郝賽恒,劉 學(xué),凌 旺,胡海峰

(1.浙江工業(yè)大學(xué) 長(zhǎng)三角綠色制藥協(xié)同創(chuàng)新中心,浙江 杭州 310014;2.中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)研究總院,上海 201203;3.國(guó)藥集團(tuán)健康產(chǎn)業(yè)研究院有限公司,上海 201203)

痛風(fēng)是一種單鈉尿酸鹽(MSU)在關(guān)節(jié)及其周?chē)M織沉積而誘發(fā)的反復(fù)發(fā)作性關(guān)節(jié)炎癥性疾病,屬代謝性風(fēng)濕病范疇。本病主要生化基礎(chǔ)為高尿酸血癥,主要臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)紅、腫、熱和痛。痛風(fēng)的治療原則概括為迅速有效的緩解其急性發(fā)作,降低血尿酸,預(yù)防其反復(fù)發(fā)作[1-2]。

青風(fēng)藤?gòu)?fù)方顆粒是本院根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道及中藥典籍選擇21種藥材,利用疼痛、腫脹和高尿酸動(dòng)物模型對(duì)其鎮(zhèn)痛、消腫和降尿酸活性進(jìn)行大量體內(nèi)篩選獲得。該復(fù)方顆粒由青風(fēng)藤、牛膝和甘草等藥材組成,具有清熱燥濕,祛瘀通絡(luò),健脾泄?jié)?消腫止痛之功效,用于治療高尿酸血癥和痛風(fēng)。方中桂枝具有溫經(jīng)通脈、疏風(fēng)通絡(luò)和散寒止痛之效;赤芍可散瘀止痛、清熱涼血,與桂枝經(jīng)典配伍,共奏調(diào)和營(yíng)衛(wèi)、溫通止痛之效,兩藥共為君藥;青風(fēng)藤具有祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)之效為臣藥;佐以牛膝補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨,利水通淋,引熱下行;甘草則為使藥,有調(diào)和諸藥之效,同時(shí)能夠益氣健脾,強(qiáng)化健脾之功。諸藥合用,共達(dá)清熱祛濕、祛瘀止痛、活血消腫和健脾益腎之功效[3-5]。筆者擬通過(guò)鎮(zhèn)痛、抗炎、消腫、降尿酸試驗(yàn)及急性毒性試驗(yàn),對(duì)青風(fēng)藤?gòu)?fù)方顆粒的藥效和毒性進(jìn)行研究,為臨床用藥提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)ICR小鼠,雄性,體重18～25 g,由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供,動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(滬)2013-0016。動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,自由進(jìn)食、飲水。

1.2 藥物與試劑

青風(fēng)藤?gòu)?fù)方顆粒,由國(guó)藥集團(tuán)健康產(chǎn)業(yè)研究院有限公司提供;阿司匹林腸溶片,拜耳醫(yī)藥保健有限公司,批號(hào):BJ44387;地塞米松乳膏,三九醫(yī)藥,批號(hào):1611038H;秋水仙堿片,西雙版納版納藥業(yè)有限責(zé)任公司,批號(hào):150801;苯溴馬隆,德國(guó)赫曼大藥廠,批號(hào):H20130358;尿酸鈉,Sigma-Aldrich公司,批號(hào):P1343586;尿酸,上海沃凱化學(xué)試劑有限公司,批號(hào):20180206;次黃嘌呤,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號(hào):P1400392;尿酸試劑(氧化酶法),科華生物科技有限公司,批號(hào):2016111H;冰醋酸、氫氧化鈉、二甲苯,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,分析純。

1.3 儀 器

JY系列多功能天平,上海衡平儀器儀表廠;KW-7C足趾容積測(cè)量?jī)x,南京卡爾文生物科技有限公司;Allegra X-22R BECKMAN臺(tái)式離心機(jī),美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司;ZY-260全自動(dòng)生化分析儀,科華生物科技有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 青風(fēng)藤?gòu)?fù)方顆粒的鎮(zhèn)痛作用實(shí)驗(yàn)

60只ICR小鼠,隨機(jī)分為6組,分別為空白對(duì)照組,模型組,阿司匹林陽(yáng)性對(duì)照組(0.2 g/kg),青風(fēng)藤?gòu)?fù)方顆粒高、中、低劑量組(6.42,3.21,1.60 g/kg),每組10只,空白對(duì)照組與模型組小鼠灌胃0.5%CMC-Na混懸液,其余給藥組給予相應(yīng)的藥物溶液,給藥20 mL/kg,連續(xù)給藥5 d,末次給藥1 h后,腹腔注射1.0%的冰醋酸溶液0.2 mL/只,其中空白對(duì)照組注射等體積的0.9% NaCl溶液,計(jì)數(shù)注射后15 min內(nèi)小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)及潛伏期[6]。

2.2 青風(fēng)藤?gòu)?fù)方顆粒的抗炎作用實(shí)驗(yàn)

50只ICR小鼠,隨機(jī)分為5組,分別為模型組、地塞米松陽(yáng)性對(duì)照組(0.1 g/次)及青風(fēng)藤?gòu)?fù)方顆粒給藥組,每組10只,測(cè)量小鼠右耳厚度記為0 h右耳厚度,測(cè)量位置為右耳正中部位,同一位點(diǎn)測(cè)量3次,取平均值;模型組小鼠灌胃0.5% CMC-Na混懸液,青風(fēng)藤?gòu)?fù)方顆粒組給予相應(yīng)的藥物溶液,給藥20 mL/kg,連續(xù)給藥5 d;地塞米松陽(yáng)性對(duì)照組小鼠右耳前、后兩面均勻涂布地塞米松軟膏0.1 g/次,間隔30 min重復(fù)1次,共涂布4次;末次給藥1 h后,吸取二甲苯20 μL均勻涂布于小鼠右耳前、后兩面,致炎后30 min使用游標(biāo)卡尺分別測(cè)量各組小鼠右耳厚度并記錄,并與其0 h右耳厚度進(jìn)行比較,計(jì)算腫脹度及腫脹抑制率,其表達(dá)式為

2.3 青風(fēng)藤?gòu)?fù)方顆粒的消腫作用實(shí)驗(yàn)

2.3.1 尿酸鈉(MSU)晶體的制備

稱(chēng)取尿酸鈉800 mg,加至濃度為1 mol/L的5 mL氫氧化鈉中,再加入無(wú)菌生理鹽水155 mL煮沸溶解,冷卻至室溫后,調(diào)節(jié)pH=7.2,600 r/min離心吸取上清,室溫靜置2 d使MSU晶體析出,離心棄上清得MSU晶體,臨用前使用生理鹽水配置成質(zhì)量濃度為50 mg/mL的混懸液[7]。

2.3.2 青風(fēng)藤?gòu)?fù)方顆粒的消腫作用研究

60只ICR小鼠,隨機(jī)分為6組,分別為空白對(duì)照組、模型組、秋水仙堿陽(yáng)性對(duì)照組(0.1 mg/kg)及青風(fēng)藤?gòu)?fù)方顆粒給藥組,每組10只,給藥方式與劑量同“2.1”項(xiàng),末次給藥1 h后,將0.02 mL MSU結(jié)晶混懸液(質(zhì)量濃度50 mg/mL)注射至小鼠右后脛附踝關(guān)節(jié)腔,空白對(duì)照組注射等量的0.9% NaCl溶液,采用足趾容積儀分別測(cè)量小鼠造模前和造模后3 h和6 h造模側(cè)足趾容積計(jì)算足趾腫脹度,并進(jìn)行炎癥評(píng)分(腫脹度=造模后足趾容積-造模前足趾容積)。

炎癥指數(shù)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為0分,正常;1分,關(guān)節(jié)皮膚紅斑,輕度腫脹,骨性標(biāo)志可見(jiàn);2分,關(guān)節(jié)明顯紅腫,骨性標(biāo)志消失,但腫脹局限于關(guān)節(jié)部位;3分,關(guān)節(jié)以外肢體腫脹[8]。

2.4 青風(fēng)藤?gòu)?fù)方顆粒的降尿酸作用實(shí)驗(yàn)

60只ICR小鼠,隨機(jī)分為6組,分別為空白對(duì)照組,模型組,苯溴馬隆陽(yáng)性對(duì)照組(0.02 g/kg)及青風(fēng)藤?gòu)?fù)方顆粒給藥組,每組10只,給藥方式與劑量同“2.1”項(xiàng),末次給藥30 min后,各組腹腔注射m(UA)∶m(HX)=1∶1的溶液(其中UA為造模劑尿酸,HX為次黃嘌呤),每10 g注射體積0.2 mL,空白對(duì)照組注射等量的0.9% NaCl溶液,注射造模劑45 min后,摘眼球取血0.5 mL,30 min后置低溫離心機(jī)中離心(500 r/min)分離血清,采用全自動(dòng)生化分析儀及原裝配套試劑測(cè)定血清尿酸濃度。

2.5 青風(fēng)藤?gòu)?fù)方顆粒的急性毒性實(shí)驗(yàn)

預(yù)實(shí)驗(yàn)以最大質(zhì)量濃度的青風(fēng)藤?gòu)?fù)方顆粒2.645 g/mL(以不堵塞灌胃針頭為標(biāo)準(zhǔn))和最大給藥40 mL/kg,對(duì)小鼠灌胃給藥,觀察14 d,小鼠無(wú)一死亡,無(wú)法測(cè)出半數(shù)致死量LD50和最大耐受量MTD,所以改做小鼠的最大給藥量MLD試驗(yàn)。

20只ICR小鼠,隨機(jī)分為正常組和青風(fēng)藤?gòu)?fù)方顆粒給藥組,每組10只。禁食不禁水12 h,青風(fēng)藤?gòu)?fù)方顆粒組小鼠灌胃藥物質(zhì)量濃度為2.645 g/mL的溶液,每次給藥40 mL/kg,正常組給予等體積、等次數(shù)的生理鹽水,1日內(nèi)給藥3次,給藥間隔6 h。給藥首日每次給藥后0,2,4,6 h連續(xù)觀察動(dòng)物活動(dòng)情況,并記錄動(dòng)物毒性反應(yīng)和死亡情況,后續(xù)連續(xù)進(jìn)行一般性觀察14 d,測(cè)定小鼠體重變化和攝食量;死亡動(dòng)物及觀察期結(jié)束后仍存活動(dòng)物進(jìn)行大體解剖,觀察主要臟器的改變,如發(fā)現(xiàn)肉眼可見(jiàn)病變進(jìn)行病理組織學(xué)檢查[9]。

2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 青風(fēng)藤?gòu)?fù)方顆粒對(duì)冰醋酸致小鼠疼痛模型作用的影響

表1 小鼠疼痛模型作用結(jié)果Table 1 Effect of pain model in rats

① 扭體次數(shù)與模型組比較,**p<0.01;② 潛伏期與模型組比較,##p<0.01。

3.2 青風(fēng)藤?gòu)?fù)方顆粒對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹急性炎癥模型作用的影響

表2 小鼠耳腫脹急性炎癥模型作用結(jié)果Table 2 Effects of acute inflammation model of ear swelling in rats

① 與模型組比較,**p<0.01,*p<0.05。

3.3 青風(fēng)藤?gòu)?fù)方顆粒對(duì)MSU結(jié)晶致小鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎腫脹模型作用的影響

表3 小鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎腫脹模型作用結(jié)果Table 3 Effect of rat acute gouty arthritis swelling model

① 足趾腫脹度與模型組比較,**p<0.01;② 踝關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)與模型組比較,##p<0.01,#p<0.05。

3.4 青風(fēng)藤?gòu)?fù)方顆粒對(duì)UA和HX致小鼠高尿酸模型作用的影響

表4 小鼠高尿酸模型作用結(jié)果Table 4 Effect of hyperuric acid model in rats

① 與空白組比較,##p<0.01;② 與模型組比較,**p<0.01。

3.5 青風(fēng)藤?gòu)?fù)方顆粒的急性毒性作用的影響

結(jié)果如表5,圖1,2所示。經(jīng)口灌胃給予青風(fēng)藤?gòu)?fù)方顆粒每日給藥合計(jì)317.4 g/kg,給藥當(dāng)日小鼠呼吸急促,豎毛,肌張力降低,皮膚水腫,大便呈深黑色;兩組小鼠行為活動(dòng)與自主活動(dòng)未見(jiàn)明顯異常,角膜、翻正和牽張反射存在,無(wú)流淚、無(wú)眼球突出,對(duì)外界反應(yīng)、外觀、行為、反射、眼瞼及腺體分泌等均未見(jiàn)異常,未觀察到明顯中毒癥狀;給藥后14 d觀察期間,各組外觀、行為、呼吸和腺體分泌等均未觀察到明顯異常癥狀,排便在第3 d恢復(fù)正常;與正常組相比,給藥組小鼠體重增長(zhǎng)及攝食量變化趨勢(shì)基本一致,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05);整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間未發(fā)生動(dòng)物死亡,觀察期結(jié)束后進(jìn)行大體解剖,主要臟器組織及胸腔、腹腔未檢出肉眼可見(jiàn)病變。由此可見(jiàn),青風(fēng)藤?gòu)?fù)方顆粒灌胃給藥的最大給藥質(zhì)量分?jǐn)?shù)為94.07%,相當(dāng)于推薦人臨床日用劑量的99倍。

表5 小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)觀察表Table 5 Observation table of acute toxicity in rat

圖1 青風(fēng)藤?gòu)?fù)方顆粒急毒試驗(yàn)對(duì)小鼠體重的影響Fig.1 Effect of acute toxicity test of Qingfengteng compound granules on ratbodyweight

圖2 青風(fēng)藤?gòu)?fù)方顆粒急毒試驗(yàn)對(duì)小鼠攝食量的影響Fig.2 Effect of acute toxicity test of Qingfengteng compound granules on food intake in rat

4 結(jié) 論

通過(guò)藥效實(shí)驗(yàn)和急性毒性試驗(yàn),對(duì)青風(fēng)藤?gòu)?fù)方顆粒的有效性和安全性進(jìn)行初步研究。藥效學(xué)結(jié)果表明:該制劑可顯著改善冰醋酸致扭體反應(yīng)情況,對(duì)二甲苯致炎癥及MSU結(jié)晶致腫脹有明顯抑制作用,對(duì)高尿酸模型小鼠表現(xiàn)出顯著的降尿酸作用;急性毒性試驗(yàn)方面,測(cè)得青風(fēng)藤?gòu)?fù)方顆粒的最大給藥質(zhì)量分?jǐn)?shù)為94.07%,相當(dāng)于推薦人臨床用量的99倍,說(shuō)明該藥毒性較小。綜上所述,該制劑有良好鎮(zhèn)痛、抗炎、消腫和降尿酸作用,可用于高尿酸血癥及痛風(fēng)的防治或治療,且急性毒性試驗(yàn)顯示該藥毒性低、安全性高,為其臨床應(yīng)用提供了有利的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。