張 鵬,張年榮,謝紫潔,歐陽昌漢,余開湖**
(1.湖北科技學(xué)院,湖北 咸寧 437100;2.湖北科技學(xué)院附屬第一醫(yī)院放射介入科)
高脂血癥是一種脂質(zhì)代謝異常疾病,患者體內(nèi)分解脂質(zhì)的脂酶活性不足或相對不足,導(dǎo)致脂質(zhì)堆積,繼而發(fā)生脂代謝紊亂及血管損傷等一系列不良后果。在一項對35歲以上人群血脂異?;疾÷实恼{(diào)研中發(fā)現(xiàn),血脂異常者高達34.7 %[1]。線粒體的脂肪酸氧化是人體內(nèi)重要的生命活動,細胞中的活性氧(reactive oxygen species,ROS)也是由線粒體產(chǎn)生。受損線粒體產(chǎn)生的大量ROS是導(dǎo)致血管內(nèi)皮細胞損傷的重要原因[2]。FUN14結(jié)構(gòu)域蛋白1(FUN14 domain-containing protein 1,F(xiàn)UNDC1)是一種存在于線粒體外膜與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聯(lián)結(jié)處的自噬受體蛋白[3],它通過與LC3-b相互作用介導(dǎo)線粒體自噬[4-5]。目前已有研究發(fā)現(xiàn),在細胞缺氧的條件下,F(xiàn)UNDC1在線粒體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聯(lián)結(jié)處積累,促進線粒體自噬的發(fā)生[6];線粒體質(zhì)量與數(shù)目失調(diào)與線粒體自噬受體FUNDC1有著重要的關(guān)聯(lián)[7]。
目前對FUNDC1在高脂誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞中的作用研究還尚未見報道,本研究以腺病毒為載體,過表達EA.hy926人血管內(nèi)皮細胞中的FUNDC1,再加入棕櫚酸(palmitic acid,PA)建立高脂細胞模型,檢測細胞活力值、細胞ROS含量、線粒體膜電位去極化情況、腺苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)含量以及自噬相關(guān)蛋白表達情況來探討FUNDC1在高脂誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞中的作用。
EA.hy926內(nèi)皮細胞(中國科學(xué)院上海細胞庫);FUNDC1腺病毒(維真生物);空載腺病毒(維真生物);棕櫚酸(美國Sigma公司);FUNDC1抗體(北京博奧森生物);P62抗體(美國Cell Signaling Technology公司);LC3抗體(美國Cell Signaling Technology公司);GAPDH抗體(美國Cell Signaling Technology公司);HRP標記羊抗兔IgG(美國Jackson公司);cck8試劑盒(日本同仁);細胞活性氧檢測試劑盒(上海碧云天生物);JC-1試劑盒(上海碧云天生物);ATP含量試劑盒(南京建成生物)。
垂直電泳儀(美國Bio-Rad公司);自動發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(英國Syngene公司);超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)公司);熒光顯微鏡(日本奧林巴斯);全波段多功能酶標儀(美國Bio-Tek公司)。
1.3.1 不同濃度PA下細胞存活率
取對數(shù)生長期EA.hy926細胞,用0.25%胰蛋白酶消化,DMEM完全培養(yǎng)液調(diào)制成5×104個/mL細胞懸液,接種在96孔培養(yǎng)板內(nèi),每孔100μL。待細胞完全貼壁,換成不同濃度(0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.5、0.7mmol/L)的PA培養(yǎng),培養(yǎng)24h后,每孔加入cck8試劑10μL,繼續(xù)孵育1~2h,酶標儀檢測 450nm處各孔的OD值。實驗重復(fù)3次。
1.3.2 細胞分組
實驗分為4組,對照組:EA.hy926常規(guī)培養(yǎng)條件培養(yǎng);高脂組:EA.hy926細胞常規(guī)培養(yǎng)48 h 后,將細胞培養(yǎng)基換成0.2mmol/L PA培養(yǎng)24h;高脂+空載組:轉(zhuǎn)染空載腺病毒48h后,將細胞培養(yǎng)基換成0.2mmol/L PA培養(yǎng)24h;高脂+FUNDC1組:轉(zhuǎn)染FUNDC1腺病毒48h后,將細胞培養(yǎng)基換成0.2mmol/L PA培養(yǎng)24h。
1.3.3 細胞活力檢測
在方鋼管柱兩端各布置一個位移計1、2,以測量其豎向側(cè)移;在梁端布置位移計3,以測量其水平側(cè)移,用來校準作動器位移讀數(shù)。由于連接節(jié)點的彎矩和轉(zhuǎn)角在試驗中不便直接測量,本試驗采用測量目標位置點的豎向位移和測量梁端集中荷載并通過轉(zhuǎn)換計算來求得節(jié)點的彎矩和轉(zhuǎn)角。分別在懸臂抗剪腹板與外套筒腹板焊縫連接處、外套筒翼緣、角鋼加勁肋、外套筒腹板、方鋼管柱腹板于外套筒截面突變處、角鋼梁側(cè)鋼肢、角鋼柱側(cè)鋼肢以及梁翼緣與角鋼變截面處布置了應(yīng)變花以及應(yīng)變片。
取對數(shù)生長期EA.hy926細胞,用0.25%胰蛋白酶消化,DMEM完全培養(yǎng)液調(diào)制成5×104個/mL細胞懸液,接種在96孔培養(yǎng)板內(nèi),每孔100μL。各組細胞相應(yīng)處理后,每孔加入 cck8試劑10μL,繼續(xù)孵育1~2h,酶標儀檢測450nm處各孔的吸光度OD值。實驗重復(fù)3次。
1.3.4 活性氧檢測
取對數(shù)生長期EA.hy926細胞,用0.25%胰蛋白酶消化,接種于6孔板中。待細胞長至70%左右,各組細胞進行相應(yīng)處理,吸除6孔板培養(yǎng)液,以1∶1000為比例,用無血清DMEM培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA,每孔加入1 ml已稀釋的DCFH-DA溶液,37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30min,孵育結(jié)束后用無血清DMEM細胞培養(yǎng)液洗滌細胞3次,熒光顯微鏡下觀察,隨機取5個視野拍照。實驗重復(fù)3次。
1.3.5 線粒體膜電位檢測
取對數(shù)生長期EA.hy926細胞,用0.25%胰蛋白酶消化,接種于6孔板中。待細胞長至70%左右,各組細胞進行相應(yīng)處理,吸除6孔板培養(yǎng)液,加入1mL JC-1染色工作液和1 mL DMEM培養(yǎng)基,充分混勻。細胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20min,孵育結(jié)束后,吸除上清,用JC-1 Buffer(1×)洗滌2次,加入2mL DMEM培養(yǎng)液,熒光顯微鏡下觀察,隨機取5個視野拍照。實驗重復(fù)3次。
1.3.6 ATP含量檢測
取對數(shù)生長期EA.hy926細胞,用0.25%胰蛋白酶消化,接種于6孔板中。待細胞長至70%左右,各組細胞進行相應(yīng)處理,離心收集下層細胞沉淀,將收集好的細胞加入300μL熱雙蒸水,置于熱水浴(90℃)中勻漿破碎,后將細胞懸液于沸水浴中加熱10min,取出混勻抽提1min,依次加入ATP含量檢測試劑1~6,酶標儀636nm處檢測吸OD值。根據(jù)公式:ATP含量(μmol/gprot)=[(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空白)]×標準品濃度(1×103μmol/L)×樣本測定前稀釋倍數(shù)÷待測樣本蛋白濃度(gprot/L),計算各組ATP含量。實驗重復(fù)3次。
1.3.7 蛋白質(zhì)印跡法(Western Bolt)檢測轉(zhuǎn)染效率及自噬相關(guān)蛋白表達情況
與對照組相比,PA可明顯降低細胞存活率,并呈現(xiàn)出一定的濃度依賴性。PA濃度為0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.5、0.7mmol/L時,細胞存活率分別為(80.873±1.490)%、(64.157±11.098)%、(45.883±3.645)%、(31.567±6.472)%、(25.743±3.748)%、(12.327±1.919)%、(8.207±4.743)%。PA濃度為0.2mmol/L時,細胞存活率為(45.883±3.645)%,與對照組相比,顯著性降低(P<0.01),根據(jù)相關(guān)文獻研究結(jié)果[8],選用0.2mmol/L的PA濃度作為后續(xù)實驗的高脂濃度。結(jié)果見圖1。
PA濃度(mmol/L)
與對照組相比,高脂組和高脂+空載組細胞存活率[(45.233±0.505)%、(44.013±1.267)%]顯著下降(P<0.01),而高脂+FUNDC1組存活率(68.150±0.655)%明顯高于(P<0.01)高脂組,高脂組和高脂+空載組兩組結(jié)果無顯著差異(P>0.05)。結(jié)果見圖2。
與對照組比較,**P<0.01;與高脂組比較,##P<0.01
與對照組相比,高脂組和高脂+空載組熒光強度明顯升高(P<0.01),表明ROS含量明顯升高,而高脂+FUNDC1組熒光強度明顯低于(P<0.01)高脂組,表明高脂+FUNDC1組ROS含量減少,高脂組和高脂+空載組兩組結(jié)果無顯著差異(P>0.05)。結(jié)果見表1、圖3(封二)。
表1 各組線粒體內(nèi)ROS水平及膜電位去極化比例
與對照組相比,高脂組和高脂+空載組探針綠色熒光強度明顯增強,紅色熒光強度明顯減弱,紅色熒光與綠色熒光強度比值顯著降低(P<0.01),提示線粒體膜電位去極化的比例升高,而高脂+FUNDC1組與高脂組相比,JC-1 探針綠色熒光強度顯著減弱,紅色熒光強度增加,紅色熒光與綠色熒光比值明顯增高(P<0.01),線粒體膜電位去極化的比例減少,高脂組和高脂+空載組兩組結(jié)果無顯著差異(P>0.05)。結(jié)果見表1、圖4(封二)。
與對照組相比,高脂組和高脂+空載組ATP含量[(62.054±11.26)μmol/gprot、(57.604±9.696)μmol/gprot]顯著下降(P<0.01),而高脂+FUNDC1組ATP含量(117.446±21.695)μmol/gprot明顯高于高脂組(P<0.05),高脂組和高脂+空載組兩組結(jié)果無顯著差異(P>0.05)。
轉(zhuǎn)染48h后,與對照組相比,轉(zhuǎn)染FUNDC1組FUNDC1量顯著上升(P<0.01),經(jīng)Image J軟件分析蛋白條帶可得,轉(zhuǎn)染效率達192.49%。結(jié)果見圖5。
與對照組比較,**P<0.01
與對照組相比,高脂組和高脂+空載組LC3b/a增加(P<0.01),P62含量增加(P<0.05),F(xiàn)UNDC1變化無顯著差異(P>0.05);與高脂組相比,高脂+FUNDC1組FUNDC1、LC3b/a、P62明顯減少(P<0.05)。高脂組和高脂+空載組兩組結(jié)果無顯著差異(P>0.05)。結(jié)果見圖6。
A:各組細胞自噬蛋白表達情況(n=3,±s) 1:對照組;2:高脂組;3:高脂+空載組;4:高脂+FUNDC1組
高脂血癥嚴重影響患者健康,是動脈粥樣硬化、糖尿病、胰腺炎、冠心病及腦梗死等疾病的獨立危險因素[9]。高脂血癥所導(dǎo)致的脂毒性作用對血管內(nèi)皮細胞的損傷主要在于誘導(dǎo)細胞線粒體產(chǎn)生過量ROS,有研究表明[10],過量ROS導(dǎo)致的氧化應(yīng)激會損傷組織與細胞,致使其功能障礙、代謝紊亂。血管內(nèi)皮細胞功能失調(diào)將導(dǎo)致血管生理功能紊亂,是高脂血癥誘發(fā)動脈硬化的原因之一。
FUNDC1是一個定位于線粒體外膜上的線粒體自噬的受體蛋白[11],在FUNDC1過表達的情況下能夠引起顯著的線粒體自噬[12]。線粒體自噬是一種選擇性清除功能失調(diào)線粒體的細胞自我修復(fù)過程[13]。其調(diào)節(jié)線粒體的數(shù)目和質(zhì)量,對減少ROS產(chǎn)生、調(diào)節(jié)代謝平衡、維持細胞穩(wěn)態(tài)有著重要的意義。有研究[14]發(fā)現(xiàn),F(xiàn)UNDC1在心臟健康的維持中有重要意義,它促進線粒體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聯(lián)結(jié)處的穩(wěn)定,對細胞器結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和細胞整體的穩(wěn)態(tài)有重要作用。FUNDC1匱乏的心肌細胞中,F(xiàn)UNDC1-環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)途徑調(diào)節(jié)失衡,線粒體發(fā)生損傷、功能紊亂。Wu等[15]發(fā)現(xiàn)代謝類疾病中線粒體的功能失調(diào)與自噬受體FUNDC1缺陷導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)有關(guān)。Yu等[16]在研究Mst1在心臟缺血再灌注損傷中的作用時發(fā)現(xiàn),損傷機制之一是Mst1抑制了FUNDC1介導(dǎo)的自噬。
上述研究說明了FUNDC1介導(dǎo)的線粒體自噬在維持細胞結(jié)構(gòu)功能穩(wěn)定上有重要作用。而FUNDC1在高脂損傷的血管內(nèi)皮細胞中的作用還未見報道,本研究利用腺病毒為載體過表達EA.hy926人血管內(nèi)皮細胞中FUNDC1,再以0.2mmol/L PA處理轉(zhuǎn)染過的細胞,檢測其增殖活力、ROS含量變化、線粒體膜電位去極化情況、ATP生成量和自噬相關(guān)蛋白變化等指標來探究FUNDC1在高脂損傷的血管內(nèi)皮細胞中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對照組相比,高脂組和高脂+空載組LC3、P62含量明顯增加(P<0.05);高脂+FUNDC1組相比較于高脂組LC3、P62含量明顯減少(P<0.05),高脂組和高脂+空載組結(jié)果無明顯差異(P>0.05)。LC3蛋白分為LC3-a和LC3-b兩種形式,當(dāng)自噬發(fā)生時,LC3-a與磷脂酰乙醇胺結(jié)合,形成LC3-b,聚集在自噬體表面,LC3-a向LC3-b的轉(zhuǎn)化意味著自噬體的形成,LC3-b與LC3-a的比值是反映細胞自噬程度的標志之一。P62蛋白是自噬體與底物之間的適配蛋白,它與泛素化蛋白結(jié)合后,與LC3相互作用聚集在自噬體上,并不斷被自噬體-溶酶體降解。P62蛋白水平高低反映自噬活性的高低,當(dāng)自噬功能減弱時,P62會不斷積累。Western Bolt檢測自噬相關(guān)蛋白的表達情況實驗中發(fā)現(xiàn),在高脂組中,高脂損傷會導(dǎo)致內(nèi)皮細胞發(fā)生反饋調(diào)節(jié),高脂組LC3-b增多,表示在內(nèi)皮細胞中自噬小體生成量不斷增多,但結(jié)合P62蛋白增多的結(jié)果來看,生成的自噬小體沒有被溶酶體降解,即高脂組自噬反應(yīng)沒有發(fā)生完全。在過表達FUNDC1的高脂+FUNDC1組中,LC3-b、P62含量明顯減少,Western Bolt檢測FUNDC1腺病毒轉(zhuǎn)染效率的實驗中可得,F(xiàn)UNDC1過表達效率達到192.49%,而在高脂+FUNDC1組中,發(fā)現(xiàn)FUNDC1的量是減少的,參考FUNDC1作用機制,即FUNDC1與LC3-b蛋白相互結(jié)合作用[7-8],表明在高脂+FUNDC1中,過表達的FUNDC1與LC3-b相結(jié)合發(fā)揮介導(dǎo)自噬的作用,再結(jié)合P62蛋白減少的結(jié)果,表明生成的自噬小體已被溶酶體降解,即高脂+FUNDC1組自噬反應(yīng)進行的更加完全,在高脂損傷的內(nèi)皮細胞中過表達FUNDC1有促進自噬反應(yīng)進行的作用。細胞活力實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),高脂+FUNDC1組相比較于高脂組,細胞活力明顯提升(P<0.01);ROS檢測實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),高脂+FUNDC1組相比較于高脂組,綠色熒光明顯減弱(P<0.01),說明ROS含量下降;線粒體膜電位(JC-1)檢測實驗發(fā)現(xiàn),高脂+FUNDC1組相比較于高脂組,紅色熒光強度明顯增強,綠色熒光強度明顯減弱,紅色熒光與綠色熒光強度比值顯著升高(P<0.01),提示線粒體膜電位去極化的比例降低;ATP含量實驗發(fā)現(xiàn),高脂+FUNDC1組相比較于高脂組,ATP含量有所增加(P<0.05)。與高脂組相比較,過表達FUNDC1的高脂+FUNDC1組上述各項細胞功能指標均得到一定程度改善。
綜上所述,過表達FUNDC1對高脂誘導(dǎo)的EA.hy926人血管內(nèi)皮細胞有保護作用,其具體機制可能與促進自噬發(fā)生,降低ROS量,改善線粒體功能障礙有關(guān)。