傅增輝姜 巖劉 晶林再紅杜 姝張廣萍陳團(tuán)團(tuán)

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,黑龍江齊齊哈爾 161002)

阿爾茲海默病(Alzheimer disease,AD),又被稱為老年性癡呆,是老年期癡呆的最常見類型,是中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變中常見的,表現(xiàn)為進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙等的臨床綜合征[1]。AD發(fā)病機(jī)制尚不清楚,迄今暫無特效的治療方式。白樺脂醇(Betulin)為樺木皮提取物的主要活性成分,具有一定的生物活性潛能,且動物實驗中表現(xiàn)低毒性,其本身及衍生物的研究成為近年的熱點[2]。研究證實,白樺脂醇在抗炎癥、癌癥以及延緩衰老等治療等方面表現(xiàn)出一定生物學(xué)活性[3],特別是在β淀粉樣蛋白(βamyloid protein,Aβ)誘導(dǎo)的癡呆小鼠模型上顯示出顯著改善認(rèn)知功能的作用[4]。本研究中,將對Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞提前進(jìn)行白樺脂醇藥物干預(yù),觀察白樺脂醇對該模型的保護(hù)作用,尋找其可能的作用機(jī)制,為AD的治療提供新的可能。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

高分化腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞株(PC12),購自中科院上海生化所。將PC12細(xì)胞置于含100 mg/L鏈霉素、100 U/mL青霉素和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司生產(chǎn))的培養(yǎng)瓶中,37℃,5%CO2條件的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。

1.2 主要試劑與儀器

白樺脂醇(購自大興安嶺林格貝寒帶生物科技股份有限公司,純度＞96.9%,貨號：2813820)分子式C30H50O2,相對分子質(zhì)量442.72,為白色粉末,無菌條件下,用二甲基亞砜(DMSO,Sigma公司生產(chǎn))溶解至濃度1000μmol/L的母液,使用時稀釋成濃度為5、10、20 μmol/L 的工作液;Aβ25-35凍干粉(Alfa Aesar公司生產(chǎn),40331),無菌條件下,DMSO溶解至濃度40μmol/L配制成40μmol/L溶液,-20℃保存;N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)(YOYOBIO公司生產(chǎn),Js20137-10 g);MDA測試盒(Zcibio公司生產(chǎn),ZC-S0651);超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)測試盒(Sinobestbio公司生產(chǎn),Yx-C-A600);MTT細(xì)胞增殖檢測試劑盒試劑(Sigma公司生產(chǎn),M2128-1G);乳酸脫氫酶(LDH)活性檢測試劑盒(IC/IBL公司生產(chǎn),貨號ICLDH-Hu);JC-1檢測試劑盒(Adooq Bioscience公司,A15135);caspase3、caspase8和caspase9酶活力試劑盒(百奧萊博公司生產(chǎn),SNM513-IPX、SNM511-NAV、SNM510-DCX);細(xì)胞色素C(Cytochrome c,Cyt c)酶活力試劑盒(雅吉公司生產(chǎn),A090);ECL試劑盒(YOYOBIO公司生產(chǎn),J-SW2010);一抗兔抗大鼠Bcl2、Bax、 caspase3、 caspase8、 caspase9、 Cyt c 和GAPDH多克隆抗體(BD公司生產(chǎn),DXT-610538、DXT-610981、 DXT-610322、 DXT-559932、 DXT-536731、DXT-523011、DXT-560792);二抗羊抗兔IgG-HRP(YOYOBIO公司生產(chǎn),J-SE134)。

HER Acell 240i CO2培養(yǎng)箱(Thermofisher Scientific公司生產(chǎn),51020241);GS15R低溫高速離心機(jī)(Beckman Coulter公司生產(chǎn),338475);RT6100酶標(biāo)儀(Rayto公司生產(chǎn),345678);PowerPac HV電泳儀(Bio Rad公司生產(chǎn),164-5056);FACScan流式細(xì)胞儀(BD公司生產(chǎn),AMG0002073);成像分析儀(Syngene公司生產(chǎn),GBOXChemi-XT4)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組

細(xì)胞分為：對照組、Aβ25-35組、NAC組和不同劑量白樺脂醇組。MTT法測定細(xì)胞存活率時接種細(xì)胞于96孔板內(nèi),將Western blot實驗的細(xì)胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中。 Aβ25-35組加入 40 μmol/L Aβ25-35進(jìn)行誘導(dǎo)24 h。NAC組用0.5μmol/L NAC進(jìn)行預(yù)保護(hù)24 h,再加入造模濃度的Aβ25-35。白樺脂醇組用不同濃度的白樺脂醇進(jìn)行預(yù)保護(hù)24 h,再加入造模濃度的Aβ25-35,通過檢測細(xì)胞存活率,確定最佳白樺脂醇的濃度。

1.3.2 MTT實驗檢測細(xì)胞活力

在96孔板內(nèi),按照1×105/mL密度接種細(xì)胞,無血清培養(yǎng)24 h使細(xì)胞同步化后,選用終濃度分別為5、10、20μmol/L的白樺脂醇進(jìn)行預(yù)處理24 h后,加入 40μmol/L Aβ25-35誘導(dǎo) 20 h。 96孔板各孔中加入20μL MTT試劑,37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h。吸出各孔液體加入200μL DMSO,搖床震蕩10 min,于490 nm刻度測定其吸光度,最后計算細(xì)胞存活率。

1.3.3 LDH釋放實驗

各組細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后,吸取培養(yǎng)中上清液,加入10μL細(xì)胞裂解液,LDH活性檢測采用LDH檢測試劑盒。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出酶活力單位,細(xì)胞LDH釋放率(%)=培養(yǎng)基中酶活力單位/(裂解液酶活力單位+培養(yǎng)基酶活力單位)×100%。

1.3.4 SOD活性和MDA含量測定

白樺脂醇預(yù)處理和Aβ25-35誘導(dǎo)后,4℃條件下進(jìn)行離心(4 000 r/min)10 min,棄細(xì)胞培養(yǎng)上清,每孔加入70μL裂解液,上搖床,于冰上裂解細(xì)胞3 h,4℃條件下進(jìn)行離心(4 000 r/min)10 min,小心吸取上清,BCA法測定各孔細(xì)胞蛋白的濃度,嚴(yán)格按照試劑盒要求檢測SOD和MDA含量。

1.3.5 細(xì)胞凋亡的檢測

Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡。PC12細(xì)胞以每孔2×105個細(xì)胞接種于6孔板中,給藥和Aβ25-35誘導(dǎo)后使用不含EDTA的胰酶消化并收集細(xì)胞,使用1×的Binding Buffer重懸細(xì)胞,于室溫下避光加入Annexin V-FITC,染色10 min后,同樣避光加入PI染色5 min,最后采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.3.6 線粒體膜電位的檢測

使用JC-1檢測試劑盒檢測。將細(xì)胞用胰蛋白酶處理,室溫下在懸浮在JC-1 buffe中15 min。然后通過流式細(xì)胞儀分析染色的樣品。JC-1在線粒體中表現(xiàn)出電位依賴性積累,并且紅色/綠色熒光強(qiáng)度比降低。線粒體膜電位為JC-1綠色熒光/紅色熒光比的比值。將JC-1綠色熒光設(shè)為橫軸,將JC-1紅色熒光設(shè)為縱軸。

1.3.7 酶活性的檢測

采用 caspase3、caspase8、caspase9和 Cyt c活性測定試劑盒,按照說明書進(jìn)行操作,以酶標(biāo)儀于波長405 nm處的吸光度(A)表示活性變化。取每份樣品檢測6次的平均值。

1.3.8 Western blot檢測

用含1%PMSF的蛋白裂解液提取蛋白,并按BCA蛋白試劑盒要求對各組蛋白含量進(jìn)行檢測,冰上行轉(zhuǎn)膜反應(yīng),添加一抗(兔抗大鼠Bcl2、Bax、caspase3、caspase8、caspase9 和 Cyt c多克隆抗體1∶100,兔抗大鼠GAPDH多克隆抗體1∶100)室溫下孵浴2 h并洗滌,將膜浸入以1∶1 000體積比用封閉液稀釋的二抗稀釋液,室溫孵浴2 h洗滌,將ECL試劑盒內(nèi)的detection reagent 1與detection reagent 2等體積混合后,室溫下孵育2 h,ECL發(fā)光顯影后置于凝膠成像儀中,以β-actin為內(nèi)參照,采用Image-Pro Plus軟件對蛋白表達(dá)進(jìn)行定量分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。計量數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用單因素方差分析處理多組間均數(shù)比較,用SNK-q檢驗處理組間兩兩比較,以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白樺脂醇對Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞存活率的影響

與對照組比,Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞存活率明顯降低,差異顯著(P＜0.01);與Aβ25-35組比,預(yù)先加入0.5μmol/L NAC 及5、10、20μmol/L白樺脂醇可顯著提高細(xì)胞存活率,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P＜0.01),見圖 1。

2.2 白樺脂醇對Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞LDH釋放率的影響

與對照組比較,Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞LDH釋放率顯著升高,差異顯著(P＜0.01);與Aβ25-35組比,預(yù)先加入 0.5μmol/L NAC 及 5、10、20 μmol/L白樺脂醇可明顯降低LDH釋放率,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P＜0.01),見圖2。

2.3 白樺脂醇對Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞SOD活性、MDA含量和線粒體膜電位的影響

與對照組比較,Aβ25-35誘導(dǎo)的 PC12細(xì)胞內(nèi)MDA含量均明顯上升,而胞內(nèi)SOD活力和線粒體膜電位水平均顯著下降(均P＜0.01);與 Aβ25-35組比,預(yù)先加入 0.5 μmol/L NAC 及 5、10、20μmol/L白樺脂醇MDA含量均顯著下降,而胞內(nèi)SOD活力和線粒體膜電位水平均明顯上升(均P＜0.01),見圖3A、3B。線粒體膜電位的損失是細(xì)胞凋亡的標(biāo)志,如圖3C、3D、3E、3F、3G、3H、3I所示,通過觀察紅綠熒光,Aβ25-35誘導(dǎo)減少了細(xì)胞的線粒體膜電位水平(P＜0.01),而不同濃度白樺脂醇和NAC均減輕 Aβ25-35誘導(dǎo)的改變(P＜0.01)。

圖1 白樺脂醇對Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞存活率的影響(n=4,±s)Note.A,Comtrol group.B,40μmol/L Aβ25-35.C,0.5μmol/L NAC.D,40μmol/L Aβ25-35+5μmol/L betulin.E,40μmol/L Aβ25-35+10μmol/L betulin.F,40μmol/L Aβ25-35+20μmol/L betulin.A,B,C,D,E,F is the effect of cell morphology.G,cell survival rate.Compared with the normal group,*P＜0.01.Compared with the Aβ25-35 group,#P＜0.01.The same as below.Figure 1 Effects of Betulin on the survival rate of PC12 cells induced by Aβ25-35

圖2 白樺脂醇對Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞LDH釋放率的影響(n=4,±s)Figure 2 Effect of Betulin on LDH release rate of PC12 cells induced by Aβ25-35

2.4 白樺脂醇對Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡的影響

與對照組比,Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡率明顯升高,差異顯著(P＜0.01);與Aβ25-35組比較,預(yù)先加入0.5μmol/L NAC 及5、10、20μmol/L白樺脂醇的細(xì)胞凋亡率明顯降低,差異顯著(均P＜0.01),見圖4。

2.5 白樺脂醇對Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡相關(guān)酶活性的影響

與對照組比,Aβ25-35誘導(dǎo)的 PC12細(xì)胞caspase3、caspase8、caspase9 和 Cyt c的酶活性明顯升高(均P＜0.01);與 Aβ25-35組比較,經(jīng) NAC和 5、10、20μmol/L白樺脂醇預(yù)處理細(xì)胞的 caspase3、caspase8、caspase9和 Cyt c的酶活性顯著降低,見圖5。

2.6 白樺脂醇對Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白相對表達(dá)的影響

與對照組比,Aβ25-35誘導(dǎo)的 PC12細(xì)胞 Bax、caspase3、caspase8、caspase9 和 Cyt c蛋白相對表達(dá)水平顯著升高,而抗凋亡蛋白Bcl2顯著降低,差異顯著(P＜0.01);與 Aβ25-35組比較,給予 NAC和 5、10、20μmol/L白樺脂醇預(yù)處理細(xì)胞的 Bax、caspase3、caspase8、caspase9 和 Cyt c蛋白相對表達(dá)水平顯著降低,而抗凋亡蛋白Bcl2顯著升高,差異具顯著(P＜0.01),見圖6。

3 討論

白樺脂醇是一種天然五環(huán)三萜,據(jù)報道,該化合物具有各種生物學(xué)特性,其抗炎作用在幾種不同的模型中得到了證實[5],而神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)與AD發(fā)病中Aβ沉積密切相關(guān)。首先,BA可抑制LPS刺激的RAW 264.7巨噬細(xì)胞中炎性細(xì)胞因子的釋放,并在LPS/多微生物誘導(dǎo)的敗血癥期間防止動物死亡和組織損傷[6]。NAC為谷胱甘肽的前體,具有清除氧自由基、抗細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)免疫等作用,研究表明[7],NAC可以降低細(xì)胞氧化應(yīng)激水平,減少細(xì)胞凋亡。

圖3 白樺脂醇對Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞SOD活性和MDA含量的影響(n=4,±s)Note.A,Influence of SOD activity.B,Influence of MDA content.C,Flow cytometry of control group.D,Flow cytometry of(40 μmol/L Aβ25-35).E,Flow cytometry of(0.5μmol/L NAC).F,Flow cytometry of(40 μmol/L Aβ25-35+5 μmol/L betulin).G,Flow cytometry of(40 μmol/L Aβ25-35+10μmol/L betulin).H,Flow cytometry of(40μmol/L Aβ25-35+20μmol/L betulin).I,Effect of red/green fluorescence density ratio.Figure 3 Effects of Betulin on SOD activity and MDA content in PC12 cells induced by Aβ25-35

圖4 白樺脂醇對Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡的影響(n=4,±s)Note.A,Control group.B,40μmol/L Aβ25-35.C,0.5 μmol/L NAC.D,40 μmol/L Aβ25-35+5 μmol/L betulin.E,40 μmol/L Aβ25-35+10 μmol/L betulin.F,40 μmol/L Aβ25-35+20 μmol/L betulin.G,Result of apoptotic rate.Q1 area represents necrotic cells,Q2 area represents advanced apoptotic cells,Q3 area represents normal cells and Q4 area represents early apoptotic cells.Figure 4 Effects of Betulin on apoptosis of PC12 cells induced by Aβ25-35

圖5 白樺脂醇對Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡相關(guān)酶活性的影響(n=4,±s)Note.A,Effect of caspase3 activity.B,Effect of caspase8 activity.C,Effect of caspase9 activity.D,Effect of Cyt c activity.Figure 5 Effects of Betulin on apoptosis related enzyme activity of PC12 cells induced by Aβ25-35

圖6 白樺脂醇對Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白相對表達(dá)的影響(n=4,±s)Note.A,Effect of Bcl2 expression.B,Effect of Bax expression.C,Effect of Caspase3 expression.D,Effect of Caspase8 expression.E,Effect of Caspase9 expression.F,Effect of Cyt c expression.G,Result of Western blot.Figure 6 Effects of Betulin on relative expression of apoptosis related proteins of PC12 cells induced by Aβ25-35

Aβ在神經(jīng)元的沉積異常產(chǎn)生的老年斑,一般被認(rèn)為是是AD的主要病理特征,與AD的發(fā)生發(fā)展變化關(guān)系密切[8]。Aβ級聯(lián)假說依然占據(jù)著學(xué)術(shù)界的重要地位,Aβ沉積異常引發(fā)的最顯著的特征之一就是神經(jīng)元凋亡,進(jìn)而引起認(rèn)知功能障礙發(fā)生。在本研究中,采用MTT法檢測Aβ25-35對PC 12細(xì)胞的細(xì)胞活性影響,結(jié)果顯示Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的細(xì)胞存活率降低、凋亡水平上升,但NAC和白樺脂醇干預(yù)均可以提高細(xì)胞生存率并降低凋亡水平。

氧化應(yīng)激在神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用,大腦 Aβ異常沉積可觸發(fā)氧化應(yīng)激[9-10],細(xì)胞中抗氧化和氧化平衡失調(diào)導(dǎo)致ROS的累積高于內(nèi)環(huán)境代謝是氧化應(yīng)激的基礎(chǔ),觸發(fā)線粒體功能異常,進(jìn)而細(xì)胞凋亡[11-12]。研究表明,異常沉積的Aβ可介導(dǎo)與線粒體內(nèi)的乙醇脫氫酶(Aβbinding alcohol dehydrogenase,ABAD)異常結(jié)合,引發(fā)呼吸鏈功能異常,并產(chǎn)生ROS水平上升,出現(xiàn)氧化和抗氧化機(jī)制異常。并且,ROS的累積會損傷染色體及生物膜系統(tǒng),出現(xiàn)線粒體呼吸鏈紊亂、ROS產(chǎn)生增加等表現(xiàn),加劇氧化和抗氧化失衡過程,最終出現(xiàn)正反饋樣的氧化應(yīng)激—線粒體異常的循環(huán)[13-15]。但白樺脂醇抑制凋亡是否與改善細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平有關(guān)尚不明確,本研究進(jìn)一步探討其影響。SOD和MDA水平是促進(jìn)細(xì)胞程序性死亡的重要因素,作為檢測氧化應(yīng)激的主要指標(biāo),內(nèi)源性抗氧化酶SOD可清除體內(nèi)自由基。研究表明,AD患者ROS水平升高,隨著SOD活性降低和MDA含量升高,中樞神經(jīng)氧化應(yīng)激水平升高,且Aβ誘導(dǎo)的離體實驗和載體實驗中有氧化損傷的報道[16-18]。根據(jù)本實驗,Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞SOD活性降低,MDA含量升高,而NAC和白樺脂醇處理使SOD活性升高,MDA含量降低。推測白樺脂醇可以發(fā)揮與NAC同樣的作用,對Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激能發(fā)揮保護(hù)作用。

Aβ增多對神經(jīng)元的毒性作用是AD發(fā)病的重要途徑,將Aβ注射入大鼠海馬,可模擬AD腦內(nèi)Aβ形成以后的毒性作用過程,特別是氧化應(yīng)激過程,Aβ介導(dǎo)凋亡的靶點存在于神經(jīng)元內(nèi)[19-20]。線粒體引導(dǎo)的凋亡通路是關(guān)鍵的內(nèi)源性凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,并且有體外實驗報道Aβ能夠激活線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑[21-22]。線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑是受Bc12家族蛋白調(diào)節(jié)的細(xì)胞內(nèi)部信號觸發(fā)的凋亡方式[23-24]。本研究中,Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的凋亡蛋白表達(dá)上調(diào)而抗凋亡蛋白則相反,通過提前給予NAC和白樺脂醇可使凋亡蛋白表達(dá)下調(diào)而抗凋亡蛋白表達(dá)上調(diào)。提示Aβ25-35能夠激活線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑,而預(yù)防給藥白樺脂醇能夠有效的抑制線粒體凋亡通路的激活。同時,為了確定線粒體膜通透性引起的凋亡因子外放是否激活了下游的凋亡蛋白,本研究檢測了caspase3和caspase8的活性和表達(dá)情況,Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的caspase3和caspase8水平上升,而通過提前給予白樺脂醇可降低細(xì)胞內(nèi)caspase3和caspase8水平。Bcl2和Bax表達(dá)的失調(diào),使細(xì)胞線粒體膜電位發(fā)生相應(yīng)變化,從而導(dǎo)致Cyt c成功穿透線粒體膜最終滲透到胞漿中,激活 caspase9,活化的 caspase9進(jìn)一步激活caspase3,從而提高caspase3活性,最終促進(jìn)細(xì)胞凋亡[25-26]。本研究中,Aβ25-35誘導(dǎo)的 PC12細(xì)胞的caspase3、caspase8、caspase9 和 Cyt c上調(diào),且線粒體膜電位下降,通過提前給予NAC和白樺脂醇可使其表達(dá)下調(diào),并保護(hù)線粒體膜電位。因此,NAC和白樺脂醇可能對Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡和線粒體損傷具有一定的保護(hù)作用。

本研究發(fā)現(xiàn),有效劑量的白樺脂醇預(yù)處理,可以明顯抑制Aβ25-35誘導(dǎo)引起的細(xì)胞凋亡。考慮機(jī)制可能與通過減少ROS的生成而降低氧化應(yīng)激水平,并抑制細(xì)胞凋亡途徑有關(guān),本實驗為白樺脂醇延緩AD的發(fā)展提供了一定的藥理學(xué)依據(jù),但也為白樺脂醇延緩了AD的發(fā)展提供了基礎(chǔ)的藥理學(xué)依據(jù),但是,需通過進(jìn)一步的分子生物學(xué)研究來明確其機(jī)制。