SOCS3及GAPDH抗體均購自英國Abcam公司;山羊抗兔HRP購自美國Aspen公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組及EAE模型制作

50只C57BL/6小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后,隨機分為5組：空白組、模型組和CG低、中、高劑量干預(yù)組,每組 10只。將 MOG35-55溶于 PBS中,稀釋為3 mg/L,結(jié)核分支桿菌溶入福氏完全佐劑中稀釋為5 mg/L,兩種液體按1∶1于冰上充分乳化制成油包水狀抗原乳劑。模型組和CG各干預(yù)組每只小鼠于脊柱兩側(cè)分四點皮下注射0.2 mL抗原乳劑,空白組小鼠注射等體積生理鹽水。造模當(dāng)日記作第0天,模型組和CG各干預(yù)組分別于造模第0天和第2天尾靜脈注射百日咳菌毒素提高模型成功率,每只500 ng。

1.3.2 藥物配置及干預(yù)

將CG用生理鹽水稀釋為1/2原液、1/4原液備用,本實驗藥物劑量濃度按照人和動物間體表面積等效劑量比值計算CG低、中、高劑量分別為15、30、60 mg/(kg·d),CG 1/4原液、1/2原液、原液分別給予CG低、中、高劑量干預(yù)組小鼠,則CG各干預(yù)組每只小鼠給藥體積均為30 mL/kg。自造模第1天起,CG低、中、高劑量干預(yù)組每只小鼠分別腹腔注射1/4 CG原液、1/2 CG原液、CG原液30 mL/kg,連續(xù)注射14 d,每日1次?？瞻捉M及EAE模型組每只小鼠腹腔注射生理鹽水30 mL/kg,連續(xù)注射14 d,每日1次。

1.3.3 小鼠一般情況觀察及神經(jīng)功能缺損評分

造模第0天起每天同一時間觀察小鼠精神情況、飲食活動,行神經(jīng)功能缺損評分。使用改良Kono’5分法[6],神經(jīng)功能缺損評分如下：0分：正常;0.5分：小鼠僅尾部尖端下垂;1分：尾部拖地;1.5分：單后肢不完全癱瘓;2分：單后肢完全癱瘓;2.5分：單后肢癱瘓伴另一后肢不完全癱瘓;3分：雙后肢完全癱瘓;3.5分：雙后肢癱瘓伴一前肢癱瘓;4分：四肢癱瘓;5分：死亡。

1.3.4 脊髓組織HE染色

各組小鼠在第30天處死,取脊髓組織,4%多聚甲醛固定36 h后制作石蠟切片。石蠟切片脫蠟后用蒸餾水洗滌。切片置入Harris蘇木素和伊紅染液染色,脫水,封片。

1.3.5 蛋白提取和Western blot分析

各組小鼠在第30天處死,取少量腦組織,剪碎加入RIPA裂解緩沖液,30 min后將所得裂解液4℃離心5 min,取上清液,即為總蛋白溶液。BCA法檢測蛋白濃度。樣品用SDS-PAGE電泳分離,將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜完成后,加入密封溶液,室溫封閉1 h。去盡封閉液,加入一抗稀釋劑,4℃孵育過夜。一抗稀釋劑為兔抗JAK2、STAT3及SOCS3抗體(1∶1000稀釋)。第2天取出條帶,用TBST洗滌3次,每次5 min。加入二抗稀釋劑(山羊抗兔HRP抗體),室溫孵育30 min。加入ECL混合發(fā)光溶液(A液∶B液=1∶1),暗室中曝光,顯影、定影。使用AlphaEaseFC軟件處理結(jié)果,以GAPDH為內(nèi)部參數(shù),計算蛋白的相對表達。

1.3.6 RNA提取及實時熒光定量RT-PCR

各組小鼠在第30天處死,取大腦組織約100 mg,用TRIpure試劑分離得到總RNA,用EntiLinkTM1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒(ELK Biotechnology,EQ003)按照制造商的說明逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。 設(shè)計針對 JAK2、STAT3、SOCS3、RORγt及Foxp3的引物(所有引物均由武漢金開瑞生物工程有限公司合成,見表1,在StepOneTMReal-Time PCR儀(Life technologies公司)上擴增基因片段,每個樣品均作3個復(fù)孔。反應(yīng)在95℃熱啟動3 min,然后在95℃進行10 s(變性)、58℃進行30 s(復(fù)性)和72℃進行30 s(延伸),變性、復(fù)性、延伸三個過程循環(huán)40次。以GAPDH為內(nèi)部參數(shù),通過2-ΔΔCT方法計算基因含量的相對表達。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS 22.0軟件行統(tǒng)計學(xué)分析和處理數(shù)據(jù),實驗中獲得的所有數(shù)據(jù)均為計量數(shù)據(jù),表示方法為平均數(shù)±標(biāo)準差(±s)。單因素方差分析用于多組間比較,LSD-t檢驗用于各組之間的兩兩比較。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠臨床表現(xiàn)及神經(jīng)功能缺損評分

空白組小鼠未發(fā)病。模型組及CG各干預(yù)組在第8～9天開始先后出現(xiàn)臨床癥狀,主要表現(xiàn)為飲食減少、體重下降、活動減慢,行走時可見拖尾;第14～17天后迅速達發(fā)病高峰,表現(xiàn)為不同程度的肢體癱瘓甚至死亡,經(jīng)歷短暫的高峰期后,癥狀逐漸緩解,肢體癱瘓逐漸恢復(fù),見圖1。經(jīng)藥物干預(yù)后發(fā)現(xiàn)：與模型組比較,CG各干預(yù)組小鼠臨床癥狀減輕,多表現(xiàn)為尾部尖端下垂、單后肢癱瘓或不完全癱瘓,劑量越大癥狀越輕。且與模型組比較,CG各干預(yù)組最高神經(jīng)功能缺損評分及累計神經(jīng)功能缺損評分降低(P＜0.05),干預(yù)劑量越大,最高神經(jīng)功能缺損評分及累計神經(jīng)功能缺損評分越低(P＜0.05),見表2。

2.2 各組小鼠脊髓病理學(xué)改變

空白組脊髓組織幾乎未見炎性細胞浸潤,髓鞘結(jié)構(gòu)相對正常;EAE模型組及CG各干預(yù)組脊髓組織有不同程度的炎性細胞浸潤,以單核細胞為主,脊髓前索及側(cè)索白質(zhì)處髓鞘結(jié)構(gòu)松散,崩解脫失,但與EAE模型組比較,CG各干預(yù)組脊髓組織的炎性細胞浸潤及脫髓鞘程度均明顯減輕,見圖2。

2.3 各組小鼠腦組織JAK2、STAT3及SOCS3蛋白的表達

與空白組比較,模型組JAK2、STAT3的蛋白表達明顯升高(P＜0.05),負性調(diào)控因子SOCS3蛋白表達明顯降低(P＜0.05);經(jīng)藥物干預(yù)后發(fā)現(xiàn)：與模型組比較,CG各劑量干預(yù)組JAK2、STAT3蛋白表達均明顯降低(P＜0.05),負性調(diào)控因子SOCS3蛋白表達升高(P＜0.05),且干預(yù)劑量越大,蛋白表達變化越明顯(P＜0.05),見圖3、表3。

表1 RT-PCR引物序列Table 1 RT-PCR primer sequence

圖1 各組神經(jīng)功能缺損評分Figure 1 Neurological deficit score of each group

表2 模型組及CG各干預(yù)組最高神經(jīng)功能缺損評分及累計神經(jīng)功能缺損評分比較(n=10)Table 2 The highest neurological deficit score and the cumulative neurological deficit score were compared between model group and three CG intervention groups

圖2 各組小鼠脊髓組織HE染色Note.A,Control group.B,Model group.C,Low-dose CGgroup.D,Medium-dose CGgroup.E,High-dose CGgroup.Figure 2 HE staining of spinal cord tissue in each group of mice

圖3 各組Western blot檢測JAK2、STAT3、SOCS3表達情況Note.1,Control group.2,Model group.3,Low-dose CG group.4,Medium-dose CG group.5,High-dose CG group.Figure 3 Western blot analysis showing the expressions of JAK2、STAT3、SOCS3 in the mice

2.4 各組小鼠腦組織的 JAK2 mRNA、STAT3 mRNA及SOCS3 mRNA的表達

與空白組比較,模型組 JAK2 mRNA、STAT3 mRNA升高(P＜0.05),SOCS3 mRNA降低(P＜0.05);經(jīng)藥物干預(yù)后發(fā)現(xiàn)：與EAE模型組比較,CG各劑量干預(yù)組JAK2 mRNA、STAT3 mRNA均顯著降低(P＜0.05),SOCS3 mRNA 顯著升高(P＜0.05),與劑量呈依賴性(P＜0.05),見表4。

2.5 各組小鼠腦組織Th17/Treg細胞關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達

與空白組比較,模型組RORγt mRNA升高(P＜0.05),Foxp3 mRNA降低(P＜0.05);經(jīng)藥物干預(yù)后發(fā)現(xiàn)：與模型組比較,CG各劑量干預(yù)組 RORγt mRNA顯著降低(P＜0.05),Foxp3 mRNA顯著升高(P＜0.05),干預(yù)劑量越大,作用效果越明顯(P＜0.05),見表 5。

表3 各組小鼠腦組織JAK2、STAT3及SOCS3蛋白的表達Table 3 Expression of JAK2,STAT3 and SOCS3 proteins in brain tissues of mice in each group

表4 各組小鼠腦組織JAK2 mRNA、STAT3mRNA及SOCS3 mRNA的表達Table 4 Contents of JAK2 mRNA,STAT3mRNA and SOCS3 mRNA in brain tissues of mice in each group

表5 各組小鼠腦組織Th17/Treg細胞關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達Table 5 Expression of key transcription factors of Th17/Treg cells in brain tissue of mice in each group

3 討論

MS是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病,其主要特征為多中心炎癥和脫髓鞘[7]。EAE是國際公認的研究MS病理過程的理想動物模型[8]。目前治療MS的疾病修飾藥物是否可以延緩臨床進展以及是否安全仍存在爭議。CG是以甘草酸(Glycyrrhizic acid,GL)(亦稱甘草甜素)為主要活性物質(zhì),并輔以甘氨酸、半胱胺酸以及蛋氨酸等組成的復(fù)方制劑。而甘草次酸(Glycyrrhetinic acid,GA)是GL的主要活性代謝產(chǎn)物,是GL的非糖部分,被認為是GL大部分藥理特性的原因。CG為甘草酸類第二代制劑,以β體甘草酸單銨鹽為主要成分。甘草具有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、保護神經(jīng)以及促進髓鞘再生的作用,且被廣泛用于濕疹、蕁麻疹、過敏性紫癜、銀屑病、潰瘍性結(jié)腸炎等免疫相關(guān)疾病的治療。Tabuchi等[9]研究顯示GA可以滲透血腦屏障到達大腦。Jia等[10]用甘草甜素治療BALB/c小鼠模型的坐骨神經(jīng)損傷,結(jié)果表明,與甘草甜素低劑量組或?qū)φ战M相比,甘草甜素高劑量和中劑量能促進坐骨神經(jīng)髓鞘形成。Li等[11]研究發(fā)現(xiàn),GL可以通過降低HMGB1水平,滅活星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞以及抑制神經(jīng)元損傷來降低EAE的嚴重程度。受此啟發(fā),本實驗建立MS的動物模型EAE,并使用CG干預(yù)模型,以期尋找MS的潛在治療藥物。結(jié)果顯示：與EAE模型組比較,CG各干預(yù)組小鼠肢體癱瘓程度減輕,脊髓組織炎性細胞浸潤及脫髓鞘程度明顯減輕。另外,CG各干預(yù)組最高神經(jīng)功能缺損評分及累計神經(jīng)功能缺損評分明顯降低,且呈劑量依賴性。表明CG能減輕EAE小鼠的病情進展,可能對EAE小鼠發(fā)揮防治作用。

JAK/STAT信號通路能調(diào)控大量炎性細胞因子(如 IL-6、IL-12、IL-22、IL-23 等)的生物學(xué)活動,廣泛參與炎癥、細胞增殖及免疫調(diào)節(jié)等病理生理過程[12]。已證實JAK/STAT信號通路的異?；钴S與EAE發(fā)病密切相關(guān)[13]。至今發(fā)現(xiàn)JAKs有四種亞型,分別為JAK1-3和TYK2。STAT位于JAK下游,是信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子,STAT家族包括STAT1-4、STAT5a、STAT5b以及 STAT6。 當(dāng)細胞外信號(IL-6等)與目標(biāo)細胞對應(yīng)受體結(jié)合,JAKs被激活,胞漿中STATs單體磷酸化形成二聚體,二聚體進入細胞核內(nèi)與特定的DNA序列結(jié)合,誘導(dǎo)目標(biāo)基因表達,以調(diào)控特定細胞因子的表達[14]。不同的T細胞亞群被這些特定細胞因子激活后,又產(chǎn)生大量炎性細胞因子來驅(qū)動炎癥,開啟持續(xù)炎癥級聯(lián)反應(yīng),引起腦、脊髓、視神經(jīng)的慢性炎癥和神經(jīng)元變性,促進少突膠質(zhì)細胞凋亡和脫髓鞘[2,15]。而SOCS是該通路的主要負調(diào)控機制之一。SOCS家族成員有SOCS1-7及CIS[16]。研究發(fā)現(xiàn)在動物模型[17-18]和體外實驗[19]中,GL均顯示出抑制JAK/STAT信號途徑的作用,從而減輕了炎癥反應(yīng)。本實驗結(jié)果顯示,與空白組比較,EAE模型組JAK2、STAT3的蛋白表達量及其mRNA含量均上調(diào),同時SOCS3在EAE小鼠體內(nèi)的表達明顯下調(diào),且以高劑量組為甚,表明負性調(diào)控因子SOCS3的缺失及JAK2、STAT3的異?；罨鶇⑴cEAE小鼠的發(fā)病過程,這與既往研究一致。進一步研究發(fā)現(xiàn),與EAE模型組比較,CG干預(yù)后能降低JAK2、STAT3蛋白及其mRNA的表達,同時SOCS3的蛋白及其mRNA的表達增高,且以高劑量組為甚。由此證明,CG可能通過上調(diào)負性調(diào)控因子SOCS3以及抑制JAK2/STAT3信號通路的異?；罨?以抑制炎癥級聯(lián)反應(yīng),減輕EAE小鼠臨床癥狀,發(fā)揮對EAE小鼠的防治作用。

另外JAK/STAT信號通路還能調(diào)控細胞影響幼稚CD4+T細胞的分化方向參與MS/EAE發(fā)病。眾所周知,IL-6通過激活T細胞gp130-STAT3途徑直接促進Th17細胞的發(fā)育[20]。Th17細胞能高分泌IL-17 A、IL-17F、IL-22和IL-23,介導(dǎo)自身免疫反應(yīng),在MS/EAE中發(fā)揮致病作用,RORγt是誘導(dǎo)幼稚CD4+T細胞向Th17細胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[21-22]。而STAT3是誘導(dǎo)RORγt所必需的。Yang等[23]研究揭示了在STAT3缺陷的Th細胞中RORγt的表達大大降低,同時觀察到轉(zhuǎn)錄因子叉頭框蛋白P3(Foxp3)表達升高。因此,STAT3和RORγt在幼稚CD4+T細胞分化為Th17細胞中起關(guān)鍵作用。Treg細胞產(chǎn)生細胞因子IL-10和TGF-β抑制自身免疫性疾病,與Th17細胞相互拮抗以維持免疫穩(wěn)態(tài),Foxp3是Treg細胞發(fā)育和發(fā)揮功能的主調(diào)節(jié)因子[24-25]。據(jù)報道,GL可以有效抑制Th17的分化和信號傳導(dǎo)[26]。本研究發(fā)現(xiàn),CG明顯下調(diào)了EAE小鼠的STAT3和RORγt的表達,同時Foxp3的表達上調(diào)。提示CG可以上調(diào)保護性因子Foxp3的表達并抑制炎癥性因子RORγt的表達以糾正Th17/Treg免疫失衡,從而使Th17/Treg細胞平衡向有利于Treg細胞的方向分化,減輕EAE小鼠炎性反應(yīng)。

綜上所訴,CG對EAE小鼠防治作用的機制可能與上調(diào)負性調(diào)控因子SOCS3的表達,抑制JAK/STAT信號通路以及影響Th17/Treg細胞平衡有關(guān)。本實驗提示CG可能是MS的一種潛在治療劑,然而,目前CG對EAE研究甚少,且EAE發(fā)病機制十分復(fù)雜,CG調(diào)控JAK/STAT信號通路的細胞外信號尚不明確以及是否涉及其他信號通路有待進一步探討。