趙 翔,鐘 浩,孫 超,湯利文,許 崗

(湖南福來(lái)格生物技術(shù)有限公司,湖南 長(zhǎng)沙 410100)

氧化還原酶雖然在催化制備手性化學(xué)物、藥物中間體領(lǐng)域應(yīng)用廣泛,但是此類催化反應(yīng)需要大量?jī)r(jià)格昂貴且穩(wěn)定性差的輔酶NAD(P)H協(xié)助才能進(jìn)行,從而推高了氧化還原酶的應(yīng)用成本,構(gòu)建低廉、高效的輔酶再生系統(tǒng)是解決此問(wèn)題的關(guān)鍵[1-3]。甲酸脫氫酶(FDH)耦聯(lián)的輔酶再生體系具有諸多優(yōu)勢(shì),如反應(yīng)不可逆,生成的副產(chǎn)物CO2易從反應(yīng)體系中釋放,甲酸或甲酸鹽價(jià)格低廉且對(duì)酶無(wú)抑制作用[4],因此在需要輔酶再生的反應(yīng)中,甲酸脫氫酶具有重要的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景[5]。通過(guò)基因工程技術(shù)構(gòu)建高產(chǎn)FDH的重組菌越來(lái)越受到青睞[6-7],但是對(duì)于NADP+依賴型的甲酸脫氫酶(PFDH)普遍存在表達(dá)水平低,蛋白可溶性不好,發(fā)酵成本高的問(wèn)題,不利于后期工業(yè)化應(yīng)用。

筆者以自行構(gòu)建好的表達(dá)PFDH的大腸桿菌為出發(fā)菌株,對(duì)其產(chǎn)酶培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行研究,優(yōu)化了各工藝參數(shù)并逐級(jí)放大,在發(fā)酵罐上獲得高水平的酶活表達(dá),為大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌 種

大腸桿菌BL21(DE3)/pET30-PFDH由本實(shí)驗(yàn)室自行構(gòu)建和保存。

1.2 培 養(yǎng) 基

種子培養(yǎng)基:10 g/L蛋白胨,5 g/L酵母提取物,10 g/L氯化鈉,pH為7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基:5 g/L酵母粉,10 g/L蛋白胨,12 g/L磷酸氫二鉀,3 g/L磷酸二氫鉀,4 g/L硫酸銨,1 g/L七水硫酸鎂,1 mL/L微量元素PTM1,10 g/L葡萄糖。

1.3 優(yōu)化方法

1.3.1 發(fā)酵罐控制工藝

活化種子按1%的接種量接種于發(fā)酵罐培養(yǎng)基中,初始pH為7.0,培養(yǎng)溫度37 ℃,空氣流量200 L/h,轉(zhuǎn)速200 r/min,罐壓0.015 MPa,溶氧串級(jí)轉(zhuǎn)速到800 r/min,提升空氣至400 L/h,壓力0.04 MPa。氨水控制pH,溶氧反彈補(bǔ)加70%的葡萄糖,使用DO-star補(bǔ)料方式,當(dāng)OD600達(dá)到要求,緩慢降溫誘導(dǎo),比生長(zhǎng)速率控制在0.1～0.2直至放罐。

1.3.2 發(fā)酵條件對(duì)PFDH表達(dá)的影響

接種培養(yǎng)后分別研究配方比例,誘導(dǎo)pH,誘導(dǎo)溫度,溶氧控制,誘導(dǎo)劑種類、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)劑濃度以及補(bǔ)料策略對(duì)PFDH表達(dá)的影響。以優(yōu)化的條件為基礎(chǔ),采用200 L發(fā)酵罐上進(jìn)行放大培養(yǎng),驗(yàn)證發(fā)酵工藝的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1 粗酶液抽提

精確移取0.5 mL發(fā)酵液于1.5 mL規(guī)格的離心管中(離心管中預(yù)先加入一定量的玻璃珠,以離心管高度2/3處為宜),在MS3振蕩器上振蕩20 min(振蕩器振蕩頻率設(shè)為1 500 r/min),將樣品連同玻璃珠一起倒入燒杯中,離心取清液作為粗酶液。

1.4.2 酶活性測(cè)定

在反應(yīng)體系中依次加入pH為7.5,0.2 mol/L的NH3-NH4Cl緩沖液3.2 mL和1 mol/L的甲酸銨溶液400 μL,再加入粗酶液100 μL,混合均勻后于波長(zhǎng)340 nm處校零。加入10 mmol/L的NADP+溶液300 μL,快速混合后開(kāi)始測(cè)定A340吸光值。根據(jù)NADPH的摩爾吸光系數(shù)計(jì)算單位時(shí)間濃度變化。PFDH活力定義為在一定反應(yīng)條件下,單位酶量每分鐘生成或消耗1 μmol的NADPH為一個(gè)單位,其計(jì)算公式為

式中:ΔA為每分鐘吸光度的變化值,即為斜率;S為NADPH的摩爾消光系數(shù),通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得;d為比色皿的光徑;Vt為反應(yīng)液的總體積,mL;Vs為樣品酶液的體積,mL;X為樣品酶液的稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與分析

大腸桿菌菌株構(gòu)建完成后,外源蛋白的表達(dá)量往往達(dá)不到工業(yè)化生產(chǎn)所要求的水平,因此需要對(duì)其發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化[8]。微生物發(fā)酵過(guò)程的機(jī)理復(fù)雜,特別是利用基因工程菌進(jìn)行高密度發(fā)酵,它的生長(zhǎng)和外源蛋白的表達(dá)水平受到微生物內(nèi)部代謝調(diào)控機(jī)制和外界環(huán)境(例如培養(yǎng)基組成與配比、發(fā)酵溫度和pH)等諸多因素的影響[9],本實(shí)驗(yàn)室從影響菌株產(chǎn)酶的多個(gè)因素進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化和整合。

2.1 培養(yǎng)基m(C)∶m(N)的影響

分批發(fā)酵一般使用的培養(yǎng)基為半合成培養(yǎng)基,培養(yǎng)基各組分的濃度和比例要合適,營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的比例不當(dāng)會(huì)影響菌體的代謝生長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)以TB培養(yǎng)基為基礎(chǔ),調(diào)整酵母浸粉和蛋白胨比例,設(shè)計(jì)出3種碳氮比例配方,如圖1所示。

圖1 m(C)∶m(N)對(duì)菌體生長(zhǎng)和PFDH表達(dá)的影響Fig.1 Effect of m(C)∶m(N) ratio on cell growth and PFDH production

酶活表現(xiàn)中,m(C)∶m(N)=2.9活力最佳,達(dá)到53.6 U/mL。m(C)∶m(N)=3.2增加葡萄糖的攝入,提高菌體的前期生長(zhǎng)速度,但活力相應(yīng)的被抑制。碳氮比需遵循合適的比例才不會(huì)抑制大腸的生長(zhǎng)和蛋白的表達(dá)。如碳源過(guò)多,特別是葡萄糖過(guò)量或者中間補(bǔ)糖過(guò)多,致使糖等物質(zhì)的氧化不完全,發(fā)酵液中有機(jī)酸會(huì)大量積累。m(C)∶m(N)=2.9是PFDH菌種最合適碳源和氮源的比例,既能滿足重組菌的生長(zhǎng)需求,又能得到很高的PFDH蛋白表達(dá)量。

2.2 誘導(dǎo)pH的優(yōu)化

pH值是微生物在一定環(huán)境條件下代謝活動(dòng)的綜合指標(biāo),是發(fā)酵過(guò)程中重要參數(shù),對(duì)微生物的生長(zhǎng)和目的產(chǎn)物的積累有很大的影響。發(fā)酵前期控制pH為7.0,誘導(dǎo)后pH分別控制為6.5,6.8,7.0,7.2,7.5,培養(yǎng)40 h,結(jié)果見(jiàn)圖2。最適宜的誘導(dǎo)表達(dá)pH為7.2,PFDH發(fā)酵活力達(dá)到52.7 U/mL。

圖2 誘導(dǎo)pH對(duì)菌體生長(zhǎng)和PFDH表達(dá)的影響Fig.2 Effect of pH on cell growth and PFDH production

2.3 誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化

誘導(dǎo)溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)速率、質(zhì)粒穩(wěn)定性和產(chǎn)物蛋白的溶解性都有重要影響,是重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)過(guò)程的關(guān)鍵因素。實(shí)驗(yàn)分別選取誘導(dǎo)培養(yǎng)溫度23,25,28,32,37 ℃共5個(gè)溫度梯度,結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 誘導(dǎo)溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)和PFDH表達(dá)的影響Fig.3 Effect of induced temperature on cell growth and PFDH production

在28 ℃誘導(dǎo)時(shí),放罐的菌體質(zhì)量濃度達(dá)到199.4 g/L,PFDH活力最佳為49.5 U/mL。發(fā)酵過(guò)程中不降溫維持37 ℃誘導(dǎo),PFDH表達(dá)明顯被抑制,酶活只有7.6 U/mL。溫度太高會(huì)造成大腸桿菌菌體的提早衰老,同時(shí)較高的溫度也會(huì)影響到酶蛋白的折疊速度,從而使PFDH表達(dá)不佳。

2.4 溶氧控制的優(yōu)化

溶解氧(DO)是耗氧微生物生長(zhǎng)所必需,監(jiān)控發(fā)酵液中的溶氧濃度的變化可以反映細(xì)胞的生理生長(zhǎng)狀況?？刂迫苎鮼?lái)調(diào)節(jié)菌體生長(zhǎng)代謝,是提高重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的重要手段。采取DO-star分批補(bǔ)料方式,溶氧反彈后通過(guò)調(diào)控補(bǔ)料控制DO的范圍,分別控制在10%～20%,30%～40%,50%～60%,70%～80%范圍。OD600達(dá)到30,降溫28 ℃加入12 g/L的乳糖,誘導(dǎo)培養(yǎng)40 h,結(jié)果見(jiàn)圖4。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)最適宜的溶氧范圍為50%～60%,放罐酶活最高。對(duì)于重組PFDH菌,適宜的控制DO范圍,對(duì)酶蛋白表達(dá)的影響很大。溶氧過(guò)低,補(bǔ)料葡萄糖添加增多,副產(chǎn)物乙酸代謝增加,影響到大腸菌體自身生長(zhǎng),基本上不表達(dá)目的蛋白。

圖4 溶氧對(duì)菌體生長(zhǎng)和PFDH表達(dá)的影響Fig.4 Effect of dissolved oxygen on cell growth and PFDH production

2.5 誘導(dǎo)劑種類影響

誘導(dǎo)劑的選擇往往會(huì)影響到外源蛋白的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)分別選用0.3 mmol/L的IPTG,1.2%的半乳糖和1.2%的乳糖進(jìn)行對(duì)比,在分批補(bǔ)料的控制下誘導(dǎo)培養(yǎng)40 h檢測(cè)酶活,結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 誘導(dǎo)劑種類對(duì)菌體生長(zhǎng)和PFDH表達(dá)的影響Fig.5 Effect of inducer species on cell growth and PFDH production

乳糖誘導(dǎo)活力高達(dá)54.5 U/mL,優(yōu)于IPTG和半乳糖的誘導(dǎo)結(jié)果。另外乳糖相較于IPTG和半乳糖,滅菌處理更簡(jiǎn)單,價(jià)格更便宜,更適合工業(yè)化應(yīng)用。

2.6 誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的影響

實(shí)驗(yàn)選擇OD600分別在20,25,30,35,40加入1.2%乳糖誘導(dǎo),誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間均為40 h,PFDH表達(dá)結(jié)果見(jiàn)圖6。結(jié)果顯示對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中前期OD600=30進(jìn)行誘導(dǎo)可獲得最高的產(chǎn)酶量為56.9 U/mL,此時(shí)大腸桿菌的菌體生長(zhǎng)很快。誘導(dǎo)時(shí)機(jī)偏晚(OD600=40),將誘導(dǎo)時(shí)機(jī)延遲至穩(wěn)定期,會(huì)降低重組酶產(chǎn)量,這可能是由于誘導(dǎo)表達(dá)前,營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)已經(jīng)被大量消耗,相對(duì)地降低了用于合成PFDH的基質(zhì)比例;相反,誘導(dǎo)時(shí)機(jī)過(guò)早(OD600=20),較低的溫度會(huì)造成前期菌體質(zhì)量濃度過(guò)低而降低重組酶的產(chǎn)量。因此最適宜的誘導(dǎo)時(shí)機(jī)為OD600=30,此時(shí)表達(dá)的酶活力最高。

圖6 誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對(duì)菌體生長(zhǎng)和PFDH表達(dá)的影響Fig.6 Effect of induction timing on cell growth and PFDH production

2.7 200 L中試發(fā)酵罐驗(yàn)證

發(fā)酵條件優(yōu)化完成后需經(jīng)得起放大驗(yàn)證,不然難以形成工藝推廣[10-11]。以前面優(yōu)化條件為基礎(chǔ),采取200 L發(fā)酵罐進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),共重復(fù)6個(gè)批次見(jiàn)圖7。

圖7 優(yōu)化工藝的放大和批次驗(yàn)證Fig.7 Results of scale-up and proven experiment under the optimal condition

6批次平行發(fā)酵驗(yàn)證,優(yōu)化工藝下菌體生長(zhǎng)和蛋白表達(dá)均穩(wěn)定,結(jié)果偏差小,放罐時(shí)的平均菌體質(zhì)量濃度和平均酶活達(dá)到201.1 g/L和52.3 U/mL。優(yōu)化后的高密度發(fā)酵條件對(duì)提高重組菌中PFDH的表達(dá)有很高的重復(fù)性,適宜于大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化推廣。

3 結(jié) 論

甲酸脫氫酶在輔酶再生系統(tǒng)中起著關(guān)鍵的作用,由于其價(jià)格昂貴,大大限制了在工業(yè)化中的應(yīng)用。筆者利用5 L發(fā)酵罐對(duì)重組PFDH大腸桿菌進(jìn)行系統(tǒng)的高密度發(fā)酵優(yōu)化,先后考察了培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件和誘導(dǎo)條件等關(guān)鍵因素,確定了最優(yōu)發(fā)酵工藝:基礎(chǔ)培養(yǎng)基m(C)∶m(N)=2.9,DO-star反饋補(bǔ)料,OD600達(dá)到30降溫至28 ℃,1.2%乳糖誘導(dǎo),PFDH酶活力可以達(dá)到56.9 U/mL,相對(duì)于優(yōu)化前的38.5 U/mL,提高了47.8%。在此基礎(chǔ)上利用200 L罐進(jìn)行多批次擴(kuò)大培養(yǎng),證實(shí)該高密度發(fā)酵工藝重復(fù)性好,具有較高的工業(yè)化應(yīng)用價(jià)值。