朱文勇 歐陽圣潔 代小虎 宋紹輝 寸怡娜 陳 楓 廖國陽

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南昆明 650118

b型流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzaetype b,Hib）為莢膜型致病菌，可導(dǎo)致敗血癥、會(huì)厭炎、肺炎、腦膜炎等多種侵襲性疾病[1-3]。接種Hib結(jié)合疫苗是目前預(yù)防其感染的最有效途徑[4]。Hib莢膜多糖是其最主要的毒力因子[5]和免疫抗原[6]，現(xiàn)在上市的Hib結(jié)合疫苗，莢膜多糖的提取均采用傳統(tǒng)工藝[7]，其中使用大量的苯酚，嚴(yán)重影響操作者的身體健康，破壞生態(tài)環(huán)境。為此，國內(nèi)外開展了Hib莢膜多糖提取新工藝的研究[8-13]，其中利用Triton X-114進(jìn)行多糖純化的新工藝，具有安全環(huán)保、成本低廉、線性放大好等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)也有相關(guān)研究[14-15]將Triton X-114應(yīng)用于生物制品成品生產(chǎn)工藝過程中。同時(shí)，新工藝提取的多糖與載體蛋白進(jìn)行結(jié)合后的原液穩(wěn)定性研究也初步顯示了良好的應(yīng)用潛力[16]，因此，有望將該工藝投入到實(shí)際生產(chǎn)中。而對(duì)于其在莢膜多糖中的殘留控制則影響著疫苗產(chǎn)品的質(zhì)量安全，目前在《中國藥典》中并沒有關(guān)于Triton X-114的檢測(cè)方法，但已有文獻(xiàn)[17]根據(jù)Triton X-100的檢測(cè)方法建立了Triton X-114的檢測(cè)方法，而其在Hib莢膜多糖中殘留含量的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)尚無相關(guān)研究。本文通過對(duì)苯酚法應(yīng)用于Hib莢膜多糖中Triton X-114殘留含量檢測(cè)的可行性進(jìn)行驗(yàn)證，并對(duì)多批次的檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)合安全性評(píng)價(jià)結(jié)果初步制定出Hib莢膜多糖中Triton X-114殘留量的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

Varioskan Flash全波長多功能酶標(biāo)儀（美國Thermo公司）；苯酚（西隴化工有限公司）；Triton X-114（美國Sigma公司）。Hib莢膜多糖由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所生物制品五室制備。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 線性范圍的驗(yàn)證 分別配制10.00、20.00、40.00、60.00、70.00mg/L TritonX-114 溶液，按照文獻(xiàn)[17]中的方法測(cè)定TritonX-114與苯酚發(fā)生反應(yīng)后產(chǎn)物在340nm波長處的A值，確定線性范圍。每個(gè)稀釋度測(cè)定3次，計(jì)算每個(gè)稀釋度的3個(gè)測(cè)定值之間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）值，RSD值應(yīng)≤5%。標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2應(yīng)≥0.99。

1.2.2 準(zhǔn)確性和精密性驗(yàn)證 配制低（10.00mg/L）、中（30.00mg/L）、高（60.00mg/L）濃 度 的 TritonX-114溶液，同時(shí)每個(gè)濃度設(shè)置對(duì)應(yīng)添加終濃度為5.00g/L Hib莢膜多糖（由傳統(tǒng)方法制備）的對(duì)照組，按照文獻(xiàn)[14]中的方法進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)濃度樣品平行測(cè)定3組，重復(fù)測(cè)定3次，計(jì)算回收率和RSD值，驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性和精密性，要求回收率的范圍應(yīng)為90%～110%，RSD值應(yīng)≤5%。

1.2.3 樣品檢測(cè)及異常毒性試驗(yàn) 新工藝提取的15批Hib莢膜多糖中Triton X-114的檢測(cè)按照文獻(xiàn)[17]中的方法，其每mL體積的含量與多糖含量的比值即為Hib莢膜多糖中Triton X-114的殘留含量。異常毒性實(shí)驗(yàn)按照2015年《中國藥典》三部中通則1141法進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 線性范圍的驗(yàn)證結(jié)果

從10.00～70.00mg/L的5個(gè)濃度檢測(cè)結(jié)果（表1）顯示其RSD值均小于5%，表明在10.00～70.00mg/L的范圍內(nèi)可以用該方法檢測(cè)。同時(shí)利用該值做線性回歸，其回歸方程為Y=0.0107X-0.0056，R2=1.00，說明其線性關(guān)系成立，且相關(guān)性較好。

表1 測(cè)定范圍結(jié)果

2.2 準(zhǔn)確性和精密性驗(yàn)證結(jié)果

低、中、高濃度情況下，含Hib莢膜多糖與否并不影響Triton X-114的檢測(cè)結(jié)果，并且回收率均在95%～105%，說明該方法準(zhǔn)確度良好，而其RSD值均＜5%，說明該方法精密度較好。見表2～ 3。

表2 標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)確度、精密度檢測(cè)結(jié)果

表3 含Hib莢膜多糖標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)確度、精密度檢測(cè)結(jié)果

2.3 樣品檢測(cè)及異常毒性試驗(yàn)

不同批次間Triton X-114的殘留含量并不完全一致，但異常毒性的檢測(cè)結(jié)果均符合安全性要求（表4）。殘留含量平均值為15.04mg/g莢膜多糖，這15批間的標(biāo)準(zhǔn)差為4.58，根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)規(guī)律，其殘留量上限應(yīng)為15.04+2×4.58=24.20mg/g莢膜多糖，結(jié)合異常毒性的檢測(cè)結(jié)果，初步把Hib莢膜多糖中Triton X-114的殘留含量質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的上限定為25.00mg/g莢膜多糖。

表4 新工藝提取Hib莢膜多糖中Triton X-114的殘留含量及其異常毒性檢測(cè)結(jié)果

3 討論

隨著社會(huì)的發(fā)展、生活水平的提高，人們對(duì)疫苗質(zhì)量及對(duì)環(huán)境保護(hù)要求越來越高，病原菌莢膜多糖的提取工藝不斷改進(jìn)，新的化學(xué)試劑也隨之引入。Triton X-114是一種常用化學(xué)試劑，已廣泛應(yīng)用于微量金屬物富集檢測(cè)、生物大分子的分離與純化及環(huán)境樣品的前處理中[18-20]。但Triton X-114尚未在《中國藥典》生物制品中正式出現(xiàn)，而其類似物Triton X-100則已應(yīng)用于上市生物制品中。在其檢測(cè)方法被建立的基礎(chǔ)上，通過本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了該方法也可以應(yīng)用于Hib莢膜多糖中的Triton X-114殘留含量的檢測(cè)。

Triton X-114與Triton X-100類似都屬于非離子表面活性劑，毒性較小，但殘留含量在《中國藥典》尚無明確質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，如后續(xù)工藝所需引入該物質(zhì)，仍需對(duì)其殘留量進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)控。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)多批新工藝制備的Hib莢膜多糖的Triton X-114進(jìn)行檢測(cè)，在保證安全性的前提下，經(jīng)統(tǒng)計(jì)初步制定出Hib莢膜多糖中Triton X-114的殘留含量質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的上限定為25.00mg/g莢膜多糖。該標(biāo)準(zhǔn)下疫苗的Triton X-114殘留含量不高于0.76μg/mL，與之類似的Triton X-100的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)在重組乙型肝炎疫苗中為＜15.00μg/mL，而在流感病毒裂解疫苗中的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)為＜300.00μg/mL。因此，本實(shí)驗(yàn)制定的Triton X-114殘留含量質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)能夠達(dá)到生物制品的安全性要求，該標(biāo)準(zhǔn)可以為后續(xù)Triton X-114在《中國藥典》中殘留含量的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考依據(jù)。