廖興盛，王一翔，陳佐泓，王璞，黃靜穎，朱小山*

1.長沙學院生物與環(huán)境工程學院，湖南 長沙 410022；2.清華大學深圳國際研究生院，廣東 深圳 518055

隨著科技的不斷進步，人工納米材料（MNMs）已經(jīng)在社會經(jīng)濟發(fā)展的各個行業(yè)中取得了日益廣泛的應用。2005年到2014年，全球MNMs產(chǎn)品從54種增長到1814種（Vance et al.，2014）。伴隨著MNMs的大規(guī)模使用，其環(huán)境暴露的風險也隨之升高。據(jù)調(diào)查，2010年全世界 MNMs的產(chǎn)量約26.0×104—30.9×104t。大約0.4%—7.0%的MNMs會釋放到水環(huán)境中（Keller et al.，2013）。MNMs對水生生物的影響已成為環(huán)境研究的熱點問題。研究表明，水環(huán)境中 MNMs會影響水生生物的生長繁殖（Zhu et al.，2010a），并經(jīng)食物鏈傳遞到生態(tài)系統(tǒng)不同營養(yǎng)級（Mansfield et al.，2015；Zhu et al.，2010b）。

在所有的 MNMs中，納米二氧化鈦（nanotitanium dioxide，nTiO2）的應用相對更加廣泛。截至 2014年，大約 100種納米技術(shù)產(chǎn)品使用 nTiO2（Vance et al.，2014），常見的應用包括光催化劑、化妝品、涂料等（Chen et al.，2011；Popov et al.，2005；Wang et al.，2014）。同時，nTiO2也是所有MNMs中產(chǎn)量最大的，其他 MNMs如納米銀的產(chǎn)量只有nTiO2產(chǎn)量的2%。根據(jù)調(diào)查，70%—80%的nTiO2被用于包括防曬霜在內(nèi)的個人護理品行業(yè)（Piccinno et al.，2012）。而在日常洗漱以及在海灘景區(qū)防曬等場景中，個人護理品中的nTiO2有可能直接進入到水體中，對水生生物造成危害。根據(jù)模型估計，僅在2010年就有超過15000 t的nTiO2被排入水體之中（Keller et al.，2013；Gottschalk et al.，2009），因此亟需對nTiO2的環(huán)境風險進行充分評估。盡管目前已有大量關(guān)于nTiO2對浮游植物的毒性研究，但研究結(jié)論并不一致，一些研究證實nTiO2降低了藻類生長和總?cè)~綠素含量（Metzler et al.，2011；Wang et al.，2008），而另一些研究卻表明nTiO2對藻類的毒性極低（Griffitt et al.，2010）。這些相反的研究結(jié)果表明nTiO2對浮游植物的影響機制仍需深入研究。許多研究者認為nTiO2的毒性影響機制在于其能夠誘導產(chǎn)生 ROS（Ochiai et al.，2010；Aruoja et al.，2009），干擾藻類細胞正常的氧化應激平衡，從而抑制藻類的生長和光合能力（Li et al.，2015），并引起DNA 損傷（Aruoja et al.，2009；Chen et al.，2012；Ma et al.，2012；Melegari et al.，2013）。然而，已有的研究主要關(guān)注短期暴露下nTiO2的毒性效應，而對暴露過程中浮游植物的應激反應變化缺乏認識。同時，盡管研究認為nTiO2暴露會干擾浮游植物葉綠體的正常光合活動，但對浮游植物與光合作用相關(guān)的基因表達在nTiO2脅迫下的變化研究還不深入。

綜合考慮以上因素，本項研究將觀察三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）在暴露過程中光合作用途徑相關(guān)的生理生化指標的變化，主要是葉綠素a含量、Fv/Fm（PS Ⅱ反應中心的最大光量子產(chǎn)量）、光合作用基因rbcS和LcyB的mRNA表達量的變化，探討nTiO2對海洋微藻的光合毒性效應以及海洋微藻在nTiO2暴露下的響應機制。

1 材料與方法

1.1 實驗生物、材料及儀器

本研究選用的藻種為三角褐指藻購買自上海光語生物科技有限公司。選擇三角褐指藻為受試生物的原因在于三角褐指藻為海洋硅藻，對全球碳循環(huán)和硅循環(huán)具有重要的作用（Mann，1999）；同時三角褐指藻是模式生物，具有完整的基因組信息（Apt et al.，1997），便于開展相關(guān)基因的表達研究。實驗采用的nTiO2（99.8%，粒徑約15 nm）購自埃普瑞復合材料有限公司。超聲波清洗機（KQ2200）購自昆山市超聲儀器有限公司，人工氣候箱（RZH-128A）購自杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司，浮游植物熒光儀（Phyto-PAM）購買自德國WALZ公司，熒光定量PCR儀（ABI PRISM 7000）為美國產(chǎn)品。

1.2 培養(yǎng)條件

三角褐指藻在人工氣候箱中進行靜置培養(yǎng)，每天搖晃3次，培養(yǎng)溫度為 (20±1) ℃，光照強度為3000 lx，光照周期為 12 h∶12 h（晝∶夜），所用的培養(yǎng)液為f/2培養(yǎng)基（Guillard et al.，1962）。每6天轉(zhuǎn)接一次，轉(zhuǎn)接時的起始濃度為2×104ind·mL-1。實驗用海水采自深圳東涌，并用0.45 μm的濾膜過濾。取過濾海水配制f/2培養(yǎng)液。

1.3 實驗體系

暴露組nTiO2質(zhì)量濃度設(shè)置為5、10、20、50、100 mg·L-1，每個濃度設(shè)置3個平行。同時設(shè)置nTiO2對照組，即不加納米材料（0 mg·L-1）正常培養(yǎng)的三角褐指藻。取0.2 g nTiO2用f/2培養(yǎng)基定容至0.2 L并超聲波處理30 min作為母液。將母液逐級稀釋配成濃度為暴露濃度兩倍的懸濁液。將4×104ind·mL-1的藻液50 mL移至各個150 mL錐形瓶中，隨后加入配好的nTiO2懸濁液50 mL，得到最終的試驗液。試驗液中藻密度為 2×104ind·mL-1，nTiO2質(zhì)量濃度為 0、5、10、20、50、100 mg·L-1。隨后每 24 h 測定一次，總實驗周期為120 h。

1.4 葉綠素和Fv/Fm的測定

首先以對數(shù)期藻液作為參照對 Phyto-PAM 進行標定。從各處理組和對照組藻液中取樣，避光靜置5 min，測量葉綠素a含量和Fv/Fm。依照nTiO2對三角褐指藻葉綠素a含量影響的結(jié)果計算各暴露組在處理24—120 h后的抑制率。公式如下：

式中，In表示葉綠素的抑制率（%）；C0和Cn分別表示對照組和處理組中葉綠素 a的含量（μg·L-1）。

1.5 實時熒光定量 PCR

培養(yǎng) 48 h和 120 h后，分別從對照組和 10 mg·L-1nTiO2暴露組中各取藻液40 mL，12000 rpm離心10 min獲得藻細胞。然后提取RNA，具體方法依據(jù)說明書（E.Z.N.A.Total RNA Kit II，Omega）進行。提取 RNA后進行反轉(zhuǎn)錄獲得與三角褐指藻RNA堿基序列互補的 cDNA。使用實時熒光定量PCR儀（ABI PRISM 7000，美國）進行檢測。相關(guān)試劑采用 SYBR Prime RT-PCR Kit（TaKaRa）。反應條件如下：預變性95 ℃，30 s，變性95℃ 5 s，退火和延伸64 ℃ 30 s，共計循環(huán)40次。實時熒光定量所用PCR引物序列如表1所示。以同一時間點無nTiO2組中的一個樣品作為對照（即該樣品中目的基因的表達量設(shè)定為1），使用2-△△Ct方法計算每個基因的相對表達水平（Livak et al.，2001；Schmittgen et al.，2008）。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in the present study

1.6 統(tǒng)計分析

對照組與暴露組的顯著性差異統(tǒng)計使用 SPSS 20進行單因素方差分析，P＜0.05則認為對照組與暴露組的結(jié)果之間存在顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 nTiO2對三角褐指藻葉綠素a含量的影響

nTiO2暴露下的三角褐指藻葉綠素 a相對含量變化如圖1所示，隨著nTiO2暴露濃度的升高，三角褐指藻葉綠素 a含量均有不同程度的下降。100 mg·L-1nTiO2處理組在全部暴露時長下葉綠素a含量均顯著低于對照組。暴露24 h時，對照組的葉綠素a含量顯著高于各個暴露組（P＜0.05）；120 h時，只有100 mg·L-1暴露組的葉綠素a含量顯著低于對照組（P＜0.05）。以對照組、10 mg·L-1和 100 mg·L-1處理組為例，24 h 時 10 mg·L-1和 100 mg·L-1組的葉綠素 a含量分別為對照的 (84.8%±6.6%)和(40.3%±8.2%)。120 h 時 10 mg·L-1和 100 mg·L-1這兩組的葉綠素 a含量分別為對照的 (94.5%±0.3%)和 (88.4%±1.1%)。結(jié)果表明，三角褐指藻的葉綠素a含量在 nTiO2暴露下呈現(xiàn)出先下降后上升的恢復趨勢，這與先前研究發(fā)現(xiàn)的三角褐指藻細胞生長受nTiO2暴露下先抑制后恢復的現(xiàn)象類似（Wang et al.，2016）。

圖1 不同濃度nTiO2處理24—120 h三角褐指藻葉綠素a的含量Fig.1 The contents of chlorophyll a in treatments with various concentrations of nTiO2 for 24-120 h

葉綠素a抑制率如圖2所示，可見24 h和48 h時，暴露組的抑制率較高，且隨著暴露時間的增加抑制率逐漸降低。10 mg·L-1和 100 mg·L-1處理 24 h的抑制率分別為 (15.2%±6.6%)和 (59.6%±8.2%)，120 h 為 (5.5%±0.3%)和 (11.6%±1.1%)，抑制率顯著下降。與此同時我們將所得到的數(shù)據(jù)進行擬合，各濃度的線性擬合斜率均小于零（表2），進一步說明光合作用抑制率隨暴露時間存在下降趨勢；且nTiO2濃度越高，擬合斜率的絕對值越大，抑制率下降越明顯。

圖2 nTiO2暴露對三角褐指藻生長的抑制率隨時間的變化趨勢Fig.2 Inhibition rate on P.tricornutum growth in response to nTiO2 exposure at various time

表2 不同nTiO2濃度下三角褐指藻生長的抑制率與時間的回歸方程Table 2 Regression equations of inhibition rate in P. tricornutum and time at each nTiO2 concentration

2.2 nTiO2對三角褐指藻光合系統(tǒng)II最大光量子產(chǎn)量（Fv/Fm）的影響

葉綠素熒光是光合作用能量轉(zhuǎn)換的探針，葉綠素熒光參數(shù)Fv/Fm代表光合作用 PS Ⅱ反應中心的最大光量子產(chǎn)量，是測量藻類的生長和光合作用的典型指標（Genty et al.，1989），能夠有效地反映藻類受脅迫的程度。本試驗中，對照組在 72 h之后Fv/Fm達到了最大，說明了這段時間是三角褐指藻進入新的環(huán)境時的適應期（圖3a）。暴露組中除去5 mg·L-1以外其他各組48 h的Fv/Fm均顯著低于對照組（P＜0.05）。48 h以后，所有暴露組的Fv/Fm與對照組相比均沒有顯著差異（P＞0.05）。表明三角褐指藻對新的環(huán)境出現(xiàn)了適應性。暴露的前期階段nTiO2抑制了三角褐指藻的光合系統(tǒng)中光量子的產(chǎn)量，從而影響了葉綠素的含量。48 h后nTiO2對光合系統(tǒng)II最大光量子產(chǎn)量失去了影響，從而使得三角褐指藻對于環(huán)境中的nTiO2脅迫表現(xiàn)出了抗性行為或適應行為。

2.3 nTiO2對三角褐指藻光合色素相關(guān)基因表達的影響

由葉綠素a和Fv/Fm的變化趨勢可知，隨著暴露時間延長或者暴露濃度上升，nTiO2對三角褐指藻的抑制作用均呈下降趨勢。這種抑制的減弱作用應該在某些光合色素相關(guān)基因的表達水平上有所體現(xiàn)。本實驗選取光合作用相關(guān)基因，包括番茄紅素β-環(huán)化酶基因（LcyB）、八氫番茄紅素合成酶基因（Psy）、八氫番茄紅素脫氫酶基因（Pds）等類胡蘿卜素合成途徑中的重要基因，以及光合碳同化的關(guān)鍵酶核酮糖-1, 5-二磷酸梭化酶/加氧酶（Ribulose-1, 5-bisphophate carboxylase，Ruibsco）小亞基 rbcS。然后檢測其表達水平，從而從基因的層面發(fā)掘nTiO2對三角褐指藻的影響。跟據(jù)Fv/Fm的結(jié)果，當暴露濃度大于等于10 mg·L-1時，各處理組前48 hFv/Fm顯著低于對照（P＜0.05）。但這一差異在72 h后消失，因此本研究選擇10 mg·L-1組在暴露48 h和120 h后進行基因表達分析，結(jié)果如圖4所示。10 mg·L-1nTiO2暴露下基因 Psy的表達量在 48 h（第2天）和120 h（第5天）與對照組都沒有顯著性差異（P＞0.05）。在第2天和第5天相同濃度下。Pds的表達也都顯著低于對照（P＜0.05）。LcyB和rbcS是 48 h（第 2天）后表達量顯著地低于對照（P＜0.05），而 120 h（第 5天）表達顯著高于對照（P＜0.05）。LcyB第2天和第 5天的相對表達量分別為對照組的 (30.4%±1.5%)和 (164.1%±7.4%)。rbcS在第2天和第5天相對表達量分別為對照組的(21.2%±7.1%)和 (192.8%±12.2%)。

2.4 nTiO2對三角褐指藻光合系統(tǒng)的影響機制探討

圖3 不同濃度nTiO2處理24—120 h三角褐指藻Fv/FmFig.3 Fv/Fm in treatments with various concentrations of nTiO2 for 24-120 h

MNMs對微藻的生長抑制已經(jīng)被廣泛報道。在所有的MNMs中，nTiO2被認為對藻類的毒性最低。如在一項關(guān)于MNMs對月牙藻（Crescent algal）毒性的相關(guān)研究中，與納米氧化鋅和納米氧化銅相比，nTiO2的毒性效應最低（Aruoja et al.，2009），此外 nTiO2的低毒性效應也表現(xiàn)在對擬南芥（Arabidopsis thaliana）部分基因表達的抑制中。據(jù)報道，與富勒烯和納米氧化鋅相比，擬南芥受nTiO2影響而下調(diào)的基因數(shù)量最少（Landa et al.，2012）。已有的報道中，nTiO2對新月菱形藻（Crescent lozenge）的 96 h 的 EC50為 88.78 mg·L-1（Xia et al.，2015），對短凱倫藻（Karenia brevis）和中肋骨條藻（Skeletonema costatum）的72 h的EC50分別為10.69 mg·L-1和 7.37 mg·L-1（Li et al.，2015），對月牙藻的 72 h 的 EC50為 9.73 mg·L-1（Aruoja et al.，2009）。此外，在一項同樣以葉綠素a的含量計算抑制率的研究中，小球藻（Chlorella）和柵藻（Scenedesmus）在 72 h 的 EC50分別為 16.12 mg·L-1和 21.20 mg·L-1。與之相比，本研究通過測定葉綠素a而得到抑制率，在最高濃度100 mg·L-1下，24 h和48 h的抑制率大于50%，而72 h及以后其抑制率就已經(jīng)低于50%，表明nTiO2對三角褐指藻的抑制效應更低。

圖4 nTiO2對三角褐指藻光合作用相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄的影響Fig.4 Effects of nTiO2 on the transcription of genes related to photosynthesis in P. tricornutum

盡管本研究表明nTiO2對三角褐指藻的抑制不明顯，但抑制效果與暴露時間有緊密的關(guān)系。在暴露 24 h（1 d）時 100 mg·L-1nTiO2的抑制率為(59.7%±8.2%)，5 d 后 100 mg·L-1nTiO2的抑制率為(11.6%±1.1%)。而且 10—100 mg·L-1nTiO2暴露 24 h和48 h后Fv/Fm顯著低于對照（P＜0.05），3天后卻與對照無顯著差別（P＞0.05）。Chen et al.（2012）也同樣發(fā)現(xiàn) 10 mg·L-1以上濃度的nTiO2在前 12 h顯著地抑制了萊茵衣藻的Fv/Fm，隨后 nTiO2處理組中萊茵衣藻逐漸恢復到對照組的水平。本實驗中nTiO2對三角褐指藻的抑制隨著暴露時間的延長而減弱，而這種逐漸減弱的趨勢可能與三角褐指藻對nTiO2的抗性或適應行為有關(guān)。隨著暴露時間的延長，三角褐指藻可能通過某些基因如LcyB和rbcS的上調(diào)，抵抗nTiO2的不利影響。

rbcS與 1, 5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶有直接聯(lián)系，它是光合作用固定碳的關(guān)鍵酶（Miziorko et al.，1983）。已有的文獻表明暴露于 nTiO2的菠菜（Spinacia oleracea）中，Rubisco活性顯著上升（Gao et al.，2008）。本研究顯示三角褐指藻rbcS表達量在2 d時出現(xiàn)顯著下調(diào)（P＜0.05），5 d時恢復至正常水平。這與本研究中葉綠素a的變化類似。剛加入nTiO2時，藻中的rbcS對nTiO2比較敏感，表達量降低，藻的光合作用受到抑制。光合作用會產(chǎn)生大量的電子，1, 5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶可以催化光呼吸過程的第一階段，從而猝滅多余的電子，對植物起到保護作用（Niyogi，2000）。因此可以推斷，rbcS由2 d的下調(diào)到5 d的上調(diào)，一方面表現(xiàn)為藻對nTiO2暴露的適應過程中生物量的累積，另一方面可能表現(xiàn)為光合系統(tǒng)的穩(wěn)定性提高。

番茄紅素合成β-胡蘿卜素的關(guān)鍵基因是 LcyB（Bai et al.，2009）。番茄中LcyB的大量表達會顯著的增加β-胡蘿卜素在番茄中的含量（Wiebke et al.，2009）。β-胡蘿卜素是植物光合系統(tǒng)第二階段的反應中的重要組成部分（Nanba et al.，1987）。此外，nTiO2的存在會導致浮游植物體內(nèi)活性自由氧的含量上升，產(chǎn)生氧化應激（Li et al.，2015；Wang et al.，2008），而β-胡蘿卜素是有效的活性自由氧猝滅劑（Pinto et al.，2003）。綜上，LcyB由第2天的下調(diào)到第5天的上調(diào)，一方面可能表現(xiàn)為光合系統(tǒng)II更加穩(wěn)定，這與光合系統(tǒng)II最大光量子產(chǎn)量的結(jié)果相符，另一方面可能表現(xiàn)為抵抗nTiO2所導致的氧化壓力的能力逐漸提升。

3 結(jié)論

本研究通過觀察三角褐指藻在nTiO2暴露過程中光合作用途徑相關(guān)的生理生化指標的變化，探討nTiO2對三角褐指藻的光合毒性效應以及三角褐指藻在nTiO2暴露下的響應機制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，（1）nTiO2對三角褐指藻的毒性效應較低，且nTiO2對三角褐指藻葉綠素a相對含量和Fv/Fm的抑制效應隨著時間的延長而衰減，表明三角褐指藻對nTiO2脅迫可能具有適應能力。（2）藻光合色素相關(guān)基因rbcS和LcyB可能在三角褐指藻對 nTiO2暴露的抵抗過程中起到了重要的作用?？紤]到海洋微藻對于MNMs暴露的抗性，在以后的人工納米材料環(huán)境影響評價中可以考慮其對環(huán)境的短期和長期效應，并對暴露期間海洋微藻生理活動變化給予更多的關(guān)注。