任 靜，馬良娟

紫外線照射皮膚發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而誘導(dǎo)產(chǎn)生以羥自由基和脂質(zhì)過氧化物為主的活性氧（reactive oxygen species，ROS），ROS 可直接導(dǎo)致脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸的損傷以及皮膚光老化[1]。Nrf2基因是一種含有亮氨酸拉鏈基本結(jié)構(gòu)的核轉(zhuǎn)錄因子，它是機(jī)體內(nèi)重要的氧化應(yīng)激因子， 以轉(zhuǎn)錄調(diào)控的方式對(duì)抗皮膚細(xì)胞的氧化應(yīng)激，從而在氧化反應(yīng)中保護(hù)細(xì)胞免受損害[2]?；诖?，本文通過研究中波紫外線（UVB）誘導(dǎo)人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞（HaCaT）氧化損傷，觀察和評(píng)估Nrf2基因?qū)?xì)胞的氧化損傷和光損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 HaCaT 由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院皮膚科柏冰雪教授饋贈(zèng)。

1.1.2 儀器 紫外線光源（南京華強(qiáng)公司）；紫外光強(qiáng)度計(jì)（深圳市欣寶瑞儀器有限公司）；超凈工作臺(tái)（哈爾濱市東聯(lián)生化儀器有限公司）；倒置顯微鏡（日本Nikon 公司）；iMark 酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad 公司）；離心機(jī)（長沙湘儀公司）；CO2培養(yǎng)箱（上海力康醫(yī)療有限公司）；水浴振蕩器（哈爾濱東聯(lián)生化儀器有限公司）；ChemiScope 6000 系列化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司）。

1.1.3 試劑 PBS 粉劑、CCK-8 細(xì)胞增殖檢測試劑盒（日本同仁化學(xué)研究所）；DMSO（美國Sigma 公司）；胰酶細(xì)胞消化液（上海碧云天公司）；DMEM培養(yǎng)基（美國Hyclone 公司）；胎牛血清（天津康源公司）；Nrf2基因沉默慢病毒包裝（上海吉瑪公司）；超氧化物陰離子熒光探針、試劑盒、RIPA 裂解液（上海碧云天公司）； BCA 蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天公司）；PVDF 膜 （北京Biosharp 公司）；一抗Nrf2 抗體（兔抗人）（日本CST 公司）；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG 抗體（美國Proteintech 公司）。

1.2 方 法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HaCaT 細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中 （37℃、95%濕度及體積分?jǐn)?shù)5%CO2）貼壁培養(yǎng)。傳代取對(duì)數(shù)生長期的HaCaT 細(xì)胞，加入胰酶消化液消化后，用含10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基以1×105個(gè)/ml 細(xì)胞密度接種于6 或96 孔培養(yǎng)板中，待長至50%～60%且處于對(duì)數(shù)生長，換成無血清培養(yǎng)基，饑餓24 h 后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染具體步驟按慢病毒包裝轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，確認(rèn)目的細(xì)胞的感染方法和感染復(fù)數(shù)（MOI）。將細(xì)胞接種于6 孔板，進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。待生長穩(wěn)定后收集細(xì)胞檢測Nrf2 沉默效果并培養(yǎng)待用。

1.2.3 細(xì)胞分組處理 待HaCaT 細(xì)胞融合80%以上后，分為正常組（無UVB 輻射）、UVB 輻射組（采用UVB 輻射）、SiRNA 組（基因沉默，無UVB 輻射）、SiRNA+ UVB 照射組（基因沉默，采用UVB 輻射）。每組細(xì)胞均有3 個(gè) 復(fù)孔，棄去細(xì)胞培養(yǎng)基，加入適量PBS 覆蓋細(xì)胞，再用30 mJ/cm2劑量UVB 輻射?？瞻讓?duì)照組需用鋁箔覆蓋。棄去PBS，加入10%胎牛血清DMEM 培養(yǎng)基于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.4 測定指標(biāo)及方法 采用Western blot 法檢測Nrf2 表達(dá)的變化。主要步驟：收集上述每組孔板里HaCaT 細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白后采取BCA 法測蛋白濃度。8%SDS-PAGE 凝膠垂直電泳，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉，加入Nrf2（濃度比分別為1:1 000），4℃過夜，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG 進(jìn)行孵育，ECL 試劑檢測膜上的免疫反應(yīng)條帶，并用ChemiScope 6000 系列化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)采集圖像、對(duì)條帶灰度值進(jìn)行量化分析。以β-肌動(dòng)蛋白（1:1 000）作為內(nèi)參照，比較不同處理后上述蛋白表達(dá)的差異，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次以上。①HaCaT 細(xì)胞增殖活性的測定：將細(xì)胞接種于96 孔板，按1.2.3 分組處理細(xì)胞，每孔加入溶液（按培養(yǎng)基:CCK-8=10:1 的比例提前配好）110 μl，孵育3 h 后棄去上清，于酶標(biāo)儀450 nm 波長測各孔A值。②細(xì)胞內(nèi)活性氧ROS 含量的測定：UVB 輻射30 min 后收集細(xì)胞，棄去原培養(yǎng)基；加入含1 μmol/L DHE 的無血清培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育30 min；用無血清培養(yǎng)液沖洗4 次，使未進(jìn)入細(xì)胞的DHE 得到充分去除。在流式細(xì)胞儀上使用535 nm 激發(fā)波長和610 nm 發(fā)射波長檢測DHE 平均熒光強(qiáng)度。

圖1 不同MOI值時(shí)HaCaT轉(zhuǎn)染情況（×200）

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用SPSS22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)用組間比較，采用單因素ANOVA 方差分析。

2 結(jié)果

2.1 不同MOI 值時(shí)HaCaT 轉(zhuǎn)染情況

從圖1 可見，隨著MOI 值的增高，綠色熒光陽性的細(xì)胞比例逐漸增大（圖1a-1d），而MOI 為20 時(shí)與MOI 為50 時(shí)，細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率均在50%，符合實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染要求，選擇20 為細(xì)胞最合適的MOI。

圖2 UVB 照射前后HaCaT 細(xì)胞形態(tài)變化（×200）

2.2 UVB 照射前后 HaCaT 細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化

倒置光學(xué)顯微鏡下顯示正常的 HaCaT 細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期的形態(tài)， 細(xì)胞為多角形，呈簇集狀生長，生長良好（圖 2a）；30 mJ/cm2UVB 照射后繼續(xù)培養(yǎng)24 h 的 HaCaT 細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓，數(shù)量明顯減少（圖2b）。NrF2-siRNA 組（基因沉默，不輻射），細(xì)胞呈簇集狀生長，生長良好（圖2c）。Nrf2-siRNA+UVB組（基因沉默后照射30 J/cm2UVB 后繼續(xù)培養(yǎng)24 h）貼壁細(xì)胞明顯減少，漂浮死亡的細(xì)胞增多，貼壁的細(xì)胞部分去正常的膜結(jié)構(gòu)（圖2d）。

2.3 各組HaCaT 細(xì)胞的活力情況

CCK-8 檢測結(jié)果顯示，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生存率分別為 100%、45.86%、59.66%、15.14%。與正常對(duì)照組相比，基因沉默組以及經(jīng)30 mJ/cm2UVB 照射后的各組細(xì)胞的活性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與 UVB 照射組對(duì)比，siRNA+UVB 組的細(xì)胞活性明顯降低，各實(shí)驗(yàn)組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

表1 各組細(xì)胞存活率

2.4 各組HaCaT 細(xì)胞的活性氧熒光強(qiáng)度

每管內(nèi)計(jì)數(shù)約1 萬個(gè)細(xì)胞，計(jì)算單個(gè)細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度（MEAN），P2 為ROS 表達(dá)陽性區(qū)域。A、B、C、D 分別為正常細(xì)胞組、UVB 照射組、SiRNA組、SiRNA+UVB 照射組。與正常組相比，Nrf2基因沉默組ROS 平均熒光強(qiáng)度增加，UVB 照射后細(xì)胞ROS 水平明顯增高（電軸右偏，MEAN 增強(qiáng)），其中，與正常組相比，UVB 照射組MENA 增加1 倍左右；與SiRNA 組 相 比，SiRNA+UVB 組 的MEAN 增 加幅度在2 倍以上。說明UVB 照射能使細(xì)胞ROS 增加，其中Nrf2基因沉默后，再進(jìn)行UVB 照射細(xì)胞的ROS增加更顯著，表明細(xì)胞損傷程度也更嚴(yán)重（圖3）。

2.5 各組HaCaT 細(xì)胞中Nrf2 蛋白的表達(dá)

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Nrf2-siRNA 基因的HaCaT 細(xì)胞，Nrf2蛋白的表達(dá)明顯降低，說明慢病毒感染HaCaT 細(xì)胞是成功的。與正常組相比，30 mJ/cm2UVB 照射后，HaCaT 細(xì)胞中 Nrf2 蛋白的表達(dá)降低（圖 4）。

3 討論

UVB 輻射主要是由皮膚吸收的（90%的波長范圍內(nèi)的輻射是由表皮層阻止的），因此它主要影響表皮細(xì)胞。在光老化過程中，角質(zhì)層可能會(huì)發(fā)生角化過度，表皮干燥、增厚，有皺紋，色素沉著，毛細(xì)血管擴(kuò)張癥，皮膚松弛，黑頭。臨床上，光老化包括日光性角化病、基底細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌和黑素瘤[3]。紫外線照射皮膚發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生以羥自由基和脂質(zhì)過氧化物為主的活性氧（ROS），可直接導(dǎo)致脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸的損傷以及皮膚光老化[1]?？寡趸瘎?duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)是一種重要的防御機(jī)制，可抗內(nèi)在和外在氧化損傷的有害影響[4]。在本次研究中，實(shí)驗(yàn)研究證明 30 mJ/cm2UVB 照射后 24 h，倒置光學(xué)顯微鏡下觀察 HaCaT 細(xì)胞出現(xiàn)皺縮，貼壁細(xì)胞數(shù)量明顯降低，漂浮細(xì)胞增多。CCK-8 的方法檢測HaCaT 細(xì)胞在不同情況下的存活率，發(fā)現(xiàn)經(jīng)30 mJ/cm2UVB 照射后與正常組相比，細(xì)胞的存活率下降。流式細(xì)胞儀分析HaCaT 細(xì)胞的ROS 熒光強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)經(jīng)30 mJ/cm2UVB 照射后細(xì)胞的ROS 平均熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)UVB 能誘導(dǎo)HaCaT 細(xì)胞的光損傷。Nrf2 在細(xì)胞內(nèi)的氧化條件下與抗氧化反應(yīng)原件（antioxidant response elemen，ARE）結(jié)合，啟動(dòng)抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的與細(xì)胞保護(hù)有關(guān)的抗氧化酶。Nrf2 誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的與細(xì)胞保護(hù)有關(guān)的抗氧化酶包括谷胱甘肽S 轉(zhuǎn)移酶（GST）、醌氧化還原酶(NQO1）、γ-谷氨酰半胱氨酸連接酶（GCL）、血紅素氧合酶-1（HO-1）、谷胱甘肽還原酶（GR）、過氧化氫酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）、葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶（UDP-UGT）[5-7]，在氧化反應(yīng)中保護(hù)細(xì)胞免受損害。對(duì)Nrf2基因敲除小鼠進(jìn)行紫外線照射，其抗氧化基因的表達(dá)降低后，氧化應(yīng)激損傷明顯加強(qiáng)，證明 Nrf2-ARE 通路是調(diào)控細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的重要途徑[8]。在進(jìn)行大鼠腦缺血再灌注的試驗(yàn)（損傷機(jī)制主要是產(chǎn)生的大量自由基與脂質(zhì)、蛋白質(zhì)及核酸發(fā)生反應(yīng)，從而導(dǎo)致膜脂質(zhì)過氧化）時(shí)，大鼠腦缺血后再灌注的腦組織中Nrf2 的表達(dá)上升，使用激動(dòng)劑增加Nrf2 表達(dá)時(shí)，缺血腦組織的含水量減少，梗死體積縮小，證明 Nrf2 在腦缺血再灌注的損傷中具有保護(hù)作用,以及具有清除自由基的作用[9]。因此，探索激活細(xì)胞防御的保護(hù)性分子，包括天然產(chǎn)物中的保護(hù)性分子，即通過激活Nrf2 以防護(hù)紫外線誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，為光老化的防治提供了新策略。由于表皮角質(zhì)形成細(xì)胞經(jīng)常暴露于紫外線照射，激活Nrf2 是人類皮膚細(xì)胞的有效保護(hù)的關(guān)鍵。在本次研究中，證實(shí) UVB 輻射后，Western-blot 技術(shù)檢測到HaCaT 細(xì)胞中 Nrf2 蛋白表達(dá)降低，同時(shí)，筆者的研究發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Nrf2-siRNA 基因的HaCaT 細(xì)胞，在Nrf2 蛋白表達(dá)降低的基礎(chǔ)上，進(jìn)行UVB（30 mJ/cm2）照射后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，倒置光學(xué)顯微鏡下觀察 HaCaT 細(xì)胞與其他組比較，貼壁細(xì)胞明顯減少，漂浮死亡的細(xì)胞增多，貼壁的細(xì)胞部分去正常的膜結(jié)構(gòu)。CCK-8 法檢測發(fā)現(xiàn)與 UVB 照射組及siRNA組對(duì)比，siRNA+UVB 組細(xì)胞活性是顯著降低的。流式細(xì)胞儀檢測HaCaT 細(xì)胞的ROS 熒光強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Nrf2-siRNA 基因的HaCaT 細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度明顯高于正常組和UVB 組，在進(jìn)行UVB（30 mJ/cm2）照射后，siRNA+UVB 組與siRNA 組比較，平均熒光強(qiáng)度增加2 倍左右，而UVB 組進(jìn)行UVB（30 mJ/cm2） 照射后與正常組比較平均熒光強(qiáng)度增加1倍左右。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Nrf2基因沉默表達(dá)的HaCaT 細(xì)胞，在UVB 照射后，細(xì)胞的損傷更嚴(yán)重，其機(jī)制可能與Nrf2基因 抗氧化應(yīng)激通路密切相關(guān)。UVB 照射細(xì)胞誘發(fā)細(xì)胞損傷，除了Nrf2-ARE 通路，還有其他多種信號(hào)通路參與皮膚光老化的發(fā)生，如核因子κB（NF-κB）信號(hào)通路，絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路和磷脂酰肌醇-3 激酶-絲氨酸/蘇氨酸激酶——西羅莫司靶蛋白（PI3K-AKt-mTOR）信號(hào)通路[10]。

圖3 各組HaCaT 細(xì)胞中ROS的平均熒光強(qiáng)度

圖4 各組HaCaT細(xì)胞Nrf2蛋白的表達(dá)

綜上所述，UVB 能造成體外培養(yǎng)的HaCaT 損傷，Nrf2基因在UVB 誘導(dǎo)的角質(zhì)形成細(xì)胞的光損傷中具有保護(hù)作用。