呂燕紅，趙瑛，張艷萍

甘肅省農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所，甘肅 蘭州 730070

沙漠化是由于人為因素和自然因素綜合作用于脆弱的生態(tài)環(huán)境，造成植被破壞，出現(xiàn)風蝕、粗化、斑點狀流沙和低矮灌叢沙堆，造成的土壤生產(chǎn)力下降或喪失的現(xiàn)象。沙漠化是一個嚴重的全球性環(huán)境問題（Andrew et al.，2012）。中國深受沙漠化的嚴重影響，中國荒漠化土地面積為262.2萬km2，占國土面積的27.4%，這些沙漠化區(qū)域主要集中在中國東北地區(qū)西部和西北地區(qū)（Zhang et al.，2013；Li et al.，2013）。尤其是在中國西北地區(qū)，由于騰格里沙漠的外圍擴張，以及巴丹吉林沙漠至石羊河下游流域水資源日益減少，導致民勤縣的沙漠化問題日益嚴重（Du et al.，2010）。日益嚴重的荒漠化問題，已引起人們越來越多的關注。

國內(nèi)已從不同的角度進行了荒漠化治理問題研究。在中國北方干旱地區(qū)，固定沙丘向半固定、流動沙丘的轉(zhuǎn)變是土地退化的主要形式（Wang et al.，2005）。在民勤沙漠化地區(qū)，固定、半固定和流動沙地均有分布，各沙地的植被種類和密度不盡相同，已有大量的研究關注了該區(qū)域植被的生理特征（Zhang et al.，2013）。但對該區(qū)域土壤微生物群落結(jié)構受重要固沙植物的影響研究甚少，特別是對民勤沙漠化地區(qū)的植被相關微生物群落特征的研究仍然不足（Marasco et al.，2012）。雖然已經(jīng)報道了很多微生物群落結(jié)構的影響因素，然而在我們的研究中，這些因素對微生物群落結(jié)構的相對貢獻還存在著爭議。本研究的目的是明確位點特異性，沙地類型（固定沙地、半固定沙地或流動沙地），土壤性質(zhì)（pH值、土壤養(yǎng)分含量或土壤粒度），還是生物因素（不同宿主植物）是造成微生物群落變異的關鍵因素，分析研究該區(qū)域土壤細菌群落受優(yōu)勢固沙植物影響下的分布特征，為該區(qū)域的為民勤沙漠化地區(qū)的生態(tài)恢復提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況及樣品采集

民勤縣是中國嚴重的沙漠化地區(qū)，地處甘肅省河西走廊東北部，石羊河流域下游，北臨巴丹吉林沙漠，東臨騰格里沙漠（Chang et al.，2006）。民勤縣位居 101°49′41″—104°12′10″E、38°3′45″—39°27′37″N之間，最低海拔1298 m，最高海拔1936 m，平均海拔 1400 m，屬溫帶大陸性干旱氣候區(qū)，東西北三面被騰格里和巴丹吉林兩大沙漠包圍，大陸性沙漠氣候特征明顯，冬冷夏熱、氣候干燥、降水稀少、蒸發(fā)強烈、風大且頻繁（Zhao，2014）。光照充足、晝夜溫差大，年均降水量為127.7 mm，年均蒸發(fā)量2623 mm，晝夜溫差15.5 ℃，年均氣溫8.3 ℃，日照時數(shù)為3073.5 h，無霜期162 d。此區(qū)由沙漠、低山丘陵和平原3種基本地貌組成。風沙地貌為研究區(qū)內(nèi)綠洲外圍的主要地貌類型，按覆被程度，可分為流動沙丘、半固定沙丘和固定沙丘等。

按照生態(tài)學野外調(diào)查的原則和方法，根據(jù)區(qū)域生態(tài)地理和水熱條件進行采樣條帶設置。本研究中的土壤樣品均采集自民勤縣。

1.2 方法

通過描述與兩種優(yōu)勢固沙植物白刺（Nitraria tangutorum Bobr，N）和梭梭（Haloxylon ammodendron，H）相關的細菌群落多樣性與豐度之間的關系來調(diào)查民勤沙漠化區(qū)域的細菌群落。這兩種植物在固定沙地（A）、半固定沙地（B）及流動沙地（C）均有分布。從9個位點（每個位點有3個重復）收集土壤樣本，這些樣本來自于兩種優(yōu)勢的固沙植物和其對照：民勤沙漠化區(qū)域固定沙地（A）、半固定沙地（B）及流動沙地（C）的白刺（N）和梭梭（H）。2014年5月進行樣品的采集。

根際土壤的采集：沿成熟生長期的白刺或梭梭主根向下挖掘20—50 cm，并分離該土層根附近的土壤，取質(zhì)地較為均勻的土壤收集到無菌鋁盒中（約400 g），每個位點隨機選取長勢接近的3株植物以同樣方法采集根際土壤作為重復。

非根際土壤的采集：在采集根際土壤的植物附近大約200 cm的范圍內(nèi)隨機選取3個位點，分別采集20—50 cm土層質(zhì)地均勻的土壤裝入無菌鋁盒中（約400 g）。

所有樣品采集后立刻裝入冰盒并運送至實驗室，將樣品分裝并保藏于-20 ℃或-80 ℃冰箱中，分別用于土壤理化性質(zhì)的測定或DNA的提取。

利用 MiSeq高通量測序的方法從以下幾個密切相關的目標對細菌群落進行評估：（1）探討和比較本地區(qū)細菌群落在分類學多樣性上的異同；（2）揭示影響細菌群落分布的主要因素；（3）分析兩種灌木的分布和生長狀況與細菌群落的關系；（4）從細菌角度解釋為什么這兩種優(yōu)勢固沙植物在相對惡劣的條件下生長狀況更好。研究為民勤地區(qū)脆弱生態(tài)系統(tǒng)的恢復及優(yōu)勢固沙植物的適應機制提供理論依據(jù)。

1.3 土壤理化性質(zhì)測定

對所有土壤樣品進行了土壤全碳（STC）、土壤全氮（STN）、土壤全磷（STP）、土壤有機碳（SOC）、pH、電導率（EC）、土壤總含水量、鉀離子（K+）、鈣離子（Ca2+）及鈉離子（Na+）的測定。將土壤懸液（m∶V=1∶5）搖勻，靜置30 min后用pH計測定土壤pH值。利用元素分析儀（VarioEL III，Germany）測定土壤全碳（STC）和全氮（STN）。利用重鉻酸鉀氧化法測定土壤有機碳（SOC），并計算出土壤有機質(zhì)含量（SOM）。利用磷酸鉬銻抗比色法測定土壤全磷（STP）。采用火焰光度法測定土壤鉀離子（K+）、鈣離子（Ca2+）和鈉離子（Na+）。測定方法參照Smith（1983）。

1.4 土壤DNA提取及高通量測序

利用E.Z.N.A土壤DNA提取試劑盒（OMEGA，USA）從5 g濕土中提取總DNA。提取的DNA稀釋于 TE 緩沖液（10 mmol·L-1Tris-HCl，1mmol·L-1EDTA，pH=8.0）中置于-20 ℃?zhèn)溆?。從純化的DNA中取50 ng作為擴增模板，使用連接了標簽的通用引物 F515（GTGCCAGCMGCCGCGG）和 907R（CCGTCAATTCMTTTRAGTTT）對細菌16S rRNA的V4—V5區(qū)進行擴增，每個樣品在50 mL的反應體系下進行擴增，并設有3個重復，反應體系如下：94 ℃下變性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，30循環(huán)后在 72 ℃延伸 10 min。PCR產(chǎn)物利用Agarose Gel DNA純化試劑盒（TaKaRa）純化，并在質(zhì)量為 2%的瓊脂糖凝膠上電泳檢測。利用Illumina Miseq PE250對所得 DNA片段進行測序（MajorbioBioPharm Technology Co.，Ltd.，Shanghai，China）。高通量測序所得序列隨后進行過濾、質(zhì)量控制及生物信息分析（Edgar，2013；Ni et al.，2017）。

1.5 數(shù)據(jù)分析

高通量數(shù)據(jù)使用Trimmomatic軟件對原始測序序列進行質(zhì)控，并利用FLASH軟件進行拼接。使用UPARSE 軟件（version 7.1 http://drive5.com/uparse/），根據(jù)97%的相似度對序列進行OTU聚類，并將其中的單序列和嵌合體在聚類的過程中去除。使用 RDP classifier（http://rdp.cme.msu.edu/）對每條序列進行物種分類注釋，在 Silva數(shù)據(jù)庫（SSU123）中進行比對，比對閾值通常設置為 70%。使用 R語言（veganpackagein）進行PCA、RDA分析。數(shù)據(jù)的標準化處理及作圖分別使用Excel 2013和Origin 8.0完成。采用因子分析、信度分析、單因素方差分析及皮爾遜積差相關對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析（P=0.05）。所有統(tǒng)計學分析均使用SPSS 18.0軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 環(huán)境因子與土壤細菌群落的關系

研究土壤pH值在8.07—9.23之間。土壤STC和STN分別在2.93—9.21 g·kg-1及0.13—0.45 g·kg-1之間變化。土壤 Na+含量介于 103.21—512.47 mg·kg-1之間。土壤質(zhì)地中絕大部分為沙土。所有的理化性質(zhì)表明，民勤沙漠土壤具有偏堿性、高鹽度、低營養(yǎng)的特點。

圖1 細菌群落與主要環(huán)境因子的冗余分析（RDA）Fig.1 Redundancy analysis (RDA) of bacterial community and major environmental factors

對所有樣品細菌群落與主要環(huán)境因子的基于OTU水平的冗余分析（RDA），見圖 1。圖中首要的兩軸共解釋了83.17%的變異。結(jié)果顯示3個沙丘的根際土壤樣品聚為一簇，并與K+、Ca2+離子呈負相關。而非根際土壤發(fā)生了顯著的分離，并與沙土及電導率呈正相關，結(jié)果表明土壤性質(zhì)及細菌群落結(jié)構受不同類型沙丘的影響發(fā)生了顯著改變，植物的定植使土壤性質(zhì)和細菌群落結(jié)構發(fā)生了轉(zhuǎn)變，且不同類型沙丘上的植物根際土壤性質(zhì)及細菌群落結(jié)構趨于接近。

2.2 測序結(jié)果的α多樣性指數(shù)分析

物種積累曲線代表了隨著樣本數(shù)的增加有多少新的 OTU被積累到分析中，從而被用來確定我們的實驗中是否觀察到了細菌的總體多樣性。隨著我們研究中樣本量的增加，OTU的數(shù)量趨于平穩(wěn)，這表明我們的結(jié)果在很大程度上可以代表土壤細菌群落的真實多樣性，見圖2。

圖2 所有樣品的物種積累曲線Fig.2 Species accumulationcurve of all samples

2.3 細菌群落的分布特征

目前對于植物相關微生物群落的研究方法主要有傳統(tǒng)的基于培養(yǎng)的方法，以及以高通量測序為代表的分子生物學方法。利用可培養(yǎng)的方法研究微生物群落具有較大的局限性（Cui et al.，2015），高通量測序方法則可以對微生物群落結(jié)構提供更為全面的認知（Buée et al.，2009）。本研究利用高通量測序技術來測定民勤不同沙地類型土壤細菌多樣性，研究結(jié)果為：在所有27個土壤樣品中，我們共得到了382306條有效序列，每個樣品所得的序列數(shù)在10505—17126條（平均14159條）。序列讀出長度在396.22—397.15 bp之間（平均396.50 bp）。

放線菌門（Actinobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、浮霉菌門（Planctomycetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）酸桿菌門（Acidobacteria）及Candidate_division_TM7在所有土壤樣品中均為優(yōu)勢菌群（相對豐度＞5%），這些菌群的相對豐度占總量的94%以上（圖3a）。Caldiserica、Candidate_division_OD1、Tenericutes、Thermotogae、WCHB160、Deferribacteres、Fibrobacteres、TM6、BHI80-139、Caldiserica、SHA-109、Elusimicrobia、JL-ETNP-Z39、Chlorobi及 Nitrospirae在所有樣品中的相對豐度較低（相對豐度＜5%），但是它們在所有樣品中分布廣泛且占有一定比例（相對豐度＞0.1%）。厚壁菌門在土壤樣品BC和CC中的相對豐度最高，然而放線菌門在其他土壤樣品中均占最高相對豐度。與其他土壤樣品相比，CN中的擬桿菌門具有較高的相對豐度。

本研究中的優(yōu)勢菌屬為乳球菌屬（Lactococcus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、節(jié)細菌屬（Arthrobacter）、Subgroup_6_norank、Nitrosomonadaceae_uncultured、類諾卡氏菌屬（Nocardioides）、土壤芽孢桿菌屬（Solibacillus）等（圖3b）。

2.4 細菌群落與根際及沙地的關系

對細菌群落基于 OTU水平的主成分分析（PCA）如圖 4所示，結(jié)果顯示所有根際樣品聚為一簇，而非根際土壤聚為一簇，即根際與非根際土壤細菌群落發(fā)生了顯著分離。白刺與梭梭根際樣品之間則距離接近，表明它們之間的細菌群落差異不大。非根際土壤在不同沙地類型的影響下其細菌群落也較為接近。

圖4 細菌群落的主成分分析（PCA）Fig.4 Principal component analysis (PCA) of bacterial community

2.5 根際與非根際土壤細菌群落的比較分析

圖3 優(yōu)勢細菌群落在所有樣品的相對豐度Fig.3 Relative abundances of the dominant bacterial groupsin all samples

白刺（NitrariatangutorumBobr）和梭梭（Haloxylonammodendron）具有很強的抗旱抗沙埋能力，是民勤沙漠化地區(qū)的優(yōu)勢固沙植物（Zhao et al.，2005）。對根際與非根際土壤細菌群落的比較分析表明：白刺根際與非根際獨有的 OTU數(shù)分別為414和273，而共有的OTU有1347個（圖5a），這占到了總數(shù)的66.2%。變形菌門和擬桿菌門在白刺根際與非根際之間的相對豐度具有顯著差異（圖5b）。梭梭根際有431個獨有OTU，這一數(shù)量在非根際為 184，且根際與非根際之間同樣具有大量共有OTU（1436個），占OTU總數(shù)的70.01%（圖5c）。與非根際相比，根際土壤中具有更高豐度的放線菌門、擬桿菌門和變形菌門，而非根際土壤中的浮霉菌門相對豐度高于根際土壤（圖5d）。

3 討論

3.1 沙地土壤性質(zhì)與細菌群落的關系

研究結(jié)果表明民勤荒漠化地區(qū)的土壤養(yǎng)分分布不平衡，土壤有機質(zhì)（SOM）含量在不同類型沙地間，以及兩種優(yōu)勢固沙植物根際間存在顯著差異，這主要是受到了K+和STN的影響。我們的研究符合半固定和流動沙地的資源島假說，并依賴于灌木的生長狀況，特別是流動沙地的白刺根際土壤中SOM值達到了最高。這主要是由于植物根系分泌物向土壤中釋放了大量的養(yǎng)分所致（Franco-Otero et al.，2012）。然而在固定沙地上兩種植物的根際土壤中SOM值均低于非根際土壤。已有研究表明在固定沙地的表層沉積了厚厚的結(jié)皮及砂質(zhì)土層，從而阻礙了灌木對水分和養(yǎng)分的吸收，并發(fā)現(xiàn)灌木的覆蓋度和生產(chǎn)力在建立 20年后均有所下降，這可能是由于深層土壤含水率下降所致（Li et al.，2004）。此項研究很好地解釋了為什么在固定沙地上不符合資源島假說，甚至白刺和梭梭種群在固定沙地上面臨著退化的威脅。本項研究認為不同類型沙丘上植物根際是改變土壤性質(zhì)及細菌群落的首要因素，這對于治理沙丘由流動向半固定、固定轉(zhuǎn)變具有重要意義。

3.2 土壤細菌群落多樣性

圖5 根際與非根際土壤樣品的比較分析Fig.5 Comparison of the rhizosphere and bulk soil samples

研究發(fā)現(xiàn)放線菌門、厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門、浮霉菌門、綠彎菌門及酸桿菌門是優(yōu)勢菌群，這與在其他沙漠土壤中的研究結(jié)果相一致（Andrew et al.，2012）。在騰格里沙漠的研究中變形菌門是非常優(yōu)勢的菌門（Zhang et al.，2012），然而本研究中厚壁菌門和放線菌門是最優(yōu)勢的菌門，這可能是由于我們的樣品是在旱季采集，而厚壁菌門和放線菌門在干旱和寡營養(yǎng)的土壤中豐度較高（Vanessa et al.，2013）。在研究中，一些菌門，如Thermotogae、Caldiserica和Deinococcus-Thermus一直被認為具有良好的耐熱性和耐輻射性，而這些菌群在大多數(shù)沙漠地區(qū)都有發(fā)現(xiàn)（Chanal et al.，2006；Saul-Tcherkas et al.，2013）。擬桿菌門和變形菌門在土壤中所占比例越大，在一定程度上代表了土壤越肥沃，在一些黑土地及半濕潤地區(qū)的土壤中擬桿菌門和變形菌門往往是優(yōu)勢菌群（Liu et al.，2014）。變形菌門和擬桿菌門在流動沙地的白刺和半固定沙地的梭梭根際土壤中具有較高豐度，在本研究中這兩處樣地的植物生長狀態(tài)最好。我們推測擬桿菌門和變形桿菌門中具有更多的植物促生菌，而植物通過根際向土壤中分泌的根系分泌物對這類菌群具有選擇效應。厚壁菌門在非根際土壤中豐度最高，因為許多厚壁菌門可以產(chǎn)生內(nèi)生孢子，從而能夠在極端條件下存活。這一現(xiàn)象表明，灌木根系分泌物改變了其根際細菌群落的組成，使其相關的細菌群落得以更好的存活。

3.3 沙地類型和植物位點對細菌群落的影響

重復采樣方法的結(jié)果表明，土壤細菌群落的形成主要取決于在研究位點是否定植有植物，而沙地類型是次要因素。這一結(jié)果與近期在中國北方其他荒漠區(qū)不同類型沙丘上的研究結(jié)果相一致（Gao et al.，2019a）。一些土壤性質(zhì)，特別是土壤pH和碳含量與細菌群落多樣性顯著相關（Andrew et al.，2012；Vanessa et al.，2013）。固定沙地和半固定沙地梭梭根際的棲熱菌門、變形菌門、擬桿菌門等占優(yōu)勢，而白刺根際則與之相反。這些群落的微生物群落分布與兩種灌木的生長狀態(tài)相一致，這些細菌群落豐度越高，其寄主植物的生長狀態(tài)也越好。我們研究結(jié)果清楚地表明白刺與梭梭的生長條件存在顯著差異，可能是因為白刺的生長模式很容易形成土包，所以形成了一個相對不太惡劣的微生物生存微環(huán)境。雖然沙丘的流動性對土壤細菌群落起到了一定的影響，然而植物在流動的沙丘上定植后產(chǎn)生的根系分泌液進一步改善了土壤性質(zhì)，為根際細菌提供了充足的養(yǎng)分，同時提供了相對穩(wěn)定的棲息條件（Berg et al.，2008）。結(jié)合近期的研究，我們認為這些菌群很可能對其寄主植物的生長及抗逆起到顯著的促進作用（Gao et al.，2019b）。

3.4 細菌群落受復雜相互作用的影響

土壤微生物群落多樣性和分布在不同的生態(tài)系統(tǒng)中存在著明顯的差異，這種差異可能與一系列土壤非生物和生物因素有關（Garbeva et al.，2004）。許多研究表明環(huán)境因素，如土壤養(yǎng)分（Hillebrand et al.，2001）、pH（Rousk et al.，2010）、植物根際（Xiong et al.，2010）、微生物特異分布（Whitaker et al.，2003）和生境異質(zhì)性（Martiny et al.，2006）均可影響微生物群落結(jié)構。目前普遍認為細菌群落在土壤中受到復雜的相互作用影響（Marschner et al.，2001）。一些研究認為植物種類起到了關鍵作用（Stanlotter et al.，2001；Kowalchuk et al.，2002），也有一些研究認為土壤類型起到了更為重要的作用（Citlali et al.，2016；Hartmann et al.，2017）。在中國北方其他區(qū)域已有研究顯示固沙植物根際細菌多樣性對于流動沙丘向半固定及固定沙丘的轉(zhuǎn)變至關重要，根際細菌中包含有大量植物促生菌能夠促進植物在不同類型沙丘上的定植（Gao et al.，2019a；Gao et al.，2019b）。此外，沙漠灌木可能會對相關的微生物產(chǎn)生促進或抑制的作用，在提供養(yǎng)分資源的同時產(chǎn)生生長抑制化合物，改變微生物群落的分布比例，甚至出現(xiàn)一些非根際土壤沒有的類群（Andrew et al.，2012）。

本研究利用高通量測序的方法揭示了大量以前未被發(fā)現(xiàn)的細菌群落，并闡明這些類群對極端環(huán)境的潛在重要性。與當?shù)赝寥缹?yōu)勢類群的影響相比，植物類型對微生物群落的影響較小，這表明該環(huán)境中極端的物理因素對細菌群落的形成起著關鍵作用，根際改善了營養(yǎng)資源，改變了細菌群落的分布，但寄主植物類型對根際細菌群落的影響不大。我們的研究結(jié)果為揭示影響民勤沙漠地區(qū)土壤細菌群落分布特征的重要環(huán)境因子提供了理論依據(jù)，該結(jié)果有助于保持該地區(qū)土壤微生物多樣性與推動生態(tài)環(huán)境修復。

4 結(jié)論

（1）民勤荒漠化地區(qū)土壤養(yǎng)分貧瘠，具有偏堿性、高鹽度、低營養(yǎng)的特點。不同類型沙地土壤性質(zhì)的轉(zhuǎn)變造成了固沙植物根際土壤性質(zhì)的差異。

（2）放線菌門、厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門、浮霉菌門、綠彎菌門及酸桿菌門在所有土壤樣品中均為優(yōu)勢菌群。厚壁菌門、放線菌門、擬桿菌門具有較高的相對豐度。

（3）固沙植物可以通過根系分泌物對其根際土壤細菌群落進行調(diào)節(jié)，并體現(xiàn)出了對特定菌群的選擇作用。與非根際相比，根際土壤中具有更高豐度的放線菌門、擬桿菌門和變形菌門，而非根際土壤中的浮霉菌門相對豐度高于根際土壤。

（4）研究位點是否定植有固沙植物是決定土壤細菌群落形成的首要因素，而沙地類型是次要因素，而寄主植物類型的影響不顯著。